鄒偉 賴純米* 樊海青 羅春梅

（1、昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南昆明 650500 2、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南昆明 650000）

食品安全一直是人們所關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題，關(guān)系著廣大人民群眾的身體健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會和諧穩(wěn)定。餌塊是云南民間常制食物，食前可切為塊、絲或片狀，烹食方法多樣，風(fēng)味各異[1]。餌塊一般由大米、玉米或糯米加工制成，在運輸和儲存過程中，受到溫度、濕度、空氣等因素的影響，很容易被霉菌侵染。在我國食物被黃曲霉毒素感染狀況較為嚴(yán)重，食用霉變后的糧食可引起急性或慢性中毒，長期食用甚至能引起癌癥[2]。適宜的含水量、溫度和充足的氧氣都會影響霉菌生長和霉菌毒素產(chǎn)生[3,4]。餌塊是云南特產(chǎn)具有地方區(qū)域性[5]，在我國其他省份和國外對餌塊生長的霉菌的研究較少，此外餌塊儲存環(huán)境多樣，不同環(huán)境儲存餌塊污染程度有待研究。檢測真菌的方法有很多，傳統(tǒng)的方法是觀察菌落生長情況和菌體結(jié)構(gòu)并參照菌落標(biāo)準(zhǔn)圖譜從而鑒定鑒定出霉菌的屬、群、系或種。其次是分子生物學(xué)手段，提取分離菌株的DNA，擴增其ITS 區(qū)并在NCBI 網(wǎng)站中進(jìn)行Blast 從而對菌株進(jìn)行物種鑒定[6-8]。本文在常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱中儲存餌塊，多個時間點統(tǒng)計污染餌塊真菌菌落總數(shù)，提取分離真菌的DNA，擴增ITS 區(qū)測序并在NCBI 中比對，對真菌的種類進(jìn)行鑒定。

1 材料和方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

YPD 培養(yǎng)基（溶解10 g 酵母膏，20 g 蛋白胨于900 mL 水中，高壓115℃，15min 滅菌后加入100 mL 20%過濾除菌的葡萄糖），DNA 提取試Taq 酶（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 樣品采集

從昆明市市呈貢區(qū)超市內(nèi)隨機采集均一一致的餌塊樣本3份，樣品購買后裝入無菌塑料包裝袋中，4℃保存于冰箱中，當(dāng)天進(jìn)行切塊培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離培養(yǎng)

超凈工作臺中將餌塊等體積切割后（25 cm2），分別置于常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱中，48、72、96、120 h 分別計數(shù)菌落總數(shù)，120 h 后挑取菌體YPD 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行純化，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA 提取、PCR 擴增

純化后，接種菌體于YPD 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，離心取沉淀后，利用真菌基因組DNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序提取總DNA，通用引物ITS1/ITS4 對 ITS 區(qū)進(jìn)行擴增。 其中 ITS1 序列為TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4 為TCCTCCGCTTATTGATATG C。PCR 反應(yīng)體積50 μL，包括2×Tag PCR Master Mix 25 μL，ITS1/ITS4 引物各2 μL，DNA 模板2 μL，其余體積以ddH2O 補充。序列擴增依照95℃ 5 min、95℃ 30 s、55℃1 min、72℃30 s，35 個循環(huán)，72℃10 min，4℃保存進(jìn)行，PCR 結(jié)束后進(jìn)行核酸電泳檢測，將合格樣品送出測序。

1.4 真菌的ITS 分子鑒定

PCR 產(chǎn)物生工生物工程(上海)股份有限公司測序，獲得菌株完整的ITS 序列后，在NCBI 官網(wǎng)中，用Blast 程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱中儲存餌塊菌落總數(shù)測定

日常生活中，餌塊主要儲存于干燥環(huán)境、潮濕環(huán)境、4℃冰箱中。為檢測餌塊在不同環(huán)境中的儲存情況，分別模擬了常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱三種不同環(huán)境。將分割均勻的25 cm2餌塊分別放置于三個區(qū)域，以4℃無菌袋餌塊為對照，統(tǒng)計菌落總數(shù)。與對照組0 CFU/25cm2相比，48 h 常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱菌落總數(shù)分別為0、1.33（P<0.05）和0 CFU/25 cm2（表1）；72 h 常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱菌落總數(shù)分別為3.47、6.33 和1.67 CFU/25 cm2（P<0.05）（表1）；96 h 常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱菌落總數(shù)分別為4.67、7.33 和3.33 CFU/25 cm2（P<0.05）（表1）。72 h 后常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱均被真菌污染，4℃冰箱處于低溫環(huán)境，抑制真菌生長，污染程度最小。

表1 不同儲存環(huán)境中餌塊生長菌落總數(shù)報告（n=3, ±s），*表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表1 不同儲存環(huán)境中餌塊生長菌落總數(shù)報告（n=3, ±s），*表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義

儲存環(huán)境 48 h(CFU/25cm?) 72 h(CFU/25cm?) 96 h(CFU/25cm?) 120 h(CFU/25cm?)4℃無菌袋 0 0 0 1.33±0.47常溫干燥區(qū) 0 3.67±0.47 * 4.67±0.47* 4.67±0.47*常溫潮濕區(qū) 1.33±0.47* 6.33±1.25* 7.33±0.94* 9.67±1.24*4℃冰箱 0 1.67±0.47 * 3.33±0.47* 3.33±0.47*

120 h 后，4℃無菌袋中儲存餌塊也被真菌污染，與4℃無菌袋中儲存餌塊1.33 CFU/25 cm2相比，常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱菌落總數(shù)分別為4.67、9.67 和3.33 CFU/25 cm2（P<0.05）（表1、圖1）。常溫潮濕區(qū)儲存餌塊濕潤度和柔軟度最好，但最易被真菌污染。120h 后，4℃無菌袋中餌塊也被真菌污染，推測其原因可能是樣品采集時餌塊表面已被微生物污染。

圖1 4℃無菌袋、常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱儲存120 h 后餌塊污染真菌情況*表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*號越多差異越大

2.2 餌塊表面污染真菌分離與鑒定

120 h 后，挑取常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱中菌落劃線接種于YPD 平板，共分離得到23 株真菌。提取DNA 擴增得到18S rDNA 的ITS 序列，大小約為500 bp（圖2），對分離到的真菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，23 株均分屬于2 個屬，酵母菌屬Saccharomyces 和青霉菌屬 Penicillium，4 個種，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、異常畢赤酵母Pichia anomala、粘紅酵母Rhodotorula mucilaginosa、青霉菌Penicillium crustosum。其中青霉菌10 株，占43.5%（表2），粘紅酵母8 株，占34.8%（表2），釀酒酵母4 株，占17.4%（表2），異常畢赤酵母1 株，占4.3%（表2）。表明，本研究中，青霉菌和粘紅酵母是污染餌塊的主要真菌。

圖2 23 株真菌18S rDNA 的ITS 序列擴增結(jié)果注：M 為500 bp Marker，18S rDNA 的ITS 序列大小為500 bp 左右

2.3 不同儲存環(huán)境餌塊表面污染真菌比較

比較常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱餌塊表面污染真菌差異發(fā)現(xiàn)，常溫干燥區(qū)青霉菌污染最嚴(yán)重，占21.7%%（表2）。常溫潮濕區(qū)粘紅酵母最多，其次是釀酒酵母，分別占21.7%和17.4%（表2）。4℃冰箱粘紅酵母最多，其次是青霉菌，分別占13%和8.7%（表2）。此外，在三種環(huán)境中均檢測到青霉菌，而潮濕環(huán)境中檢測到酵母菌。表明酵母菌生長需要充足水分，在干燥區(qū)域不宜生長，因此干燥區(qū)儲存餌塊不宜受酵母菌污染。

表2 不同儲存環(huán)境中餌塊污染真菌鑒定結(jié)果

3 討論與展望

餌塊，是云南省的一種特產(chǎn)食物，深受廣大云南人民的喜愛，其烹飪方法以蒸、煮、炒、烤等常見。但是餌塊不易保存，暴露于空氣中非常容易發(fā)霉。霉菌在糧食中的活動不僅影響糧食的食用及加工工藝品質(zhì)，產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物嚴(yán)重影響糧食及其加工產(chǎn)品的食用安全性。本研究在常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱中對餌塊進(jìn)行儲存，發(fā)現(xiàn)72 h 后常溫干燥區(qū)、常溫潮濕區(qū)和4℃冰箱餌塊均被真菌污染，其中4℃冰箱處于低溫環(huán)境，抑制真菌生長，污染程度最小。對分離到的23 株真菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)分屬于2 個屬，酵母菌屬Saccharomyces 和青霉菌屬Penicillium，4 個種，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、異常畢赤酵母Pichia anomala、粘紅酵母Rhodotorula mucilaginosa、青霉菌Penicillium crustosum。青霉菌和粘紅酵母是污染餌塊的主要真菌，在三種環(huán)境中均檢測到青霉菌，酵母菌在潮濕儲存環(huán)境中生長，干燥環(huán)境容易受青霉菌污染。釀酒酵母是乙醇生產(chǎn)的最常用的發(fā)酵菌株，一般情況無毒[9]，異常畢赤酵母耐受力強，多運用于酒精發(fā)酵[10]。粘紅酵母能氧化烷烴，為較好的產(chǎn)脂肪菌種，在食品、醫(yī)藥工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用[11]，青霉菌常見于腐爛的水果、蔬菜、肉食及衣履上，常造成食品污染。雖然本研究檢測到了四種真菌，但實驗有一定局限性，餌塊營養(yǎng)物質(zhì)豐富在適宜的溫度、濕度條件下，適合真菌生長，真菌生長情況和儲存環(huán)境密切相關(guān)。