丁 紅孫運霞戴良香徐 揚張冠初秦斐斐張智猛*

(1.山東省花生研究所,山東 青島 266100;2.中國農(nóng)業(yè)大學土地科學與技術學院,北京 100083)

花生是我國重要的經(jīng)濟和油料作物,具有抗旱耐瘠、適應性強的特點,在我國干旱半干旱地區(qū)有較大種植面積。 作為豆科作物,花生具有根瘤固氮作用,是干旱丘陵地區(qū)的重要經(jīng)濟作物。 干旱脅迫和土壤氮素缺乏影響花生生長發(fā)育,導致花生養(yǎng)分利用率降低,造成花生產(chǎn)量和品質(zhì)下降。 植物根際土壤受根系活動影響,其理化性質(zhì)及生物學活性不同于其他土體的微域環(huán)境,是土壤、植物、微生物三者相互作用的場所。 植物的新陳代謝和微生物活動共同影響根際土壤的特性、營養(yǎng)物質(zhì)和微生物群落等[1-2]。 植物種類、栽培方式、種植年限、土壤類型及理化性質(zhì)及病蟲害等都能影響根際微生物群落[3-6]。 干旱條件下玉米根際土壤中細菌和古菌數(shù)量顯著低于水分充足條件下[7]。 干旱和鹽脅迫下花生根際微生物群落結構和組成受到較大影響,其優(yōu)勢菌群、功能菌群等比例發(fā)生變化,影響其根際微生物群落結構的平衡[8]。 另外,有研究表明,植物根際細菌群落結構和多樣性受施肥條件的影響較大,施用肥料降低了花生根際土壤的菌群多樣性但提高了其菌群物種豐度[9]。

目前,鹽堿脅迫對花生根際微生物菌群結構的影響研究較多,干旱脅迫與氮素缺乏對花生根際細菌群落的影響鮮見報告,且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)根際微生物在適應逆境脅迫和土壤元素循環(huán)中發(fā)揮重要作用。 因此,研究干旱脅迫和低氮對花生根際細菌群落的影響,有助于認識逆境下花生根際土壤細菌群落功能調(diào)節(jié)并發(fā)掘新的功能類群,對旱薄地花生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培具重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以花育25號為試驗材料,在16 h 光照/8 h黑暗(28℃/22℃)的溫室內(nèi)進行盆栽試驗,試驗盆直徑16.3 cm,高17.4 cm。 土壤風干過篩后裝盆,土壤田間持水量23.23%,每盆裝土3.0 kg,種植2株花生。 設正常供水(WWNA)、干旱脅迫(DSNA)和干旱低氮雙重脅迫(DSNN)三個處理,其中正常供水處理為對照。 低氮水平下不施氮肥,正常施氮為每盆施0.16 g N(90 kg·hm-2)。為保證出苗和長勢的一致性,開花前保持正常供水,土壤相對含水量為田間持水量的75%。 開花后進行干旱脅迫處理,采用稱質(zhì)量法控制水分含量,保持土壤相對含水量為田間持水量的45%,干旱脅迫時間5 d,每處理重復3次。

1.2 根際土壤采集

將花生整株挖出后,仔細抖落根系表層土壤,用滅菌后的刷子將根際約1～10 mm 的土壤拂刷后放入無菌袋中[10]。 同一處理的花生根際土壤樣品混合成一個土壤樣品,液氮速凍后置-80℃超低溫冰箱保存。 正常供水處理的土壤樣本3次重復分別表示為WWNA1、WWNA2 和WWNA3,干旱脅迫處理的分別表示為DSNA1、DSNA2、DSNA3,干旱低氮雙重脅迫處理的分別表示為DSNN1、DSNN2和DSNN3。

1.3 土壤DNA 提取及高通量測序

采用OMEGA 土壤DNA 提取試劑盒提取花生根際土壤DNA。 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對根際土壤進行了相關測試。 以提取的土壤樣本DNA 為模板,對土壤細菌16S r RNA 基因進行PCR 擴增后進行Miseq文庫構建及測序。擴增引物為V3～V4 區(qū)的338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 以及806R: (5'-GACTAHVGGGTWTCTAAT-3')。 利用Miseq拼接軟件將讀取長度拼接成長序列,同時對序列品質(zhì)進行質(zhì)控和過濾,區(qū)分樣本后,對多個序列聚類運算分類單元(operational taxonomic units,OTUs) 進行聚類分析和物種分類學分析。

1.4 生物信息學分析

采用Alpha多樣性分析方法,分析了花生根際土壤細菌群落的多樣性和豐富度。 同時,對樣本間的Beta多樣性進行分析,包括主成分分析(PCA)和聚類統(tǒng)計分析,以深入挖掘樣本間物種組成的差異。 最后,利用美吉云平臺的重建群落系統(tǒng)發(fā)育調(diào)查PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)方法對樣本中微生物群落的功能組成進行預測。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性指數(shù)分析

土壤細菌群落的多樣性和豐富度可用Alpha多樣性指數(shù)表征,其中辛普森和香農(nóng)指數(shù)可反映土壤細菌群落多樣性,菌種豐度由Ace和Chao指數(shù)計算,coverage指各樣本文庫的覆蓋度。 表1 可見,各處理土壤樣本覆蓋度差異較小,平均值均在0.97以上,表明各處理花生根際土壤樣本文庫覆蓋度高。 正常供水條件下花生根際土壤樣本的Chao1和Ace值均較大,其物種總數(shù)較高。 各處理香農(nóng)指數(shù)大小順序為WWNA＞DSNA＞DSNN。干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫條件下的辛普森指數(shù)平均值顯著高于對照(表1),分別比正常供水高41.54%和79.58%,表明干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫處理降低了根際土壤細菌群落多樣性。

表1 各樣本Alpha多樣性指標Table 1 Alpha diversity index of different samples

2.2 細菌群落組成及樣本間差異比較

2.2.1 門水平菌落結構分析

圖1可見,在門分類水平上各處理根際土壤細菌群落的優(yōu)勢菌門為放線菌門(Actinobacteriota,27.20%～29.99%)、變形菌門(Proteobacteria,22.72%～24.74%)、綠彎菌門(Chloroflexi,10.57%～13.55%)、酸桿菌門(Acidobacteriota,9.63%～10.49%)及厚壁菌門(Firmicutes,4.72%～5.98%),這5類優(yōu)勢菌門的相對豐度為74.84%～84.75%。其中,干旱脅迫、干旱低氮脅迫處理下變形菌門的相對豐度低于正常供水處理,而各處理下放線菌門和酸桿菌門的相對豐度升高,分別較正常供水處理提高10.18%、10.07%和6.02%、8.93%。 與正常供水處理相比,干旱低氮雙重脅迫處理下綠彎菌門的相對豐度增加10.43%,而干旱脅迫處理下相對豐度降低13.85%。

圖1 門水平各樣本菌落結構柱狀圖Fig.1 Bacterial community structure in peanut rhizosphere on Phylum level

2.2.2 綱水平菌落結構分析

綱水平分析表明,各處理下放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、維奇那米菌綱(Vicinamibacteria)和芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)5類菌綱均為優(yōu)勢菌綱,其豐度均在5%以上(圖2)。 其中,干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫處理下放線菌綱的相對豐度分別比正常供水處理高14.45%和20.83%。 干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫增加Vicinamibacteria的相對表達豐度,尤以干旱低氮雙重脅迫的誘導效果最為顯著。 干旱脅迫處理下α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的相對表達豐度低于其他處理。 與正常供水處理相比,干旱脅迫及干旱低氮雙重脅迫處理下γ-變形菌綱相對豐度均顯著降低,分別降低6.23%和16.23%。

圖2 綱水平各樣本菌落結構柱狀圖Fig.2 Bacterial community structure in peanut rhizosphere on Class level

2.2.3 目水平菌落結構分析

圖3可見,微球菌目(Micrococcales)、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)、Vicinamibacterales、伯克氏菌目(Burkholderiales)、根瘤菌目(Rhizobiales)及 鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)為花生根際土壤優(yōu)勢菌目。 干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫下微球菌目、丙酸桿菌目和Vicinamibacterales的相對表達豐度均顯著高于正常供水處理,其中干旱低氮雙重脅迫下微球菌目相對豐度增加幅度最高,為52.61%。 與對照相比,干旱脅迫降低鞘脂單胞菌目的表達豐度,降低幅度為11.84%;而干旱低氮雙重脅迫提高其表達豐度,增加幅度為46.01%。 對照條件下伯克氏菌目和根瘤菌目的相對豐度較高,而干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫條件下較低,根瘤菌目的降低幅度分別為13.03%和20.36%。 由此可知,干旱脅迫降低了根瘤菌目的表達豐度,而干旱低氮雙重脅迫加劇了其表達量的降低。

圖3 目水平各樣本菌落結構柱狀圖Fig.3 Bacterial community structure in peanut rhizosphere on Order level

2.2.4 科水平菌落結構分析

圖4可見,與其他菌科相比,類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、 鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)、 芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、 間孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、Norank_o_Vicinamibacterales、微球菌科(Micrococcaceae)為花生根際土壤優(yōu)勢菌科。 與對照相比,干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫下類諾卡氏菌科和間孢囊菌科相對豐度顯著增加,增幅分別為47.39%、26.21%和28.18%、68.79%,而Gemmatimonadaceae的表達相對豐度呈降低趨勢。 干旱低氮雙重脅迫下鞘脂單胞菌科相對表達豐度最高,分別比對照和干旱脅迫高31.51%和39.62%。

圖4 科水平各樣本菌落結構柱狀圖Fig.4 Bacterial community structure in peanut rhizosphere on Family level

2.3 Beta多樣性分析

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA 分析)是一種對數(shù)據(jù)進行簡化分析的技術。通過分析不同樣本群落組成可反映樣本間的差異和距離。 如圖5A 所示,各處理樣本分布于不同象限各為一類,但同一處理3次平行重復性較好,說明各處理間根際土壤細菌群落結構存在差異。在PCA 圖中,橫坐標(PC1)能夠解釋54.42%的樣品差異,縱坐標(PC2)能夠解釋21.22%的樣品差異。 聚類分析表明,同一處理樣本3次重復聚集到同一分支,不同處理樣本間距離較遠,差異較大,聚集于不同分支(圖5B)。 由此可知,干旱脅迫和低氮脅迫等非生物逆境影響了花生根際土壤微域環(huán)境,使根際土壤細菌群落多樣性產(chǎn)生較大差異。

圖5 Beta多樣性分析Fig.5 Beta diversity analysis

2.4 16S功能預測

不同處理下花生根際細菌群落功能豐度譜通過16S功能預測獲得。 分析發(fā)現(xiàn)氨基酸轉運與代謝(Amino acid transport and metabolism)、轉錄(Transcription)、翻譯、核糖體結構與生物發(fā)育(Translation,ribosomal structure and biogenesis)、能量生產(chǎn)與轉換(Energy production and conversion)、細胞壁/膜/包膜的生物發(fā)育(Cell wall/membrane/envelope biogenesis)、及無機離子轉運與代謝(Inorganic ion transport and metabolism)這6類功能所占的比重較大。 干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫下細胞運動(Cell motility)和細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸(Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport)等功能基因的豐度低于對照處理。 干旱脅迫下信號轉導機制(Signal transduction mechanisms)和無機離子轉運與代謝等相關功能基因的豐度顯著高于干旱低氮雙重脅迫處理。 干旱低氮雙重脅迫下防御機制(Defense mechanisms)、細胞骨架(Cytoskeleton)、核苷酸轉運和代謝(Nucleotide transport and metabolism)等功能基因的豐度相對升高,表明干旱低氮雙重脅迫下,花生根際土壤細菌群落產(chǎn)生脅迫應激反應以誘導較高的生命活動 (圖6)。

圖6 16S細菌菌群功能預測Fig.6 The bacterial functional features via cluster of orthologous groups(COG)analysis

3 討 論

根際土壤受植物根系活動的影響,其物理、化學和生物學性質(zhì)不同于其他土體的微域環(huán)境。 植物根際微生物是根際的重要組成部分,其中植物根際土壤細菌具有促進植物生長發(fā)育、提高礦質(zhì)養(yǎng)分吸收及增強植物抗逆性的作用[12]。 干旱是影響植物生長發(fā)育的重要因素之一,其對植物根際微生物群落結構和多樣性組成亦有一定影響。干旱脅迫改變根系分泌物的數(shù)量和組成,誘導一系列的生理和分子反應,而根際微生物做出特定響應,使特定微生物在根際富集[13-15]。 土壤氮水平是影響根際微生物的另一重要因素,對土壤微生物多樣性和群落結構有重要影響[16-18]。

徐揚等研究表明干旱及旱鹽雙重脅迫處理下,花生根際土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)與對照無顯著差異[19]。 不施氮肥顯著降低了茶樹根際土壤微生物群落多樣性[20],氮肥長期施用會降低土壤微生物數(shù)量以及細菌群落的Alpha多樣性[16]。 本試驗表明干旱脅迫及干旱低氮雙重脅迫降低了花生根際土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù),與茶樹中研究結果相一致[20],與徐揚等[8]研究結果略有不同的原因可能是土壤養(yǎng)分含量、干旱脅迫程度差異所致。 干旱脅迫下玉米根際土壤中優(yōu)勢菌群為變形菌、厭氧群菌和酸桿菌[7],水稻根際土壤中酸桿菌門、α-變形菌和疣微菌門等相對豐度增加[21]。 干旱脅迫提高了花生根際α-變形菌綱和藍藻綱的相對豐度。 小麥生育期和供氮水平均驅(qū)動著小麥根際微生物群落結構的變化[22-23]。 缺氮條件下,小麥根際腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等微生物豐度的增加可能提高其氮肥吸收和利用效率[24]。 本研究表明,放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門及厚壁菌門等5類為花生根際土壤細菌群落優(yōu)勢菌門。 變形菌門在干旱脅迫及干旱低氮雙重脅迫處理下的相對豐度降低,而放線菌門和酸桿菌門的相對豐度顯著升高,與前人干旱脅迫下的研究結果相一致[8,19]。 放線菌是具有厚細胞的單胚層細菌,其細胞壁具有干旱耐受性的能力[25],因此可能是其在干旱脅迫下放線菌門明顯富集的原因。 酸桿菌具有寡營養(yǎng)的特點,因此氮營養(yǎng)缺乏誘導了其豐度的增加。 目和科水平上,與對照相比,干旱低氮雙重脅迫均提高鞘脂單胞菌的相對表達豐度。 干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫條件均降低了根瘤菌目的表達豐度,降低幅度分別為13.03%和20.36%。由此可知,干旱脅迫影響了花生根瘤固氮菌的活性,而雙重脅迫下影響更大,與前人研究表明根瘤固氮需要一定的“起爆氮”相一致[26]。 根際土壤微生物結構受非生物脅迫的影響,優(yōu)勢菌群的改良對花生提高花生抗逆性具有重要作用。

16S功能預測表明非生物逆境脅迫對花生根際土壤細菌群落的功能豐度譜產(chǎn)生了一定影響,根際微生物細菌菌群的信號傳導機制和防御機制功能在干旱脅迫處理下明顯提高,這可能與植物的抗逆能力和清除有毒物質(zhì)有關[27]。 干旱低氮雙重脅迫處理后細胞骨架、核苷酸轉運和代謝等功能基因的豐度相對升高,可能與根際土壤細菌保持旺盛的代謝和活性以抵御環(huán)境脅迫相關,與前人的研究結果相一致[19]。 已有研究表明,在土壤-植物根系-微生物交互網(wǎng)絡中,根系細菌(根際、根表、根內(nèi)等)能改變植物的激素水平或產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)因子以促進植物根系發(fā)育,刺激植物產(chǎn)生抗逆信號通路,從而提高其耐旱性[12]。 因此,今后應深入研究逆境脅迫環(huán)境下花生根際微生態(tài)的生物平衡調(diào)節(jié),探討根系發(fā)育與土壤微生物群落結構的相關關系,為改善根際土壤微生態(tài)環(huán)境和提高植物抗逆性提供重要理論支撐。

4 結 論

與對照相比,干旱脅迫和干旱低氮雙重脅迫處理降低了根際土壤細菌群落多樣性。 花生根際土壤細菌群落均以放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)、 綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)及厚壁菌門(Firmicutes)等優(yōu)勢菌門為主。 干旱脅迫及干旱低氮脅迫處理均不同程度地提高了放線菌門和酸桿菌門的相對豐度,而降低了變形菌門的相對豐度。 干旱脅迫降低了γ-變形菌綱和根瘤菌目的表達豐度,而干旱低氮雙重脅迫加劇了其表達量的降低。 干旱低氮雙重脅迫增加了細胞骨架、核苷酸轉運和代謝等相關功能基因在根際土壤中的富集。 對花生干旱和低氮脅迫下花生根際土壤細菌群落的功能調(diào)節(jié)并發(fā)掘新的功能類群是改善逆境下花生生長的可行途徑。