王夢凡，洪?杰, ，王倩倩，姚?迪，賈辰熙

禁食對小鼠下丘腦磷酸化蛋白質組的影響

王夢凡1，洪?杰1, 2，王倩倩2，姚?迪2，賈辰熙2

(1. 天津大學化工學院，天津 300350；2. 北京生命組學研究所蛋白質組學國家重點實驗室，北京 102206)

本研究旨在通過干預小鼠進食，探討對小鼠下丘腦中蛋白質磷酸化修飾和相關信號通路的影響，為完善蛋白磷酸化調控網絡提供有價值的信息．將實驗小鼠平均分為3組，分別為對照組(con)、禁食組(D2)和禁食后恢復組(DR)，每組小鼠數量為3只．在48h內，con組正常提供飼料，D2組不提供飼料，DR組前44h不提供飼料、后4h提供飼料．同時解剖3組小鼠并提取下丘腦組織，提取、純化和酶解下丘腦組織的蛋白質，并采用二氧化鈦富集分離技術富集磷酸化肽段，運用高通量液相色譜-質譜聯(lián)用進行檢測，以鑒定樣品中的磷酸化蛋白質組．利用非標記定量方法篩選差異表達的磷酸化蛋白以及位點，對鑒定數據進行GO富集和KEGG通路分析，并探究磷酸化蛋白間的相互作用關系．結果顯示，共鑒定到4810個磷酸化蛋白質，對應于14259個磷酸化位點發(fā)生了變化．采用數學統(tǒng)計方法分析，成功確認小鼠下丘腦中有681個磷酸化蛋白差異顯著，觀察到這些差異蛋白與蛋白結合、激酶行為、轉運、軸突生成等分子活動和生物學過程有關，并富集到了MAPK、細胞內噬和環(huán)磷酸腺苷信號通路等11個主要的信號通路．這說明禁食會對小鼠下丘腦中多種蛋白質的磷酸化修飾水平產生顯著的影響，為完善小鼠下丘腦磷酸化信號調控網絡提供了有價值的信息．

食欲；禁食；下丘腦；蛋白質組；磷酸化修飾

食欲是滿足身體能量需要和食物攝取的欲望，可分為3個階段：饑餓、飽食和飽腹．饑餓是促進食物攝取的感覺；飽食感在進食過程中控制進餐的多少和持續(xù)時間，有助于停止進食，并開始一段禁食期；飽腹感決定了兩餐間的禁食時期[1]．下丘腦是大腦中調節(jié)食欲和能量平衡的中樞部位，在其中神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相關肽(agouti-related peptide，AgRP)、前阿黑皮素(proopiomelanocortin，POMC)等共同作用保持食欲穩(wěn)態(tài)平衡[2-3]．當下丘腦中調節(jié)食物攝入的蛋白和神經肽出現失衡時，就會導致暴飲暴食或者厭食的狀況，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)疾病、代謝疾病等．

蛋白質磷酸化是目前研究最廣泛和深入的蛋白質翻譯后修飾方式，它主要發(fā)生在絲氨酸、酪氨酸以及蘇氨酸上．蛋白質磷酸化在調節(jié)蛋白質功能和亞細胞定位中起著重要的作用，如細胞信號傳導、DNA修復、感知環(huán)境刺激、代謝調節(jié)、細胞運動和細胞?分化[4-8]．

近年來，一些研究發(fā)現通過控制攝入的食物改變機體中蛋白質磷酸化狀態(tài)與一些疾病的發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)，如阿爾茨海默癥、癌癥、心腦血管疾病、糖尿病等．Dittmann等[9]發(fā)現和正常食物喂養(yǎng)的小鼠相比，喂養(yǎng)16周高脂食物的小鼠表現出了明顯增肥和與胰島素抵抗相關的表型，且肝臟中酪氨酸磷酸化水平顯著增加．Rivera等[10]研究了母鼠在妊娠和哺乳期間飲食失調的影響，發(fā)現母鼠在哺乳期采取高熱量低蛋白飲食都會使雌性后代下丘腦表現出高水平的瘦素受體磷酸化以及低水平的SOCS3、IRS1磷酸化和AMPK磷酸化，此外后代小鼠會減少攝食、體重輕于野生型小鼠．這些科學研究通過改變飲食規(guī)律、改變食物類型和斷食等進行進食干預，揭示了進食干預對各種疾病、細胞、特定蛋白質修飾狀態(tài)的影響．目前尚無研究通過進食干預，探究對小鼠全蛋白質組的磷酸化影響．本研究采取了禁食的方法對小鼠進行干預，富集下丘腦組織蛋白磷酸化肽段，運用質譜技術進行磷酸化蛋白的鑒定，并使用非標記定量的方法篩選差異表達的磷酸化蛋白，揭示了禁食對小鼠下丘腦中蛋白質磷酸化的影響．

1?材料與方法

1.1?材?料

1.1.1?實驗動物

9只8周齡SPF 級C57BL/6雄性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，使用許可證編號：SYXK(軍)2015-0004，飼養(yǎng)于國家蛋白質科學中心動物飼養(yǎng)平臺，其室溫、濕度、飲食、飲水均符合標準實驗動物飼養(yǎng)條件．購買后將小鼠適應性飼養(yǎng)2周，以減少生活環(huán)境變化對小鼠生理的影響．

1.1.2?主要試劑

尿素購自AMRESCO公司；HEPES、磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor，PPI)、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)、吲哚乙酸(iodoacetamide，IAA)、乳酸(lactic acid，LA)購自SIGMA公司；超濾管(截留分子量10000)購自Merck Millipore公司；蛋白酶抑制劑(protease inhibitor，PI)購自Roche公司；三氟乙酸購自ACROS公司；質譜級Trypsin酶購自北京華利世科技有限公司；TiO2(二氧化鈦)購自GL Science公司；乙腈(acetonitrile，CAN)購自AVANTOR公司；氨水購自霍尼韋爾(中國)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Pierce?熒光定量肽段試劑盒購自ThermoFisher Scientific公司．

1.1.3?主要儀器

真空離心濃縮儀購自Eppendorf公司；恒溫箱購自湖南力辰儀器科技有限公司；超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；超低溫高速離心機、Nanodrop One超微量分光光度計、EASY-nLC 1000-Orbitrap Fusion液質聯(lián)用質譜儀購自ThermoFisher Scientific公司．

1.2?方?法

1.2.1?動物模型構建

禁食9只小鼠48h后，為部分小鼠供應綠色飼料．從提供綠色飼料到小鼠排出第一顆綠色糞便的時長約為4h，因此將禁食后恢復時間設定為4h．解剖并觀察對比正常飲食小鼠(con組)、禁食48h小鼠(D2組)和禁食后恢復4h飼料小鼠(DR組)的腸胃組織，我們發(fā)現相較于con組，D2組的腸胃更為干癟，而DR組的腸胃更為飽滿．根據飽腹程度的差異，相比于con組，D2組為食欲增強組，DR組為食欲減弱組．為控制生物節(jié)律一致，將造模的總時長設為48h，即con組正常進食48h、D2組禁食48h、DR組禁食44h再提供食物4h．

1.2.2?下丘腦組織的獲取

造模完成后，將小鼠脫頸處死并迅速開顱取出腦組織，分離出下丘腦組織于含有蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的低溫生理鹽水中洗凈，放于液氮中保存．待所有小鼠下丘腦組織取出后，放置于－80℃低溫保存．

1.2.3?蛋白樣品的制備

將下丘腦組織處于裂解液環(huán)境中，用組織研磨器在冰上裂解．裂解液組成為8mol/L尿素、20mmol/L HEPES、1%(體積分數)磷酸酶抑制劑和1%(體積分數)100倍的蛋白酶抑制劑，每個樣品用量為900μL.裂解后進行超聲處理2min，超聲儀設置30%功率、開2s、關2s，4℃、14000離心10min取上清．用BCA試劑盒測量樣品蛋白濃度，取出一定質量的蛋白質，按照100∶1(蛋白質溶液體積∶DTT溶液體積)加入1mol/L DTT溶液，37℃水浴加熱1h．按照50∶1(蛋白質溶液體積∶IAA溶液體積)加入1mol/L IAA溶液，室溫避光反應30min．按照100∶1(蛋白質溶液體積∶DTT溶液體積)加入1mol/L DTT溶液，室溫避光反應15min．

1.2.4?蛋白質提純

取截留分子量為10000的超濾管，加入樣品，室溫14000離心30min．加入400μL濃度為50mmol/L的碳酸氫銨溶液，14000離心30min洗滌并重復兩次．

1.2.5?蛋白質酶解

將離心管換成新的離心管，在超濾管中加入200μL的50mmol/L碳酸氫銨溶液和一定體積的質量濃度為0.5μg/μL的Trypsin酶溶液(其中蛋白與酶的質量比為25∶1)，37℃孵育過夜．室溫14000離心20min，加入400μL碳酸氫銨溶液14000離心20min并重復一次．取出離心管中溶液，于60℃真空抽干．

1.2.6?磷酸化肽段富集

用200μL BB(binding buffer)溶解肽段干粉，靜置20min后10000離心5min，取上清．按TiO2和蛋白質質量比為9∶1的比例取TiO2，并分成3等份，并各加500μLBB，垂直混勻5min，1000離心1min去上清并重復2次．將肽段溶液與TiO2混合，垂直混勻結合30min，1000離心1min．吸取上清并與下一份TiO2混合，重復上一步驟．直至肽段溶液與3份TiO2全部結合后棄去上清，將3份TiO2混合．將混合后的TiO2用500μL BB、500μL WB1 (washing buffer1)、500μL WB2(washing buffer2)各洗2次，每次清洗均需垂直混勻10min，1000離心1min去上清．用200μL EB(elution buffer)和TiO2混合，垂直混勻洗脫10min，1000離心1min并取上清，重復一次．合并兩次上清于60℃真空抽干．其中BB為70%ACN＋5%TFA＋8.3%LA＋ddH2O，WB1為30%ACN＋0.5%TFA＋ddH2O，WB2為80%?ACN＋0.5%TFA＋ddH2O，EB為40%ACN＋15%氨水＋ddH2O，均為體積分數．

1.2.7?LC-MS設定

將樣品溶于20μL 0.1%(體積分數)FA溶液．用nanodrop測得肽段濃度后，取500ng肽段的溶液注入液相．肽段經進樣針吸附在預柱上(C18填料：直徑3μm)．用不同比例的A相溶液(0.1%FA)和B相溶液(100%ACN)洗脫預柱上的樣品．樣品在分析柱(C18填料：直徑1.9μm)上被進一步分離后進入質譜儀．液相流速設置為600nL/min、總時長為78min，洗脫梯度為：0min，5%B；2min，7%B；10min，10%B；50min，20%B；70min，30%B；71min，90%B；78min，90%B．質譜儀采用正電荷模式，電噴霧電壓為2300V，離子傳輸管溫度為320℃.一級掃描為軌道阱(orbitrap)，分辨率為120000，質譜掃描范圍(/)為300～1400，自動增益控制目標為5e5，最大注入時間為100ms．二級掃描為離子阱(ion trap)采用高能誘導裂解(high-energy C-trap dissociation，HCD)/為120的母離子，碎裂能量為32%，掃描范圍設為自動，自動增益控制目標為5e3，最大注入時間為35ms.

1.2.8?蛋白的定性和定量

質譜數據RAW文件統(tǒng)一使用MaxQuant(版本為1.5.3.8)進行搜庫分析，搜索引擎為Andromeda，檢索所用數據庫為UniProtKB的小鼠全蛋白序列庫(17008個reviewed的蛋白，2019年4月更新)[11].選擇非標記定量方法(lable free quantification)，勾選“iBAQ”．設置母離子質量誤差為20×10-6，子離子質量誤差為0.5，FDR(假陽性率)＜1%，最小肽長度為7個氨基酸，允許肽最多有2個漏切位點，固定修飾為carbamidomethyl(C)，可變修飾為oxidation(M)和phosphorylation(STY)．

1.3?生物信息分析

使用R(版本4.0.2)和Rstudio(版本1.3.1056.0)對數據進行z-score歸一化、t-test檢驗、ANOVA方差分析等處理，計算組間相關性，統(tǒng)計各組磷酸化位點、肽段和蛋白數量，分析各組間差異并挑選出差異蛋白．使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8進行GO(gene onology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析．

2?結?果

2.1?下丘腦磷酸化蛋白質組數據處理

對MaxQuant搜庫結果設置localization score＞0.75，去除污染后共鑒定到了4810個蛋白質，對應于14259個磷酸化位點發(fā)生了變化．對結果進一步篩選處理，設定3次重復實驗中至少鑒定到2次的數據為有效數據．各組篩選得到的蛋白質數量分別為con組713個、D2組509個、DR組550個，磷酸化肽段數量分別為con組1979個、D2組1198個、DR組1433個．

對比3組數據統(tǒng)計發(fā)現，鑒定到的蛋白質總數為820個，3組共有的蛋白質數量為390個(圖1(a))；磷酸化肽段總數為2396，3組共有的肽段為836條(圖1(b))；磷酸化位點總數為5545個．對用z-score歸一化處理的磷酸化位點數據進行了Pearson相關性分析(圖1(c))，Pearson相關系數均在0.7及以上，說明非標記定量的有效性．

2.2?差異磷酸化位點的聚類分析

對D2/con(圖2(a))、DR/con(圖2(b))、DR/D2 (圖2(c))的磷酸化位點分別做統(tǒng)計分析，并用火山圖呈現，設置差異倍數(FoldChange)大于2為上調、小于0.5為下調，值小于0.05為差異顯著．D2/con中，下調位點數量為289，上調位點數量為345；DR/con中，下調位點數量為176，上調位點數量為103；DR/D2中，下調位點數量為52，上調位點數量為98．對比3次火山圖分析的差異顯著位點發(fā)現，相較于D2/con和DR/con，DR組與D2組的差異位點數量更少．這可能是由于DR組小鼠從食欲很強的饑餓狀態(tài)到食欲最弱的飽腹狀態(tài)的時長間隔只有4h，許多蛋白質的磷酸化修飾狀態(tài)還未穩(wěn)定，這一狀況還有待通過其他實驗繼續(xù)研究．

圖1?磷酸化蛋白質組學質譜數據定量分析

圖2?磷酸化修飾位點豐度水平差異火山圖

接下來對3組中差異顯著的磷酸化修飾位點的歸一化數據進行ANOVA分析和CV(變異系數)值篩選，并制作層次聚類分析熱圖(圖3)，發(fā)現D2組和DR組磷酸化修飾水平差異較小，但和con組相比，D2組和DR組變化較為明顯．

圖3?不同組中磷酸化位點豐度熱圖

2.3?差異磷酸化修飾蛋白質的GO富集分類和KEGG通路富集分析

進一步對D2/con、DR/con和DR/D2中顯著差異的磷酸化位點所對應的681個蛋白進行GO功能注釋分析(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)，分別從生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3個方面進行分析．

選取FDR小于0.05，共獲得73條注釋信息．從3個方面的分析中各選取10條富集蛋白較多的注釋制作GO功能富集分析柱狀圖(如圖4所示)．根據GO功能富集分析結果發(fā)現，分子功能集中在蛋白結合(protein binding)、GTP酶活化物活動(GTPase activater activity)、肌動蛋白結合(actin binding)等；細胞組分集中在細胞質(cytoplasm)、突觸(synpase)、細胞連接(cell junction)等；生物學過程集中在轉運(transport)、軸突生成(axonogenesis)、細胞黏附(cell-cell adhesion)等．

對這681個差異蛋白進行KEGG代謝通路信號分析．共獲得46條不同的代謝通路，值＜0.01且蛋白數量＞10的有11個(如圖5所示)，其中MAPK (mitogen-activated protein kinase)信號通路(MAPK signaling pathway)、內噬作用(endocytosis)、環(huán)磷酸腺苷信號通路(cAMP signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)(regulation of actin cytoskeleton)等富集程度較高．這一結果提示，蛋白質的磷酸化修飾在小鼠下丘腦食欲信號傳導途徑中發(fā)揮著重要的作用．

圖4?差異磷酸化蛋白的GO功能富集分析

圖5?差異磷酸化蛋白的KEGG信號通路分析

3?討?論

下丘腦位于大腦腹面、丘腦的下方，參與調節(jié)自主神經系統(tǒng)，是調節(jié)內臟和內分泌活動的中樞．下丘腦分為多個區(qū)域，其中腹內側核(ventromedial nucleus，VMH)是食欲抑制中心，下丘腦外側是食欲增強中心．本研究通過干預小鼠進食，使不同組小鼠的食欲產生差異，觀察不同食欲期的小鼠下丘腦中磷酸化蛋白質組的區(qū)別．通過質譜鑒定、蛋白搜庫和R語言處理，篩選出了681個蛋白質的磷酸化位點有顯著差異．這些差異表達的蛋白質的分子功能涉及參與多種細胞活動、物質能量轉換和磷酸化修飾過程，主要負責分子間的結合和催化，并且參與MAPK信號通路、內噬作用、環(huán)磷酸腺苷信號通路、Ras信號通路等相關通路．

本研究通過對顯著差異蛋白進行GO功能富集的分析發(fā)現，34.4%的蛋白質的功能與蛋白結合相關．其中部分的蛋白質與食欲直接或間接相關，如突觸結合蛋白7(synaptotagmin-7，SYT7)、胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)．在胰腺β細胞中SYT7的磷酸化可以調節(jié)胰島素的釋放，并且不會改變Ca2+的分泌依賴性[12]．SYT7在胰腺α細胞中為胰高血糖素的分泌起Ca2+傳感器的作用[13]．SYT7通過增加鈣離子水平、促進ATP的生成，促進了胰高血糖素的分泌．胰島素和胰高血糖素在體內共同起著調節(jié)血糖的作用，分別增強和抑制食欲．因此，SYT7蛋白及其磷酸化水平的變化在一定程度上影響著小鼠能量攝取行為．胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)是胰島素信號通路中參與細胞增殖、代謝和生存的主要成分，被激活的酪氨酸激酶可以使其磷酸化修飾發(fā)生變化．在阿爾茨海默癥和Ⅱ型糖尿病中，IRS的磷酸化修飾變化引起的胰島素抵抗是其最主要的特征．胰島素抵抗會改變糖代謝，并引起IRS-1(Ser307)過磷酸化，引發(fā)食欲亢進，出現高血糖、肥胖、血脂異常等癥狀[14-15]．其他的一些基因，如TNIK與ATP結合相關、BSN與金屬離子結合相關、CTNNA1與肌動蛋白的結合相關及CHCHD3與DNA結合轉錄抑制因子活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性相關等，這些基因對應蛋白的磷酸化水平的變化提示蛋白結合的變化可能對小鼠攝食行為的研究具有重要的意義．

本研究的通路富集分析證實有多達23個蛋白與MAPK信號通路相關，如MEF2C編碼的心肌細胞特異性增強因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2C)、TAOK3編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TO3(serine/threonine-protein kinase TAO3)、NF1編碼的神經纖維蛋白(neurofibromin)、PPM1A編碼的蛋白磷酸酶1A(protein phosphatase 1A)、MAPT編碼的微管結合蛋白tau(microtubule-associated protein tau)等．MAPK信號通路包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，這3種激酶能依次激活，共同調節(jié)著細胞的生長分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理病理過程[16-17]．MAPT在整個中樞?神經系統(tǒng)的神經元中廣泛表達，負責編碼組裝tau?蛋白[18]．

tau磷酸化是其最重要的翻譯后修飾，受蛋白激酶和磷酸酶調節(jié)，與神經變性的發(fā)病機理密切相關. MAPT編碼區(qū)的突變會引起tau蛋白表達失調和錯配，異常的tau蛋白會過度磷酸化并聚集，從而會導致微管崩解和軸突運輸功能障礙引起額顳葉癡呆伴帕金森病等神經性疾病[19-20]．

MKP1是一種MAPK磷酸酶，MKP1的肝臟特異性缺失會增強高脂飲食小鼠體內的糖異生，并會引起肝胰島素抵抗，并且MKP1可能會減少p38和JNK MAPK介導的糖異生基因的轉錄以及p38MAPK介導的環(huán)AMP響應元件結合蛋白(CREB)的磷酸化[21]．從MAPK信號通路圖(https://www.kegg.jp/kegg-bin/ show_pathway?map04010)中，顯而易見MKP會抑制ERK并將其去磷酸化，ERK又能促進tau的磷酸化，從而MKP磷酸化修飾狀態(tài)的變化會間接影響tau的磷酸化水平，最終引起小鼠體內肝胰島素抵抗和攝食增加．

雖然獲得了受禁食影響而發(fā)生磷酸化修飾水平變化的蛋白質及相關的通路等，但是還有待進一步的實驗對顯著差異的蛋白進行生物學驗證．

4?結?語

本研究對小鼠進行禁食，獲取了小鼠下丘腦中磷酸化蛋白質數據，進一步分析發(fā)現小鼠下丘腦中SRRM2、CAC1A、BSN、HYCCI等681個蛋白的磷酸化受到影響，進而影響蛋白結合、激酶行為、轉運、軸突生成等分子活動和生物學過程，并影響MAPK通路、細胞內噬等信號通路．通過禁食實驗，得以理解蛋白質的磷酸化修飾如何在小鼠下丘腦中發(fā)揮調節(jié)作用，希望可以為攝食調控和藥物代謝研究提供重要的數據資源和參考．

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Effect of Fasting on the Phosphoproteome of Mouse Hypothalamus

Wang Mengfan1，Hong Jie1, 2，Wang Qianqian2，Yao Di2，Jia Chenxi2

(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2. State Key Laboratory of Proteomics，Beijing Institute of Life Omics，Beijing 102206，China)

Determining the effect of fasting on the protein phosphorylation and related signaling pathways in the hypothalamus of mice provides valuable information for improving the regulatory network of protein phosphorylation. The mice were divided into three groups(with three mice in each group)：control group(con)，fast group(D2)，and recovery group after fasting(DR). Within 48h，con was fed with a normal diet；D2 was fasted；DR was fasted for the first 44h and was then provided with a normal diet for the next 4h. The hypothalamus was extracted from the three groups at the same time. The protein of the hypothalamus tissues was extracted，purified，and enzymolyzed. The digested peptides from the hypothalamus were treated with TiO2to enrich the phosphorylated peptides. The phosphorylated proteins were identified by high-throughput liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS). The label-free quantitative method was used to identify the differentially expressed phosphorylated proteins. GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis were carried out to explore the potential functions of these proteins. Results showed that 4810 phosphorylated proteins were identified corresponding to 14259 phosphorylation sites. There were 681 phosphorylated proteins in the hypothalamus of mice that were greatly affected by fasting，which were related to molecular activities and biological processes，such as protein binding，kinase activity，transport，and axonogenesis. These proteins were mainly classified into 11 signaling pathways，including MAPK signaling pathways，endocytosis，and cAMP signaling pathway. The phosphoproteome of the mouse’s hypothalamus can be significantly affected by fasting，which provides valuable information for improving the regulatory network of the hypothalamic phosphorylation signal in mice.

appetite；fasting；hypothalamus；proteome；phosphorylation

10.11784/tdxbz202101020

Q816

A

0493-2137(2022)04-0357-07

2021-01-12；

2021-04-28.

王夢凡（1983—??），女，博士，副教授，mwang@tju.edu.cn.

賈辰熙，cjia@mail.ncpsb.org.

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFA0501302，2017YFA0505702)；國家自然科學基金資助項目(21675006)；國家重大科研資助項目(BWS17J025).

Supported by the National Key Research and Develepment Program of China(No. 2016YFA0501302，No. 2017YFA0505702)，the National Natural Science Foundation of China(No. 21675006)，the National Key Research Program of China(No. BWS17J025).

(責任編輯：田?軍)