曹 恒 楊美玉 劉安國 張夢杰 曹云鶴 陸文清

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

豆粕是一種最主要的飼用蛋白質(zhì)原料，其中存在著一些抗?fàn)I養(yǎng)寡糖，如棉子糖和水蘇糖等。單胃動物由于腸道內(nèi)缺少相應(yīng)的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)，采食豆粕后常導(dǎo)致后腸產(chǎn)生二氧化碳和甲烷等，因此造成脹氣、腹痛和腹瀉等腸胃疾病，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低，這造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在飼糧中添加α-半乳糖苷酶，即酶學(xué)鈍化法是目前較為直接有效的鈍化手段[1]。

α-半乳糖苷酶在1895年發(fā)現(xiàn)于Frohberg和Saaz 2種下面發(fā)酵啤酒酵母的混合物中，1936年被正式命名為α-半乳糖苷酶[2]。α-半乳糖苷酶是一種外切糖苷酶，能夠催化α-1,2-半乳糖苷鍵、α-1,3-半乳糖苷鍵、α-1,4-半乳糖苷鍵及α-1,6-半乳糖苷鍵的水解，使不同α-D-半乳糖苷裂解其非還原性末端的半乳糖殘基[3-5]。α-半乳糖苷酶可酶解多種底物，如蜜二糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖[6](圖1)，半乳甘露聚糖、支鏈多糖等多聚糖，以及糖脂、糖蛋白等復(fù)合多糖[2]。就目前的報道來看，α-半乳糖苷酶具有3種活性，除酶解活性外，在底物濃度較高時存在轉(zhuǎn)半乳糖基的活性(可用于寡糖和環(huán)糖衍生物的合成)，少數(shù)植物來源的α-半乳糖苷酶還存在類似凝集素的活性[7]。

α-galactosidase：α-半乳糖苷酶；Invertase：轉(zhuǎn)化酶；Galactose：半乳糖；Glucose：葡萄糖；Fructose：果糖；Sucrose：蔗糖；Raffinose：棉子糖；Stachyose：水蘇糖。圖1 蔗糖、棉子糖和水蘇糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及其水解示意圖Fig.1 Schematic diagram of chemical structure and hydrolysis of sucrose, raffinose and stachyose[6]

在碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)數(shù)據(jù)庫(http://www.cazy.org/)中，糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GH)根據(jù)其氨基酸序列相似性及其疏水基團(tuán)，現(xiàn)被分類為170個家族，即GH1～GH170。α-半乳糖苷酶目前主要被劃分入7個糖苷水解酶家族，即GH4、GH27、GH31、GH36、GH57、GH97和GH110。其中，GH4、GH57和GH97家族的酶大多來自細(xì)菌，小部分來自古細(xì)菌；GH27家族的酶大多來自細(xì)菌，小部分來自真核生物；GH31和GH36家族的酶大多來自細(xì)菌，小部分來自真核生物和古細(xì)菌；GH110家族的酶目前只來源于細(xì)菌。GH27和GH36家族是α-半乳糖苷酶酶的主要來源，GH27家族多在酸性條件下有活性，GH36家族多在中性或堿性時功能最佳[8]。

本試驗以實驗室前期對硫色曲霉(Aspergillussulphureus)的全基因組測序為基礎(chǔ)，選取1條功能鑒定為α-半乳糖苷酶的cDNA序列，命名為硫色曲霉α-半乳糖苷酶基因(As-gal1)(GH27家族)，根據(jù)畢赤酵母密碼子使用頻率表進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建畢赤酵母工程菌株。進(jìn)一步將工程菌株進(jìn)行72 h搖瓶表達(dá)，探究其酶學(xué)性質(zhì)，然后進(jìn)行30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵(采用RDM培養(yǎng)基)，用所得粗酶液進(jìn)行豆?jié){中大豆寡糖的酶解試驗，探究其水解效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和載體

目的基因和載體pPICZαA合成至大腸桿菌DH5α(由蘇州金唯智生物科技有限公司完成)，巴斯德畢赤酵母X-33為本實驗室保存。

1.1.2 工具酶、主要試劑及培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ和XbaⅠ(New England Biolabs公司，美國)，酵母提取物和胰蛋白胨(Oxoid公司，英國)，Zeocin(Invitrogen公司，美國)，生物素(田斌制藥公司，日本)，瓊脂糖(Biowest公司，西班牙)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、真菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega公司，美國)，TEMED(Sigma公司，美國)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa公司，日本)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

微量鹽溶液：6.0 g CuSO4·5H2O、0.09 g KI、3.0 g MnSO4·H2O、0.2 g Na2MoO4·2H2O、0.02 g硼酸、0.5 g CoCl2·6H2O、20 g ZnCl2、65 g FeSO4·7H2O和5 mL濃H2SO4，雙蒸水定容至900 mL，高壓滅菌后加入100 mL 0.2%生物素，4 ℃保存。

維生素溶液：稱取7.5 g肌醇、0.3 g鹽酸硫胺、0.3 g泛酸鈣、0.3 g煙酸、0.3 g鹽酸吡哆醇、0.015 g生物素和0.06 g對氨基苯甲酸，加適量雙蒸水溶解，定容至1 L，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

脂肪酸溶液：2 mg花生四烯酸、10 mg亞油酸、10 mg亞麻酸、10 mg肉豆蔻酸、10 mg油酸、10 mg軟脂酸、10 mg硬脂酸、2.2 g吐溫-80、70 mg醋酸生育酚和1 g聚醚F-68，加適量雙蒸水溶解，定容至1 L，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存。

RDM培養(yǎng)基：稱取12 g KH2PO4、4.7 g MgSO4·7H2O、0.36 g CaCl2·2H2O、1.65 g (NH4)2SO4、和3.37 g KOH，溶于500 mL雙蒸水，高壓滅菌。稱取1.74 g谷氨酰胺和1.46 g精氨酸溶于100 mL雙蒸水，過濾除菌后全部加入于剛配好的500 mL鹽溶液。以此為基礎(chǔ)，加入3.33 mL維生素、10 mL脂肪酸、4.34 mL微量鹽溶液和適量雙蒸水定容至1 L。使用時用H2SO4和氨水調(diào)節(jié)所需pH。

1.2 試驗方法

1.2.1As-gal1的序列分析和密碼子優(yōu)化

將選取的As-gal1通過DNAMAN 9.0進(jìn)行分析，通過NCBI Protein BLAST網(wǎng)站分別比對出在蛋白序列數(shù)據(jù)庫中與As-gal1編碼氨基酸序列相似性最高的10個蛋白，并用MEGA 11.0軟件分別構(gòu)建As-gal1和其BLAST結(jié)果的發(fā)育進(jìn)化樹。通過https://web.expasy.org/protparam/在線預(yù)測蛋白理論分子質(zhì)量和等電點，通過http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/進(jìn)行信號肽序列分析，通過http://busca.biocomp.unibo.it/進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測。根據(jù)畢赤酵母密碼子使用頻率表進(jìn)行序列優(yōu)化，去掉信號肽，去掉序列中SacⅠ和BglⅡ限制性內(nèi)切酶酶切位點，不引入BspHⅠ和BamHⅠ酶切位點，在序列5′端加入EcoRⅠ酶切位點，在序列3′端加入XbaⅠ酶切位點，將設(shè)計好的序列全基因合成到載體pPICZαA上，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-As-gal1-opt，優(yōu)化基因的合成和測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。通過https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/對優(yōu)化序列進(jìn)行深度學(xué)習(xí)和同源建模相結(jié)合的蛋白質(zhì)從頭結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.2 As-gal1畢赤酵母工程菌株的構(gòu)建

將含有pPIC-As-gal1-opt質(zhì)粒的穿刺菌接種于含有Zeocin(100 μg/mL)的10 mL LB培養(yǎng)基在50 mL錐形瓶中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。利用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，將所提取質(zhì)粒用BglⅡ限制性內(nèi)切酶于37 ℃酶切過夜，線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入新制備的畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞中，電擊結(jié)束后立刻加入1 mL冰預(yù)冷的1 mol/L山梨醇溶液，充分混勻后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，28 ℃培養(yǎng)3 h。將菌體懸液涂布于YPDS固體平板上(含有100 μg/mL Zeocin)，28 ℃培養(yǎng)約3 d，直至培養(yǎng)出清晰的菌落。挑取單菌落劃線于YPD固體平板(含有100 μg/mL Zeocin)上，28 ℃培養(yǎng)約3 d，直至培養(yǎng)出清晰的菌落。

1.2.3As-gal1工程菌株的搖瓶表達(dá)

挑取劃線純化后的X-33/As-ga11-opt陽性單克隆，接種于含有Zeocin(100 μg/mL)的10 mL YPD培養(yǎng)基在50 mL錐形瓶中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)約24 h，取100 μL菌液移接至裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)至600 nm波長下吸光度(OD600 nm)值達(dá)到2.0。將BMGY菌液在4 ℃、5 000 r/min離心5 min，去掉上清液，保留菌體，用50 mL BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行重旋，于500 mL錐形瓶中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)72 h，每隔24 h補加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)(終濃度為0.5%)。BMMY培養(yǎng)基搖瓶72 h結(jié)束，每24 h取樣1次，4 ℃、13 300 r/min離心5 min，取上清液于4 ℃保存。

1.2.4 α-半乳糖苷酶活性的測定

參照Rezessy-Szabó等[9]的方法，采用對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)法測定α-半乳糖苷酶活性。對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法如下：準(zhǔn)確稱取對硝基苯酚1.391 2 g(10 mmol)，用0.5 mol/L Na2CO3溶液定容至1 L，配成0.01 mol/L的母液。取1 mL母液用Na2CO3溶液定容至100 mL，配成0.1 mmol/L的對硝基苯酚工作液。分別吸取該溶液0、1、2、4、8、12、16和20 mL，用Na2CO3溶液定容至50 mL，配成濃度分別為0、0.002、0.004、0.008、0.016、0.024、0.032和0.040 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液。405 nm波長下測定溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、對硝基苯酚濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

α-半乳糖苷酶活性測定步驟如下：在1 mL離心管中加入100 μL PNPG底物溶液，于50 ℃水浴預(yù)熱5 min，加入100 μL經(jīng)過適當(dāng)稀釋(用pH 5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋)的酶液，55 ℃條件下反應(yīng)10 min，加入800 μL 0.5 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)并顯色，于405 nm波長下測定溶液的吸光度。試驗重復(fù)數(shù)為3。酶活定義為：在55 ℃和pH 5.0的條件下，每分鐘從濃度10 mmol/L的PNPG底物溶液中釋放1 μmol的對硝基苯酚所需要的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.5.1 最適pH和pH穩(wěn)定性

最適pH：使用pH分別為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，底物PNPG也用相應(yīng)的緩沖液配成10 mmol/L的底物溶液。在50 ℃條件下測定酶活性。試驗重復(fù)數(shù)為3。

pH穩(wěn)定性：將酶液分別置于上述pH的緩沖液中，室溫處理30 min后，最適條件下測定殘余酶活性。試驗重復(fù)數(shù)為3。

1.2.5.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

最適溫度的確定：將酶液適當(dāng)稀釋后，分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60和70 ℃溫度下測定并計算酶活性，確定最適溫度。試驗重復(fù)數(shù)為3。

溫度穩(wěn)定性的確定：將酶液適當(dāng)稀釋后置于70 ℃保溫5 min，60 ℃保溫5、10、15、20和25 min，并分別取樣。每個溫度設(shè)置1個對照組，均保存于冰上，其預(yù)處理均與試驗組相同。處理后于最適條件50 ℃和pH 5.0下測定酶活性。試驗重復(fù)數(shù)為3。

1.2.5.3 金屬離子對酶活性的影響

用最適pH的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配成濃度為20 mmol/L的含有不同金屬的化合物溶液[FeCl3、KCl、CaCl2、NH4Cl、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、CuSO4、ZnSO4、MnSO4、MgSO4、(NH4)2SO4、NaCl和CoCl2]，將適當(dāng)稀釋的酶液與金屬離子溶液1∶1(體積比)混合，使金屬離子終濃度為10 mmol/L。室溫處理1 h后，最適條件下測定殘余酶活性，鑒定不同金屬離子對酶活性的影響，以不添加金屬離子的酶液作為空白對照。試驗重復(fù)數(shù)為3。

1.2.6 工程菌株的30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

挑取工程菌株X-33/As-gal1-opt接種于200 mL YPD液體培養(yǎng)基于500 mL錐形瓶中，180 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h，將200 mL菌液倒入至裝有7.5 L YPD液體培養(yǎng)基的15 L種子罐中，溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速300～500 r/min，通氣量10.5～15.0 L/min，罐內(nèi)壓力0.05 MPa，當(dāng)菌體濕重達(dá)到60 g/L時，將1 kg菌液接種至裝有14 L pH 5.0 RDM培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐中。初始條件為：28 ℃，用氨水調(diào)節(jié)pH使其穩(wěn)定在5.0，通氣量為25.0 L/min，發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制相對溶氧在20%以上。培養(yǎng)至14 h左右，觀察到溶氧值迅速升高時(此時基礎(chǔ)碳源葡萄糖耗盡)，進(jìn)入50%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))甘油補料階段，控制補料速度使溶氧值保持在20%以上。當(dāng)菌體濕重達(dá)到212 g/L時，停止甘油補料，饑餓2 h使菌體耗盡剩余的甘油。然后開始甲醇誘導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和甲醇流速控制相對溶氧在20%。每隔24 h取樣測菌體濕重和酶活性。待菌體濕重及酶活性達(dá)到峰值保持穩(wěn)定或呈下降趨勢時，停止發(fā)酵。8 000 r/min離心5 min后取上清，對上清液進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.2.7 豆?jié){中大豆寡糖的體外酶解

將10%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))的豆?jié){8 000 r/min離心10 min后取上清液進(jìn)行酶解試驗。試驗設(shè)置2個試驗組和2個對照組，每組設(shè)置2個平行。2個試驗組加酶量分別是1和2 U/mL。取10 mL離心后的豆?jié){放入50 mL離心管中，分別加入1和2 mL酶活性為12 U/mL的發(fā)酵液，前一組補加雙蒸水1 mL以保證豆?jié){濃度一致；對照組用雙蒸水代替酶液，反應(yīng)體系為12 mL。55 ℃水浴條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，每隔1 h取樣2 mL，共取樣3次，80 ℃加熱5 min滅活，15 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清液作為待測液。將待測液用水稀釋500倍后用0.22 μm濾膜過濾后上機進(jìn)行離子色譜分析，測定產(chǎn)物半乳糖和蔗糖以及所剩底物棉子糖和水蘇糖的含量，以水蘇糖含量的減少量計算降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 As-gal1的序列分析

As-gal1序列全長1 626 bp，編碼541個氨基酸，其中前27個氨基酸為信號肽序列。將該基因與NCBI上已知序列進(jìn)行比對(圖2)發(fā)現(xiàn)，本試驗所使用的硫色曲霉α-半乳糖苷酶與來源于AspergillussteyniiIBT 23096的α-半乳糖苷酶相似度為79.12%，與來源于鞣革曲霉(Aspergillustanneri)的α-半乳糖苷酶(XP_033421422.1)也具有67.98%的相似度；該酶預(yù)測蛋白等電點為4.91，理論蛋白分子質(zhì)量為59.56 ku。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外基質(zhì)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如圖3所示，該酶具備GH27家族的典型特征，即N端催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，其中N端催化結(jié)構(gòu)域為(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，C端結(jié)構(gòu)域為由反向平行的β折疊形成的折疊股。

putative alpha-galactosidase：推定的α-半乳糖苷酶；Aspergillus parasiticus：寄生曲霉；Melibiase：蜜二糖酶；Aspergillus flavus AF70：黃曲霉AF70；uncharacterized protein ATNIH1004 011000：非特征蛋白ATNIH1004 011000；Aspergillus tanneri：鞣革曲霉。結(jié)點處的數(shù)字為自展值，表示分支的可信度；0.050表示氨基酸替換率。Numbers at the junctions were bootstrap values, representing the credibility of the branches; 0.050 was the replacement rate of the amino acids.圖2 As-gal1編碼的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic dendrogram of amino acid sequence coded by As-gal1

圖3 硫色曲霉α-半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Protein structure prediction of α-galactosidase from Aspergillus sulphureus

2.2 As-gal1的序列優(yōu)化

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，去掉信號肽，去除和增加上述酶切位點，在不改變氨基酸序列的情況下，有367個堿基被替換，替換率為23.75%，優(yōu)化基因序列與野生型基因序列的一致性為76.25%(圖4)。密碼子適應(yīng)性指數(shù)(codon adaptation index，CAI)優(yōu)化前為0.59，優(yōu)化后為0.82；GC含量(鳥嘌呤和胞嘧啶所占堿基的比例)優(yōu)化前為60.00%，優(yōu)化后為50.03%(圖5)。

wt：野生型 wild type；opt：優(yōu)化型 optimized type；Consensus：一致。深藍(lán)色為相同堿基，淺藍(lán)色為不同堿基。The dark blue mean the same bases, and the light blue mean the different bases.圖4 As-gal1野生型和優(yōu)化型序列比較Fig.4 Comparison of wild type and optimized type sequence of As-gal1

圖5 As-gal1序列優(yōu)化前后的密碼子適應(yīng)指數(shù)和GC含量Fig.5 Codon adaptation index and GC content before and after optimization of As-gal1 sequence

2.3 As-gal1畢赤酵母工程菌株的搖瓶表達(dá)

將重組工程菌株X-33/As-gal1-opt搖瓶表達(dá)72 h，24 h時酶活性為(1.17±0.21) U/mL，48 h時酶活性為(2.20±0.06) U/mL，72 h時酶活性為(3.20±0.21) U/mL。

2.4 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適pH和pH穩(wěn)定性

α-半乳糖苷酶在pH 5.0時水解能力最強，在pH 4.5～5.0進(jìn)行水解反應(yīng)，該酶可以保持60%以上的活性，在pH 4.0以下或pH 7.0以上時該酶幾乎完全失活(圖6)。

圖6 pH對α-半乳糖苷酶活性的影響Fig.6 Effects of pH on α-galactosidase activity

該酶在pH 4.0～5.5具備較好的穩(wěn)定性，pH降到4.0以下時，其水解活性急劇下降至失活，在pH 6.0時穩(wěn)定性也較差(圖7)。

圖7 α-半乳糖苷酶的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of α-galactosidase

2.4.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

α-半乳糖苷酶在55 ℃時達(dá)到最高催化活性，在40～60 ℃時可保持50%以上的活性，超過60 ℃則活性迅速下降(圖8)。

圖8 溫度對α-半乳糖苷酶活性的影響Fig.8 Effects of temperature on α-galactosidase activity

α-半乳糖苷酶對溫度穩(wěn)定性的結(jié)果如圖9所示，可以看出α-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性較差，60 ℃ 10 min和70 ℃ 5 min即可近乎全部失活。

◆：60 ℃；▲：70 ℃。圖9 α-半乳糖苷酶的溫度穩(wěn)定性Fig.9 Temperature stability of α-galactosidase

表1 金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on α-galactosidase activity

2.4.3 金屬離子穩(wěn)定性

α-半乳糖苷酶對各種金屬離子的耐受性結(jié)果見表1，可以看出，MgSO4對α-半乳糖苷酶有抑制作用，可降低約15%的活性；FeCl3對α-半乳糖苷酶有極顯著的促進(jìn)作用(P<0.01)，可提高約60%的活性。

2.4.4 α-半乳糖苷酶工程菌株X-33/As-gal1-opt的高密度發(fā)酵

將工程菌株X-33/As-gal1-opt進(jìn)行30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，在1 kg種子液從15 L種子罐接種至30 L發(fā)酵罐14 h后，觀察到溶氧迅速上升，隨后穩(wěn)定在較高的水平，說明培養(yǎng)基中的基礎(chǔ)碳源葡萄糖已經(jīng)耗盡，測得此時菌體濕重為80 g/L。此時開始進(jìn)行50%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))甘油補料，補料期間控制相對溶氧穩(wěn)定在20%以上。發(fā)酵進(jìn)行24 h時，菌體濕重達(dá)到212 g/L，30 min后停止甘油補料，饑餓3 h使菌體耗光剩余的甘油。3 h后開始甲醇誘導(dǎo)。優(yōu)化型α-半乳糖苷酶工程菌株X-33/As-gal1-opt發(fā)酵過程中的菌體濕重和酶活性變化如圖10所示。隨著誘導(dǎo)時間的延長，菌體濕重與酶活性逐漸提高，當(dāng)甲醇誘導(dǎo)至188 h時，菌體濕重為557 g/L，酶活性在177 h達(dá)到最高，為190 U/mL。分別取甲醇誘導(dǎo)0、24、48、72、96、120、144、168、177和188 h的發(fā)酵上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE分析，在48 ku處可見明顯的目的條帶(圖11)。

■：菌體濕重 bacteria wet weight；▲：酶活性 enzyme activity。圖10 30 L發(fā)酵罐中優(yōu)化型α-半乳糖苷酶工程菌株X-33/As-gal1-opt的菌體濕重增長曲線及酶活性Fig.10 Bacteria wet weight growth curve and enzyme activity of optimized α-galactosidase engineering strain X-33/As-gal1-opt in 30 L fermentor

1：未誘導(dǎo) not induced；2：24 h；3：48 h；4：72 h；5：96 h；6：120 h；7：144 h；8：168 h；9：177 h；10：188 h；M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) protein molecular weight marker。圖11 優(yōu)化型α-半乳糖苷酶工程菌株X-33/As-gal1-opt發(fā)酵上清液SDS-PAGE分析Fig.11 SDS-PAGE analysis of optimized αgalactosidase engineering strain X-33/As-gal1-opt fermentation supernatant

2.4.5 豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

將發(fā)酵所得的粗酶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在最適條件下水解調(diào)制好的10%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))豆?jié){溶液以進(jìn)行體外酶解試驗，測試該酶對豆?jié){中寡糖的降解效果。酶解產(chǎn)物經(jīng)高效離子色譜測定，通過外標(biāo)法依照各組分保留時間進(jìn)行定性，依據(jù)峰面積積分得出各組分的含量，各組分的保留時間見圖12。以水蘇糖含量的減少量計算水蘇糖降解率，結(jié)果見圖13。α-半乳糖苷酶于55 ℃、添加量分別為1和2 U/mL的情況下，1 h時水蘇糖的降解率分別為3.49%和1.14%；2 h時得到對水蘇糖的最高降解率，降解率分別為3.91%和5.22%；3 h時降解率分別為0.36%和-1.46%。

圖12 酶解產(chǎn)物中寡糖含量的離子色譜分析Fig.12 Analysis of contents of oligosaccharides in enzymatic products by ion chromatography

加酶量：1 U/mL(▲)；2 U/mL(■)。Volume of enzyme: 1 U/mL (▲); 2 U/mL (■).圖13 α-半乳糖苷酶對水蘇糖的水解Fig.13 Hydrolysis of α-galactosidase on stachyose

由于1分子水蘇糖去掉1個半乳糖殘基后可生成1分子棉子糖，因此棉子糖同時作為酶解反應(yīng)的底物和產(chǎn)物，故采用半乳糖含量的增加量計算水蘇糖和棉子糖為底物的總寡糖降解率?？偣烟墙到饴式Y(jié)果見圖14。隨著時間的延長，總寡糖降解率逐漸提高，酶解1 h后，加酶量為1和2 U/mL的2組總寡糖降解率分別為34.60%和35.92%；酶解2 h后，總寡糖降解率分別為37.35%和40.53%；酶解3 h后，總寡糖降解率分別為39.71%和49.07%。結(jié)果表明，α-半乳糖苷酶在降解豆?jié){中的棉子糖和水蘇糖方面具有極大潛力。

加酶量：1 U/mL(▲)；2 U/mL(■)。Volume of enzyme: 1 U/mL (▲); 2 U/mL (■).圖14 α-半乳糖苷酶對總寡糖的水解Fig.14 Hydrolysis of α-galactosidase on total oligosaccharides

3 討 論

3.1 α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

查閱BRENDA酶學(xué)綜合信息庫(https://www.brenda-enzymes.org/index.php)，獲取該酶的酶學(xué)信息。目前α-半乳糖苷酶的分子質(zhì)量范圍為17～400 ku。真菌中分離出來酶多來源于曲霉和青霉。曲霉來源的α-半乳糖苷酶是一個具有高度可變分子性質(zhì)的異質(zhì)性群體，分子質(zhì)量不均勻；青霉來源的α-半乳糖苷酶分子質(zhì)量為55～67 ku。細(xì)菌α-半乳糖苷酶也是一組結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的異質(zhì)性酶，其分子質(zhì)量為45～400 ku，變化很大[10]。α-半乳糖苷酶等電點為3.5～9.3，最適pH為2.5～8.0，pH耐受為2.0～10.0。細(xì)菌α-半乳糖苷酶的最適pH為6.0～7.5，而真菌α-半乳糖苷酶的最適pH為3.5～5.0[9]。α-半乳糖苷酶最適溫度為20～105 ℃。

本試驗所選用的酶來自于GH27家族。Ye等[11]從猴頭菇(Hericiumerinaceus)子實體中分離出一種新的GH27家族的57 ku α-半乳糖苷酶，該酶在pH 6.0和60 ℃時活性最高，在pH 2.2～7.0穩(wěn)定，且在較窄的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定；Zn2+、Fe3+和Ag+對該酶有較強的抑制作用；純化倍數(shù)為1 251倍，比活性為46 U/mg。Hu等[12]從紅平菇(Pleurotusdjamor)中分離出一種GH27家族的酸性α-半乳糖苷酶，分子質(zhì)量約為60 ku，最適pH為5.0，最適溫度為53.5 ℃，在pH 3.0～10.0表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性；K+、Cd2+、Cu2+、Hg2+、Al3+、Fe3+和Ag+對該酶有較強的抑制作用。本試驗所選用的α-半乳糖苷酶，最適pH為5.0，最適溫度為55 ℃，在pH 4.0～8.0處理30 min幾乎不變性(pH 6.0除外)，具有較好的金屬離子穩(wěn)定性，與上述2種GH27家族的酶較為相似。

3.2 工程菌株的30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

培養(yǎng)基是工程菌株生存的直接外部化學(xué)環(huán)境，是限制菌株生長與表達(dá)的主要因素。任延升[13]用30 L發(fā)酵罐對畢赤酵母HS3-1-溶菌酶菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，采用BSM培養(yǎng)基，初始裝液量為18 L，接菌量為10%，發(fā)酵進(jìn)行到40 h開始進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，此時菌體濕重為225 g/L；發(fā)酵至140 h時結(jié)束，菌體濕重約為220 g/L。瞿曼[14]用30 L發(fā)酵罐對畢赤酵母X-33-脂肪酶菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，初始裝液量10 L，接菌量10%，采用BSM培養(yǎng)基對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在最適生長溫度和最適生長pH并以甲醇為單一誘導(dǎo)碳源，誘導(dǎo)144 h，菌體濕重最高穩(wěn)定在463 g/L。與常用的發(fā)酵畢赤酵母菌株所使用的發(fā)酵基礎(chǔ)鹽BSM培養(yǎng)基不同，本試驗使用了一種新型培養(yǎng)基——豐富限定培養(yǎng)基RDM，30 L發(fā)酵罐初始裝液量為14 L，接菌量為1 kg，菌種為畢赤酵母X-33，發(fā)酵進(jìn)行到24 h時菌體濕重為212 g/L，饑餓3 h開始甲醇誘導(dǎo)，期間保持相對溶氧率在20%以上，誘導(dǎo)96 h時菌體濕重為415 g/L，誘導(dǎo)144 h時菌體濕重為531 g/L，最終于誘導(dǎo)188 h時菌體濕重最高為557 g/L。在相對應(yīng)和最終時刻，本試驗菌體濕重遠(yuǎn)高于上述報道的文獻(xiàn)，證明RDM培養(yǎng)基較BSM培養(yǎng)基更適合畢赤酵母X-33菌株的生長。

3.3 α-半乳糖苷酶對豆?jié){中大豆寡糖的酶解效果

Wang等[15]將來自米曲霉YZ1的α-半乳糖苷酶基因GalC導(dǎo)入畢赤酵母X-33構(gòu)建工程菌株，經(jīng)5 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)192 h后，用粗酶液于體外酶解豆?jié){中的寡糖，加酶量為5、10和15 U/mL，豆?jié){體積為10 mL，反應(yīng)體系為15 mL，25 ℃下反應(yīng)。降解3 h后，5 U/mL的試驗組對水蘇糖的降解率為91%，15 U/mL的試驗組可對水蘇糖實現(xiàn)完全降解(100%)?？偣烟墙到夥矫?，3 h后3個試驗組對總寡糖的降解率分別為87.1%、88.0%和97.8%。

本試驗中，α-半乳糖苷酶的添加量較少，為1和2 U/mL，于最適溫度55 ℃下酶解3 h。可以觀察到，無論是1 U/mL還是2 U/mL，該酶對水蘇糖的降解率隨著時間的增加呈現(xiàn)出先提升后下降的趨勢。經(jīng)分析，若α-半乳糖苷酶耐熱性不好，隨著時間的增加逐漸失活，降解率至少在3 h時應(yīng)該與2 h時保持同一數(shù)值，而不是下降，甚至不應(yīng)出現(xiàn)負(fù)值。結(jié)合部分α-半乳糖苷酶具有轉(zhuǎn)半乳糖基的活性，且GH27家族自身就包含具有水解和轉(zhuǎn)糖基活性的酶[7,16]的事實，因此推測該酶可能隨著水解的進(jìn)行，在半乳糖基濃度較高時發(fā)生了轉(zhuǎn)糖基作用。在添加濃度較低的情況下，3 h后該酶對總寡糖的降解率可達(dá)39.71%和49.07%，表明該酶對豆?jié){中的大豆總寡糖具有較好的降解潛力。

4 結(jié) 論

① 本試驗選取了來自硫色曲霉的α-半乳糖苷酶cDNA序列As-gal1，該序列全長1 626 bp，編碼541個氨基酸，其中前27個氨基酸為信號肽序列。預(yù)測蛋白等電點為4.91，理論蛋白分子質(zhì)量為59.56 ku。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外基質(zhì)。搖瓶誘導(dǎo)72 h最高酶活性為3.20 U/mL。

② 該酶最適溫度為55 ℃，最適pH 5.0，除pH為6.0外，在pH 4.0～8.0具有較好的穩(wěn)定性，耐熱性較差，60和70 ℃各處理10和5 min幾乎失活。

③ 對工程菌株X-33/As-gal1-opt進(jìn)行30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，甲醇誘導(dǎo)177 h后酶活性最高可達(dá)190 U/mL，菌體濕重于188 h最高可達(dá)557 g/L。

④ 體外水解試驗表明，酶添加量為2 U/mL，反應(yīng)溫度為55 ℃，2 h對水蘇糖的降解率為5.22%，3 h對總寡糖的降解率為49.07%，具有較好的降解潛力。