張 周，伍小瓊，邱榮元，楊澤若，李熙微，毛楊明，余飛躍

（1.湖南師范大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院，岳陽 414000；2.北京大學(xué)前沿交叉研究院定量生物學(xué)中心，北京 100871）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中位居第三位［1］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受腫瘤細胞遺傳性狀、炎癥指標和免疫微環(huán)境影響［2］，CRC 中主要存在三種遺傳不穩(wěn)定性，包括染色體不穩(wěn)定性、CPG 島甲基化及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）［3］。近年來的研究表明，MSI 狀態(tài)作為腫瘤遺傳不穩(wěn)定的敏感指標，其檢測對于腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷、化療敏感性判斷以及高危人群的判定等具有重要意義。然而，MSI 狀態(tài)與CRC 臨床病理特征、免疫微環(huán)境及預(yù)后的系統(tǒng)性分析尚未見報道。本研究系統(tǒng)性地分析了MSI 狀態(tài)與CRC 臨床病理特征、免疫微環(huán)境及預(yù)后的關(guān)系，試圖推測MSI 檢測可以為評估CRC 患者的預(yù)后以及制定個體化臨床治療方案提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019 年12 月～2021 年8 月在湖南師范大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院以及湖南省人民醫(yī)院行CRC手術(shù)患者的臨床資料，共計316 例。納入標準：①首次進行CRC 手術(shù)，且術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌；②術(shù)后病理皆通過免疫組織化學(xué)法獲取MMR 蛋白相關(guān)信息。排除標準：①既往有腫瘤病史；②合并其他惡性腫瘤；③手術(shù)前接受過新輔助放、化療；④臨床資料缺失。

1.2 免疫組化檢測 研究4 種MMR 蛋白的表達，包括MHL1、MSH2、MSH6 和PMS2。陰性蛋白表達被定義為在存在陽性標記的內(nèi)部非腫瘤細胞的情況下，腫瘤細胞內(nèi)完全沒有核染色。局部染色定義為<5% 的腫瘤細胞中存在染色。對任何MMR 蛋白顯示陰性染色的CRC 被解釋為錯配蛋白缺失（defective mismatch repair，dMMR），對于4 個MMR 蛋白均陽性表達的CRC 被稱為MMR 功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）。dMMR 提示高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability high，MSI-H），pMMR 提示低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite stability low，MSI-L）或微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）。

1.3 數(shù)據(jù)庫材料與方法 GEO 數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌MSI 數(shù)據(jù)的分組標準 使用R 語言GEOquery 包（Version 2.52.0）從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載數(shù)據(jù)集GSE24551，該數(shù)據(jù)集包括147 例結(jié)直腸癌患者的轉(zhuǎn)錄組表達譜、臨床病理資料以及MSI 檢測結(jié)果。通過熒光PCR 和毛細管電泳的方法對微衛(wèi)星位點進行擴增，比對正常組織與癌癥組織中每個位點片段大小的變化來確定微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，所有陽性結(jié)果均進一步采用PCR 法重復(fù)檢測確認。依據(jù)以下標準對結(jié)直腸癌微衛(wèi)星狀態(tài)進行分組：無微衛(wèi)星位點變異為MSS；至少有一個微衛(wèi)星位點變異并且<30%微衛(wèi)星位點變異為MSI-L；>30%微衛(wèi)星位點變異或者BAT25 與BAT26 位點均變異則為MSI-H。依據(jù)上述標準將 GEO 數(shù)據(jù)庫下載的結(jié)直腸癌病例分為MSS/MSI-L 與MSI-H 兩組，對結(jié)直腸癌患者臨床病理資料、預(yù)后以及轉(zhuǎn)錄組表達/免疫浸潤差異進行生物信息學(xué)分析。

生存分析 運用survival 包（version 2.441-1.1）以及survminer（version 0.4.6）對GSE24551 數(shù)據(jù)集進行生存分析，采用Kaplan-Meier 法以及Log-Rank 檢驗生存曲線是否存在差異。P 值<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理與差異分析 運用R 語言limma 包（version 3.40.6）對芯片數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。當多個探針對應(yīng)到一個基因名時，取多個探針的表達中間值合并數(shù)據(jù)。利用limma 包進行差異分析，絕對值logFC>1 且P 校正值<0.05 為差異基因篩選閾值，并通過威爾科克森符號秩檢驗（Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test，wilcox test）計算基因在兩組之間的表達差異，P 值<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

免疫細胞腫瘤浸潤豐度分析 運用CIBERSOFT.R（2015）的反卷積算法對芯片表達譜數(shù)據(jù)進行去卷積，估計各種免疫細胞的浸潤豐度，并通過wilcox test 計算免疫細胞浸潤豐度在兩組之間的表達差異，P 值<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗，P<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織MSI 與臨床病理特征的相關(guān)性在316 例結(jié)直腸癌樣本的免疫組化結(jié)果顯示，MSI-H組與MSS/MSI-L 組CRC 病人在年齡、性別、大體分型、分化程度、T 分期、N 分期、M 分期、TNM 分期、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）與糖類抗原199（carbohydrate antigen199，CA199）表達上的差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。MSI-H 組在右半結(jié)腸癌、腫瘤直徑≥5cm、含有黏液方面所占比例顯著高于MSS/MSI-L 組，結(jié)果見表1。

表1 316例結(jié)直腸癌患者MSI與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 MSI 與預(yù)后關(guān)系 對GEO 數(shù)據(jù)庫中獲取的147例結(jié)直腸癌的MSI 狀態(tài)進行Kaplan-Meier 分析，結(jié)果顯示MSS/MSI-L 組結(jié)直腸癌患者無病生存期（disease free survival，DFS）中位數(shù)為3.535 年，MSI-H 組結(jié)直腸癌患者無病生存期中位數(shù)為4.47 年，MSI-H 組別DFS較MSS/MSI-L 組別顯著延長，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（LogRank 法 χ2=6.6，P= 0.01）（圖1）。

圖1 MSI狀態(tài)與CRC患者預(yù)后的生存曲線（數(shù)據(jù)來源于GEO）

2.3 MSI 狀態(tài)與結(jié)直腸癌組織中免疫檢查點表達量的關(guān)系 對GEO 數(shù)據(jù)的MSI 狀態(tài)與免疫檢查點CD274 即程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）的轉(zhuǎn)錄組芯片表達量進行分析，結(jié)果表明，CD274 表達量在MSI-H 組顯著上調(diào)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=2.8E-05）（圖2）。

圖2 MSI狀態(tài)與CRC患者的CD274表達（數(shù)據(jù)來源于GEO）

2.4 MSI 狀態(tài)與結(jié)直腸癌組織中免疫浸潤淋巴細胞相關(guān)分析 采用cibersoft 提供的LM22 矩陣（22 種免疫細胞的參考標志物基因表達矩陣），對GEO 數(shù)據(jù)進行免疫浸潤分析。結(jié)果表明，共有5 種免疫細胞的估計值在MSS/MSI-L 組以及MSI-H 組之間有統(tǒng)計學(xué)差異，以中位數(shù)豐度大小從高到低的排序分別是巨噬細胞M0型（macrophage M0），漿細胞（plasma cells），輔助T 細胞（t cells regulatory），巨噬細胞M1 型（macrophage M1）以及中性粒細胞（neutrophils），P<0.05。其中巨噬細胞M0 型，漿細胞以及輔助T 細胞在MSS/MSI-L 組中顯著上調(diào)，巨噬細胞M1 型以及中性粒細胞在MSI-H 組中顯著上調(diào)，其他免疫細胞類型的差異均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0 .05），結(jié)果見圖3。

圖3 CRC患者MSI-H 組和 MSS/MSI-L 組之間免疫細胞的比較（數(shù)據(jù)來源于GEO）

3 討論

1980 年wyman 等首次提出在人類基因組中的短串聯(lián)連重復(fù)序列即微衛(wèi)星（microsatellite，MS），由于其重復(fù)結(jié)構(gòu)，在復(fù)制過程中特別容易出現(xiàn)復(fù)制錯誤，由MMR負責錯誤修配。當dMMR 時，MS 出現(xiàn)復(fù)制錯誤得不到糾正并重復(fù)積累，使得MS 序列長度或堿基組發(fā)生不穩(wěn)定，稱為MSI。MSI 在一定程度上參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這可能是CRC 具有高度異質(zhì)性的原因。即使病理特征相似，CRC 的治療反應(yīng)與預(yù)后也存在顯著的個體化差異。有研究發(fā)現(xiàn)MSI 可能與CRC 有著獨特的生物學(xué)聯(lián)系［4］，闡明其關(guān)系可能有助于CRC 患者的個性化治療。

本研究中，MSI-H 型CRC 較MSS/MSI-L 型相比，其腫瘤具有多位于右半結(jié)腸、直徑大于5cm、其組織表達黏液的特征。一項基于1394 例CRC 患者病理標本的研究提示MSI 與年齡、腫瘤大小、部位、黏液表達、分化程度、TNM 分期有關(guān)［5］。本研究與上述研究大致相符，但在年齡、分化程度和TNM 分期未能顯示出統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與本研究收集樣本較少、存在抽樣誤差或檢測方法存在差異（PCR 法和IHC 法）有關(guān)。MSI-H與MSS/MSI-L 結(jié)直腸癌具有不同的病理特征，提示兩者發(fā)生、發(fā)展機制不同，因此本研究推測兩者在預(yù)后及免疫微環(huán)境可能存在一定差異。

進一步研究表明MSI-H 組個體無病生存期較MSS/MSI-L 組顯著延長，提示MSI-H 型CRC 患者預(yù)后更好。因此MSI 狀態(tài)對于CRC 預(yù)后判斷具有重要價值。Hou 等人研究同樣發(fā)現(xiàn)，與MSS/MSI-L 的CRC 患者相比，MSI-H 的CRC 患者的DFS 更長［6-7］，這可能是由于MSI-H 型患者免疫原性誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)增強所致［8］。但也有研究表明在IV 期CRC 患者中，MSI-H 型患者DFS 反而短于MSS/MSI-L 型患者［9］，這可能是由于在腫瘤晚期，機體為平衡高TH1/CTL 微環(huán)境，MSI-H 型上調(diào)眾多免疫檢查點使得腫瘤逃避免疫攻擊［10］。

腫瘤的發(fā)生除了涉及本身遺傳學(xué)改變外，免疫微環(huán)境發(fā)揮著重要作用。免疫微環(huán)境主要由腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）及相關(guān)細胞因子、免疫檢查點蛋白組成。免疫檢查點主要包括了細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）、程序性細胞死亡受體（programmed cell death-1，PD-1）和PD-L1，其中PD-1/PD-L1 通路是近幾年腫瘤免疫治療研究熱點。

本研究發(fā)現(xiàn)MSI-H 組PD-L1 的基因水平表達明顯高于MSS/MSI-L 組。由于dMMR 通過插入、缺失、編碼區(qū)的堿基錯配導(dǎo)致了編碼區(qū)的點突變，因此MSI-H 的結(jié)直腸腫瘤的高突變負荷可導(dǎo)致產(chǎn)生腫瘤特異性抗原，這些抗原通常是MSS 結(jié)腸癌的10-50 倍［11］，其免疫原性誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)增強。通過對免疫檢查點的分析可以解釋根據(jù)組織病理學(xué)標準判斷的明顯具有強免疫原性的腫瘤不被宿主排斥的原因。在MMR 系統(tǒng)存在缺陷時，CRC 免疫微環(huán)境會選擇性上調(diào)某些免疫檢查位點，其中包括了PD-L1。PD-L1 可以通過結(jié)合激活T 細胞表面的PD-1，抑制T 細胞的增值和活化，誘導(dǎo)其凋亡，進一步使得腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視［12］。如果阻斷PD-1/PD-L1 的相互作用，腫瘤細胞對于T 細胞的抑制作用可以被消除，最終實現(xiàn)腫瘤T 細胞的浸潤，免疫系統(tǒng)抗腫瘤作用增強。上訴機制可能是MSI-H 型結(jié)直腸患者更容易在免疫抑制劑治療中受益的重要原因之一，據(jù)此推測MSI 狀態(tài)有望成為PD-L1/PD-1 通路免疫治療的預(yù)測標記。

目前，免疫檢查點抑制劑在多個腫瘤治療領(lǐng)域取得了突破性進展，但仍只有一部分患者能從治療中獲益。結(jié)合TIL 了解免疫微環(huán)境，從而指導(dǎo)個體免疫治療，已經(jīng)成為免疫治療新的發(fā)展方向。當前關(guān)于CRC 和免疫微環(huán)境的研究較少，本研究結(jié)果表明，MSS/MSI-L 組以及MSI-H 組之間免疫浸潤有差異，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Teng MW 定義了免疫治療中獲得性耐受機制，根據(jù)TIL 和PD-L1 表達的存在或缺失分為四種類型（TIL+/PD-L1+，TIL-/PD-L1-，TIL+/PD-L1-，TIL-/PD-L1+），其中TIL+/PD-L1+的腫瘤更容易從PD-1/PD-L1 免疫治療中獲益［13］。劉濤生等人的研究表明，MSI-H 和MSS/MSI-L 組之間的TIL/PDL1 狀態(tài)存在差異，其中MSI-H 型CRC 更有可能呈現(xiàn)TIL+/PD-L1+腫瘤微環(huán)境［14］。另有研究表明，并不是所有MSI-H 型CRC 對于PD-L1/PD-1 通路免疫抑制劑都敏感［15］?？梢姡捎诿庖呶h(huán)境是一個復(fù)雜系統(tǒng)，涉及多種免疫細胞基因子和多個免疫檢查點，MSI 與免疫微環(huán)境的關(guān)系尚需更多研究論證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MSI-H 型CRC 具有特殊的病理特征。通過研究DFS 指標，結(jié)果表明MSI-H 組CRC 預(yù)后更好。分析了MSI-H 組免疫檢查點PD-L1表達和免疫浸潤模式，與MSS/MSI-L 組相比，MSI-H 組具有更高的PD-L1 表達及差異性的免疫細胞腫瘤浸潤豐度。不同MSI 狀態(tài)下，CRC 免疫微環(huán)境有差異，對于CRC 患者進行MSI 篩查，有助于個性化臨床治療方案的制定。

本研究存在一些局限性。首先，本研究為解決臨床樣本量不足的問題，采取了多中心回顧性樣本收集研究，導(dǎo)致患者的臨床數(shù)據(jù)結(jié)果判讀上可能存在系統(tǒng)性差異。其次，公共數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)量較小，其免疫微環(huán)境中TIL 也暫無評分標準，因此本研究未能對不同微衛(wèi)星狀態(tài)下PD-L1/TIL 進行分型，無法深入了解MSI 與免疫微環(huán)境情況。這也是未來進一步的研究方向。