徐文嬋 劉珍銀 陳欽諭 張靖
靜脈畸形(venous malformation,VM)舊稱海綿狀血管瘤,是人體最常見的良性、低流速脈管畸形,屬于靜脈發(fā)育畸形,約占血管畸形總數(shù)的95%[1]。VM 發(fā)病率為 1∶5 000~1∶10 000,男∶女比例約為1∶1,可發(fā)生于身體的任何部位,頭頸部與軀干部發(fā)病率均約為40%,四肢部約為20%[2]。
目前VM的治療方式主要包括介入硬化治療、手術(shù)治療、冷凍治療、激光治療以及放射性核素敷貼等,其中手術(shù)切除現(xiàn)已成為輔助治療手段,如應(yīng)用于硬化劑治療多次效果仍不明顯,而病灶體積巨大嚴(yán)重影響外觀與功能者等;放射性核素敷貼效果欠佳且遺留明顯的色素沉著,目前已很少應(yīng)用;激光治療深部病灶如腮腺內(nèi)、咬肌區(qū)的VM時,皮膚吸收較多激光而深部病灶并不能得到很好的治療,一旦增加功率又會給皮膚帶來較大損傷,因此不作為治療首選;血管內(nèi)硬化介入治療是目前國際主流的治療方式,主要優(yōu)勢為創(chuàng)傷小、療效明顯、可重復(fù)多次進行。但仍有部分患者對以上常規(guī)治療并不敏感,療效不理想,因此國內(nèi)外專家進行了更深入的發(fā)病機制研究,希望能在基因?qū)用鎸ふ业酵黄瓶凇?/p>
研究者早期即發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TEK,又稱Tie2),分布在血管內(nèi)皮細胞、造血干細胞和促血管生成單核細胞中[3-4],但主要是在內(nèi)皮細胞中表達,其與配體ANG2發(fā)生特異性結(jié)合后對血管內(nèi)皮平滑肌細胞的通訊起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。隨著進一步的基因靶向研究表明,Tie2/ANG2信號通路在胚胎期、成人期的血管發(fā)育中均起著重要的調(diào)節(jié)作用,各種原因引起的基因突變可導(dǎo)致Tie2磷酸化水平升高,致使Tie2促血管生成的活性升高,從而導(dǎo)致畸形血管的發(fā)生;例如家族性皮膚黏膜靜脈畸形(venous malformation,cutaneuos and mucosal,VMCM)和約50%的散發(fā)性VM是由受體Tie2突變引起的[5-9]。基于此,本研究的目的是針對Tie2突變位點與VM發(fā)生的相關(guān)性進行初步探討。
該項研究獲得廣州市婦女兒童醫(yī)療中心醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)和參與者的知情同意。本試驗VM病例組共納入VM患者56名,為2018年就診于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心的患者,均符合國際診斷標(biāo)準(zhǔn),年齡從1~10歲,平均年齡(4.5 ± 2.3)歲,男∶女比例為1∶1,病灶部位及數(shù)目詳見表1;健康對照組血液標(biāo)本來自于30名健康人群,男∶女為1∶1,年齡從1~10歲,平均年齡(4.3 ± 1.2)歲。VM病例組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)VM患兒疾病診斷依據(jù)符合“血管瘤和脈管畸形診斷和治療指南(2016版)”;(2)獲得知情同意;(3)資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)資料不完整,失訪;(2)既往接受其他治療。
(一)主要試劑
(1) 基 因 組DNA提 取 試 劑;(2)PCR擴增試劑:引物(上海生工);(3)瓊脂糖凝膠電泳試劑:DNA分子(Marker萊楓生物有限公司),TE緩沖液(上海生工);(4)引物合成:PCR引物和測序引物合成由上海生工完成,針對Tie 2 基因13號外顯子的PCR正向引物F 5'-TCTGTCTGTGCCACTCTT-3',反 向 引 物R 5'-CACGGTAATCCTATGTAA-3',測 序 引 物5'-CACGGTAATCCTATGTAA-3';(5) 測 序 試 劑:SAP酶(ABI公司),BDT(ABI公司),無水乙醇(上海生工)。
(二)主要步驟
1.提取外周血白細胞DNA
取外周血2 mL,用DNA提取試劑盒提取外周血白細胞DNA,所有離心操作均在室溫下進行。用洗脫緩沖液TE溶解,以紫外分光光度儀測定所有DNA樣品的純度和濃度,并保存于-80℃ 。
2.針對Tie2基因的13號外顯子進行引物設(shè)計
本試驗所設(shè)計的Tie2基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物見表1,PCR擴增條件流程見圖1。
表1 PCR反應(yīng)體系
圖1 PCR擴增條件流程
(三)純化
利用瓊脂糖凝膠電泳方法將PCR擴增的產(chǎn)物按照不同分子量分開,將含有目的產(chǎn)物的條帶用刀片切下來,用溶劑把凝膠溶解后再濃縮,然后回收溶液中的目的DNA片斷。
采用直接測序法,即一代測序,由上海生工完成。測序結(jié)果用Chromas軟件分析核酸序列,在NCBI網(wǎng)站與已知序列進行比對。把所有個體的情況錄入預(yù)先設(shè)計Excel統(tǒng)計表中。將各組標(biāo)本的Tie2突變情況(如表2),采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
表2 56例病例樣本—VMs的臨床特征以及Tie2基因13號外顯子突變結(jié)果
本次研究中的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。其中VM病例組與健康對照組間在年齡(t檢驗,P> 0.05)與性別(男∶女均為1∶1)方面均無統(tǒng)計學(xué)意義,數(shù)據(jù)具有可比性。本次試驗中納入的30例正常人血液標(biāo)本中檢測Tie2基因的13號外顯子突變率僅為3.3%(1/30),VM病例組突變率為57.1%(32/56)。
VM病例組內(nèi)進行卡方檢驗(校正公式,部分實際頻數(shù)< 5),χ2和P值如表3所列,P值均>0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義;即不能認(rèn)為VM的Tie2基因13號外顯子突變率與性別有關(guān),不能認(rèn)為患者出生時即有病灶還是出生后才有病灶有差別,不能認(rèn)為病灶位于身體不同部位的突變率有差別VM病例組與健康對照組(總數(shù)n< 40)組間突變率的比較使用Fisher確切概率法(見表4)進行分析,發(fā)現(xiàn)兩組之間突變率不同,VM病例組突變率高于健康對照組(P< 0.05),具有統(tǒng)計學(xué)意義。
表3 VMs組內(nèi)突變率的比較
表4 VM病例組與健康對照組間突變率的比較
VM患者最主要的癥狀就是疼痛,由于病灶具有侵蝕性,能跨組織生長,如同時累及皮膚軟組織與深部肌肉群甚至侵犯骨膜,因此無論是硬化治療還是手術(shù)切除,都只是限制病灶的繼續(xù)生長,而無法將病灶畸形血管完全清除。為此,針對這些介入硬化、手術(shù)治療、激光治療等現(xiàn)有的治療方式不敏感的難治性VM,科學(xué)家們在分子機制與靶向治療上進行了一系列更深入的研究。
VM是由血管發(fā)育畸形導(dǎo)致的疾病,以血管發(fā)育原理為重點的研究揭示了生長因子家族和細胞信號傳導(dǎo)機制(包括Ang/Tie2、Notch家族、TGFB/ALK1、FGF、S1P/EDG1、信號素 /神經(jīng)叢素、Netrin/UNC5B、細胞基質(zhì)/整合素信號傳導(dǎo),以及其他調(diào)節(jié)血管生成性甲酚酶的途徑)對血管和淋巴管的形態(tài)發(fā)生、發(fā)育、成熟及穩(wěn)態(tài)都至關(guān)重要。研究證實Tie/ANGPT是內(nèi)皮細胞信號主要傳導(dǎo)途徑之一,Tie/ANGPT家族包括Tie1、Tie2 2種受體和 Angpt1、Angpt2 和 Angpt4 3 種 配 體[10-11],Tie2分別與Angpt1和Angpt2結(jié)合從而介導(dǎo)血管成熟和血管生成[12-15]。如果在小鼠基因中敲除Tie2或Angpt-1會導(dǎo)致血管分支畸形改變,管壁平滑肌細胞嚴(yán)重覆蓋不足[15-16]。在發(fā)育的胚胎中,Angpt-1的缺失會導(dǎo)致血管網(wǎng)紊亂,畸形擴張的血管數(shù)量也會增加[17]。
Ang/Tie2信號通路在協(xié)調(diào)內(nèi)皮細胞行為、形成和重塑血管網(wǎng)絡(luò)的多個方面起著至關(guān)重要的作用。Tie2基因的突變可以引起血管畸形的發(fā)生,此類突變所致的VM共同點就是Tie2均有磷酸化(即活化),只是水平不等,但是目前的研究中包括本次研究均沒有發(fā)現(xiàn)突變率與任何臨床特征(性別、發(fā)病年齡、病灶數(shù)量、嚴(yán)重程度、類別或復(fù)發(fā)率)之間存在明顯的關(guān)聯(lián)。Ye等[18]鑒定出Tie2 17號外顯子的7個錯義突變,之前也有學(xué)者在散發(fā)性VM中報道過,但是57.1%(20/35)單突變率與L914F有關(guān),與Limaye報道的100%(24/24)相差較遠,認(rèn)為可能與人群種族不同、樣本大小不同等因素有關(guān)。Boscolo等[19]通過向免疫缺陷的小鼠注射最常見的引起VM突變類型L914F的HUVECs(人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞),從而建立小鼠VM模型,檢測雷帕霉素與Tie2抑制劑(Tie2-TKI)對小鼠VM的影響,發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠有效降低突變體誘導(dǎo)的Tie2-Akt信號傳導(dǎo),雖然確切機制不明但阻止VM進展的療效明顯;Tie2-TKI雖然是靶向抑制Akt信號傳導(dǎo),但是作用弱,而且對Tie2具有劑量依賴性。在此基礎(chǔ)上Boscolo等又進行了一項前瞻性臨床試驗,對6名標(biāo)準(zhǔn)治療方式無效的VM患者采取雷帕霉素口服治療,發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可明顯減輕疼痛、出血、病變大小、功能和美學(xué)損傷以及血管內(nèi)凝血障礙,第一次實現(xiàn)了VM的分子水平的試探性治療[19]。但是后期帶來的眾多二級臨床并發(fā)癥不得不納入考慮范圍,而且口服雷帕霉素對于病灶局限的VM患者療效與劑量也未知,雖然給我們提供了新的研究方向,但是目前并不建議臨床推廣使用。
本研究中靜脈畸形患者Tie2 13號外顯子突變率較正常人群顯著升高,這為對標(biāo)準(zhǔn)療法不敏感的難治性VM提供了新的思路。雖然關(guān)于此類脈管性畸形疾病的具體發(fā)病機制尚不明確,但是相信隨著分子生物學(xué)研究的進一步深入,在不久的將來分子治療領(lǐng)域一定能獲得突破性進展,不僅有利于疾病治療,更有利于此類疾病的產(chǎn)前診斷與預(yù)防。