王小彬，種雪薇，劉 崗，耿煜然，劉富坤，于曉艷*

(1.山東農業(yè)大學林學院，山東 泰安271018；2.山東瀚林苑生態(tài)科技有限公司，山東 威海264500；3.泰安市城市管理局園林綠化處，山東 泰安271018；4.乳山市夏村鎮(zhèn)農業(yè)綜合服務中心，山東 威海264500)

冬青屬（Ilex）常綠樹種資源豐富，葉片四季常綠，樹型多姿優(yōu)美，果實艷麗光亮、經冬不落，觀賞價值極高，具有廣闊的開發(fā)應用前景。目前，國外培育出的常綠冬青品種已達1000 余個，以綠籬、行道樹、景觀樹、模紋花壇、花境等多種方式廣泛應用于道路、公園、庭院等園林綠地中[1]。但我國的常綠冬青引種栽培工作仍處于剛起步階段，且引種栽培地主要集中于江蘇及江蘇以南地區(qū)。冬季低溫是限制其繼續(xù)“北引”的關鍵因子。所以，建立科學的抗寒評價體系，從眾多的常綠冬青里篩選出可在北方高寒地區(qū)栽培的種或品種，對改善我國北方冬季園林景觀蕭條現(xiàn)狀具有重要意義。

近年來，常綠冬青的抗寒性評價引起了很多研究者的關注。曾雯等[2]、張紀林等[3]、崔鶯文等[4]、柴弋霞等[5]和胡曼筠等[6]已通過測定人工低溫處理的離體葉片生理生化指標的方法對國內外20 余種常綠冬青的抗寒性進行了初步研究。但通過該方法只能得出供試冬青的相對抗寒性強弱順序，無法確定其田間實際抗寒表現(xiàn)。而且植物抗寒性由多個因素共同控制，生理生化指標也易受環(huán)境和樣本影響而發(fā)生變化[7-8]。所以，要想更準確地評價常綠冬青的抗寒性，還需要結合其它指標進行更全面的評價，并與田間實際抗寒表現(xiàn)進行對比驗證。

植物葉片對低溫脅迫極其敏感，可以通過改變組織結構來適應低溫環(huán)境。而且葉片組織結構是生態(tài)環(huán)境和遺傳基因共同影響的結果，具有一定生態(tài)適應性和穩(wěn)定性，因此可將其作為植物抗寒性評價的重要指標[9]。前人已經就葉片組織結構與抗寒性的關系開展了大量研究，發(fā)現(xiàn)柵海比、葉片組織緊密度等葉片組織結構指標與植物抗寒性有極大相關性，但抗寒性評價的代表性指標因植物種類不同而有較大差異[10-13]。到目前為止，尚未見常綠冬青葉片組織結構與抗寒性關系的報道。

本研究以6 種常綠冬青為試材，調查其在山東泰安的田間凍害表現(xiàn)，并采用石蠟切片技術觀測11 項葉片組織結構指標。以篩選出的葉片解剖結構代表性指標作為抗寒性評價指標，應用隸屬函數(shù)法和聚類分析法對6 種冬青的抗寒性進行評價和分類，并將抗寒性順序和分類結果與田間凍害調查結果進行對比。本研究從解剖結構特點和田間凍害表現(xiàn)兩個層面對6 種常綠冬青開展抗寒性評價，可為常綠冬青屬植物抗寒性綜合評價及向北方高寒地區(qū)引種應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2019年4月初從南京引進的6 種常綠冬青：‘陽光’ 狹冠冬青 （Ilex × attenuata ‘Sunny Foster’）、‘米葉’冬青（Ilex crenata ‘Mariesii’）、‘史蒂芬’冬青（Ilex× ‘Nellie R.stevens’）、‘中國少女’冬青（Ilex sp.‘China Girl’）、‘博福德’冬青（Ilex corunta ‘burfordir’）、‘藍少女’冬青（Ilex merserae ‘Blue Girl’）。上述材料均為3年生扦插苗，每種60 株，定植于山東省泰安市岱岳區(qū)范鎮(zhèn)苗木基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間凍害調查

2020年12月—2021年4月，泰安地區(qū)最低氣溫為-18℃。2021年3月中旬，調查6 種冬青自然越冬后的葉片形態(tài)變化情況，并采用下列標準進行凍害分級：1 級（抗寒性強）為冬季基本不受凍，僅葉片顏色稍變深，或少于20%的葉片受凍褐化，冬季觀賞價值與其他季節(jié)差異不大；2 級（抗寒性中等）為20%-50%葉片受凍褐化，冬季觀賞價值與其他季節(jié)相比明顯降低；3 級（抗寒性差）為50%以上葉片受凍褐化，冬季基本失去觀賞價值。每種冬青隨機選擇10 株長勢一致的植株，每株調查100 個葉片，計算受凍葉片百分數(shù)，并拍照記錄越冬后受害情況。

1.2.3 葉片組織結構觀測

2020年12月中旬，摘取6 種冬青無病害、長勢良好且相對一致的一年生枝條上倒數(shù)第2—4 個葉片，每種6 片，F(xiàn)AA 固定液中固定48 h 后貯藏于70%酒精中備用。常規(guī)石蠟切片法制片，切片厚度5—8 μm，番紅-固綠染色，用Olympus BX51 顯微鏡檢片，并拍照。每種冬青觀察10 張切片，每張切片觀察3 個葉片橫切面視野和3 個主脈橫切面視野。用Digimizer 4.5.1 軟件測量葉片及其上下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度，以及主脈木質部和維管束面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2010 軟件和SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理、相關性分析、差異顯著性檢驗和聚類分析；運用隸屬函數(shù)法計算6 種冬青抗寒性隸屬函數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 田間凍害表現(xiàn)

由表1 和圖1 可知，自然越冬后6 種冬青均有不同程度的凍害表現(xiàn)。其中，‘史蒂芬’冬青和‘中國少女’冬青沒有明顯凍害，只有4.9%和5.3%的葉片局部失綠變?yōu)楹稚?，絕大多數(shù)葉片完好無損，冬季觀賞價值與其他季節(jié)差異不大，凍害級別為1 級，抗寒性強；‘博福德’冬青和‘陽光’ 狹冠冬青有明顯凍害，30.4%和36.8%的葉片全部或局部失綠變?yōu)楹稚?，冬季觀賞價值與其他季節(jié)相比顯著降低，凍害級別為2 級，抗寒性中等；‘藍少女’冬青凍害嚴重，72.5%的葉片全部失綠變?yōu)楹稚兹~’冬青凍害更嚴重，86.3%的葉片全部失綠變?yōu)辄S色并干枯，冬季基本失去觀賞價值，凍害級別為3 級，抗寒性差。

圖1 6 種冬青的田間凍害表現(xiàn)Figure 1 Freezing damage responsein the field of six Ilex varieties

表1 越冬后6 種冬青的凍害級別Table 1 Freezing damage grades of six Ilex varieties after winter

2.2 葉片組織結構比較

2.2.1 葉片厚度

由表2 和圖2 可知，6 種冬青的葉片厚度為111.44～332.56 μm，差異較大。其中‘史蒂芬’冬青最厚，‘米葉’冬青最薄，兩者相差1.99 倍。

2.2.2 表皮特征

由圖2 可以看出，6 種冬青葉片表皮均由單層細胞構成，外覆角質層，上下表皮細胞均為不規(guī)則的扁長方形，排列緊密。由表3 可知，6種冬青的上表皮厚度和下表皮厚度差異均極顯著。其中，上表皮厚度為13.34～32.90 μm，‘陽光’狹冠冬青最厚，‘米葉’冬青最??；下表皮厚度為7.55～22.67 μm，‘史蒂芬’ 冬青最厚，‘米葉’冬青最薄。

2.2.3 葉肉組織結構特征

由圖2 可知，6 種冬青葉片的柵欄組織細胞為3～5 層。其中，第1～3 層細胞排列緊密，第4～5 層細胞排列相對疏松，與海綿組織區(qū)分不明顯。由表2 可知，6 種冬青的6 種葉肉組織結構指標均存在極顯著差異： 柵欄組織厚度為22.45 ～86.72 μm，‘史蒂芬’ 冬青最大，‘米葉’冬青最??；海綿組織厚度為70.98 ～210.97 μm，‘中國少女’冬青最大，‘米葉’冬青最?。粬藕１葹?.22 ～0.42，‘史蒂芬’冬青最大，‘陽光’狹冠冬青最??；組織結構緊密度為0.15 ～0.26，‘史蒂芬’冬青最大，‘陽光’狹冠冬青最?。唤M織結構疏松度為0.52 ～0.84，‘米葉’冬青最大，‘史蒂芬’冬青最小。

圖2 種冬青的葉片橫切面Figure 2 Leaf transverse sections of six Ilex varieties

2.2.4 主脈維管束結構特征

由圖3 可知，6 種冬青的主脈均屬外韌維管束，韌皮部均有大量晶細胞。由表2 可知，6 種冬青的葉片主脈木質部面積和主脈維管束面積均存在極顯著差異： 主脈木質部面積和主脈維管束面積分別為3368.69 ～20732.52 μm2和5663.57～45493.51 μm2，‘史蒂芬’冬青最大，‘藍少女’冬青最??；木維比為0.41 ～0.61，‘米葉’冬青最大，‘中國少女’冬青最小。

圖3 6 種冬青的葉片主脈橫切面Figure 3 Leaf midrib transverse sections of six Ilex varieties

表2 6 種冬青葉片解剖結構指標Table 2 Anatomical structure indexes of six Ilex varieties

2.4 6 種冬青的抗寒性綜合評價

由圖4 可知，11 項葉片解剖結構指標可分為3 類：葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度、主脈木質部面積、主脈維管束面積、下表皮厚度和上表皮厚度為第1 類；柵海比和組織結構緊密度為第2 類；組織結構疏松度和木維比為第3 類。

圖4 11 項葉片結構指標的變量聚類分析Figure 4 Variable cluster analysis of 11 leaf structure indexes

由表2、表3 和表4 可知：第1 類中，葉片厚度的相關指數(shù)最大，可作為該類的代表性指標；第2 類中，柵海比和組織結構緊密度的相關指數(shù)相等，但前者變異系數(shù)較大（34.84%），故選擇柵海比作為該類的代表性指標；第3 類中，組織結構疏松度和木維比的相關指數(shù)相等，但前者變異系數(shù)較大（18.34%），故選擇組織結構疏松度作為該類的代表性指標。

表3 葉片結構指標的相關系數(shù)Table 3 Correlation coefficient of leaf structure indexes

表4 各類中指標相關指數(shù)及排序Table 4 Correlative indexes and order of parameters

將篩選出的3 項葉片抗寒性解剖結構指標（葉片厚度、柵海比、組織結構疏松度）作為抗寒性評價指標，應用隸屬函數(shù)法對6 種冬青的抗寒性進行評價。根據(jù)平均隸屬度大小（表5），6 種冬青的抗寒性強弱依次為：‘史蒂芬’ 冬青＞‘中國少女’ 冬青＞‘博福德’ 冬青＞‘陽光’ 狹冠冬青＞‘藍少女’冬青＞‘米葉’冬青。

表5 6 種冬青的抗寒性綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation on cold resistance of six Ilex varieties

對6 種冬青的抗寒平均隸屬函數(shù)值進行聚類分析（圖5），可將6 種冬青分為3類：‘史蒂芬’冬青和‘中國少女’冬青為第1 類，抗寒性強；‘博福德’冬青和‘陽光’狹冠冬青為第2 類，抗寒性中等；‘藍少女’冬青和‘米葉’冬青為第3 類，抗寒性弱。這與田間凍害調查分類結果一致。

圖5 6 種冬青的抗寒性聚類分析Figure 5 Cluster analysis on cold resistance of six Ilex varieties

3 討論

抗寒性是植物長期適應寒冷環(huán)境而形成的一種遺傳特性，取決于植物的外部形態(tài)特征、解剖結構特性、生理生化特點和外界環(huán)境條件等。葉片組織結構是生態(tài)環(huán)境和遺傳基因共同影響的結果，具有一定生態(tài)適應性和穩(wěn)定性，因此越來越多的研究者將其作為植物抗寒性評價的重要指標。但植物種類不同，抗寒性評價代表性指標有較大差異。因此，先采用科學的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法從多項葉片結構指標中篩選出代表性評價指標，是科學評價植物抗寒性的重要前提[10-12]。

本研究采用變異系數(shù)、相關分析和聚類分析從11 項葉片結構指標中篩選出了葉片厚度、柵海比和組織結構疏松度作為評價6 種冬青抗寒性的代表性指標，結果發(fā)現(xiàn)：柵海比越大，組織結構疏松度越小，冬青抗寒性越強，這與翅莢木[14]、柿[15]、樟樹[16]、含笑[10]、重樓[12]等植物的研究結果一致；葉片厚度越大，冬青抗寒性越強，這與核桃[17]、早實核桃[18]、桃[11]等植物的研究結果一致。但有的研究者認為，與柵海比和組織結構疏松度等復合結構指標相比，葉片總厚度和柵欄組織厚度等單一結構指標易受樣本或環(huán)境影響而改變，并不能準確體現(xiàn)樣本間的抗寒遺傳差異[19]。所以，葉片厚度能否作為代表性指標用于其他常綠冬青的抗寒性評價還需擴大樣本進一步研究。

另外，譚殷殷等[20]和高馳等[12]發(fā)現(xiàn)，測定葉片組織結構指標時的取材時期不同，篩選出的抗寒性評價代表性指標也不同，導致同一植物在不同時期的抗寒性排序結果差異較大。目前尚未有常綠冬青葉片組織結構與抗寒性關系的其它報道。本研究篩選指標時雖已進入越冬期，但僅限于12月份，且僅涉及到6 種常綠冬青。所以，要想篩選出更具代表性的常綠冬青抗寒性評價代表性指標，還應增加1月份和2月份的越冬期數(shù)據(jù)，并進一步加大樣本數(shù)量。

植物抗寒性強弱并不單取決于某一類或某一個指標，而是葉片組織結構中多類指標、多個指標交互作用的結果。所以，本研究將篩選出的葉片厚度、柵海比和組織結構疏松度3 個代表性葉片組織結構指標結合起來作為抗寒性評價指標，應用隸屬函數(shù)法和聚類分析法對6 種冬青的抗寒性進行評價并分類，得出的抗寒性順序結果和分類結果與田間凍害調查得出的結果一致。這說明，將葉片厚度、柵海比和組織結構疏松度作為代表性葉片組織結構指標來評價6 種冬青的抗寒性具有較高可靠性。