楊麗婷 高亞男 楊 雪 劉華偉 王加啟 鄭 楠*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109)

霉菌毒素主要是由曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌產(chǎn)生的一系列有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，常污染食品、飼料等。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織的調(diào)查，全球約25%的農(nóng)作物(堅(jiān)果、谷物、大米等)會(huì)受到霉菌毒素的污染，其中黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)是較頻繁檢出的一類，人或動(dòng)物攝入后會(huì)引起不同程度的毒性作用[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)在所有AFs中毒性最強(qiáng)[3]。牛奶中常檢測(cè)到黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)是因?yàn)槟膛Ｋ鶖z入的是受AFs污染的飼料，隨后AFB1被機(jī)體肝臟微粒體細(xì)胞色素P450代謝轉(zhuǎn)化為AFM1而分泌到乳汁中[4-5]。赭曲霉毒素(ochratoxin，OT)是曲霉屬中的赭曲霉和青霉屬中的純綠青霉分泌的產(chǎn)物，包含7種結(jié)構(gòu)類似物，OTA是其中之一，它分布最廣且毒性最強(qiáng)，常出現(xiàn)在谷物和谷物衍生產(chǎn)品[6]。目前許多研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AFM1與OTA在食品、飼料中共存的現(xiàn)象[7-10]，這表明人類和動(dòng)物易同時(shí)暴露于AFM1和OTA中，對(duì)健康有著直接或者間接的影響。

物理、化學(xué)、免疫以及微生物屏障共同組成了生物體內(nèi)的腸道屏障，是阻礙霉菌毒素以及其他污染物進(jìn)入機(jī)體的第1道防線[11]。微生物屏障指腸道微生物區(qū)多樣性的相對(duì)穩(wěn)態(tài)，腸道中微生物數(shù)量可達(dá)到宿主體細(xì)胞數(shù)量的10倍，總體基因組數(shù)能達(dá)到150倍[12]。研究表明，腸道微生物的多樣性以及豐度從十二指腸到結(jié)腸末端在逐漸增加[13]，專性厭氧菌對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著至關(guān)重要的作用，如果其穩(wěn)定性遭到破壞，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生系列反應(yīng)，引發(fā)腸道疾病[14]。凡納濱對(duì)蝦攝入被AFB1污染的飼料后導(dǎo)致蝦腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[15]。不同濃度的AFB1灌胃小鼠后，其腸道內(nèi)細(xì)菌多樣性降低[16-17]。先前研究表明，霉菌毒素OTA的攝入會(huì)改變腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，降低有益菌種羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)表達(dá)豐度[18]。這表明霉菌毒素的攝入會(huì)影響到人和動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群的結(jié)構(gòu)、多樣性、豐度等，進(jìn)而破壞腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引發(fā)腸道疾病。近年來，霉菌毒素AFM1與OTA聯(lián)合作用與人們“牛奶+谷物(面包)”的膳食模式息息相關(guān)，AFM1與OTA聯(lián)合攝入對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚，因此研究AFM1與OTA聯(lián)合處理對(duì)小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響具有重要意義。

16S rRNA測(cè)序技術(shù)常被用于細(xì)菌的鑒定和分類，此技術(shù)在霉菌毒素對(duì)腸道微生物多樣性影響的研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，例如范彩云等[19]利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)AFB1、OTA、玉米赤霉烯酮(ZEN)3種毒素的聯(lián)合作用都能對(duì)腸道微生物豐富度帶來不同程度的影響：AFB1+OTA+ZEN>AFB1+OTA>AFB1+ZEN>AFB1。目前國(guó)內(nèi)外研究霉菌毒素對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響多集中于AFB1，對(duì)AFM1的研究較少，本實(shí)驗(yàn)室前期利用AFB1+AFM1飼喂小鼠研究了其對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化[20]，但是單獨(dú)AFM1與OTA處理對(duì)小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響研究報(bào)道相對(duì)較少，另外也未見報(bào)道AFM1與OTA聯(lián)合處理對(duì)腸道微生物區(qū)系影響的研究。綜上所述，為了解析AFM1與OTA對(duì)小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)(不同水平表達(dá)豐度與多樣性)的影響，采用AFM1、OTA單獨(dú)及聯(lián)合灌胃小鼠的反復(fù)攻毒試驗(yàn)，采用16S rRNA對(duì)ICR小鼠結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行微生物多樣性分析，以明確AFM1和OTA單獨(dú)或聯(lián)合處理對(duì)小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

AFM1與OTA粉末均購(gòu)自中國(guó)青島某科技有限公司，純度>99%，1%二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，AFM1與OTA粉末均用1% DMSO溶解，用生理鹽水稀釋至目標(biāo)濃度進(jìn)行灌胃。對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：用341F上游引物和806R下游引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選用48只ICR雄性、4周齡SPF級(jí)別健康小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)于平臺(tái)飼養(yǎng)，過程中嚴(yán)格遵循動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例。飼養(yǎng)條件為：常規(guī)鼠用生長(zhǎng)飼料自由進(jìn)食、自由飲水，環(huán)境溫度(22±1) ℃，濕度(50±5)%，光照與黑暗環(huán)境每12 h交替1次。

1.3 試驗(yàn)處理及樣品采集

小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)期后，正式進(jìn)行毒素灌胃試驗(yàn)。試驗(yàn)分為4組，每組12只，共48只ICR小鼠。毒素灌胃劑量是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期急性毒性經(jīng)口試驗(yàn)確定的[20]，前期研究使用3.5 mg/kg(半數(shù)致死劑量的1/20)AFM1為試驗(yàn)劑量[21-22]。在后期研究中發(fā)現(xiàn)，OTA與AFM1具有相似毒性，所以本試驗(yàn)AFM1與OTA最終采用3.5 mg/kg BW作為試驗(yàn)劑量[23]。對(duì)照組灌胃1% DMSO溶液，AFM1組灌胃3.5 mg/kg BW AFM1，OTA組灌胃3.5 mg/kg BW OTA，AFM1+OTA組灌胃3.5 mg/kg BW AFM1+3.5 mg/kg BW OTA，每只小鼠的灌胃體積均為200 μL，灌胃周期為35 d。第35天灌胃結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死小鼠，立即收集12只小鼠結(jié)腸段于液氮中速凍10 min，接著放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4 結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性檢測(cè)

采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌多樣性進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)結(jié)腸內(nèi)容物基因組DNA試劑盒HiPure Stool DNA Kits(中國(guó)上海信裕生物技術(shù)有限公司)提取樣品中的總DNA，過程參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。DNA濃度和純度的檢測(cè)采用NanoDrop1000儀檢測(cè)，A260/A280比值在1.8～2.0表示DNA質(zhì)量檢測(cè)合格。隨后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用上游引物序列：3′-CCTACGGGNGGCWGCAG-5′；下游引物序列：3′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5′對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：預(yù)變性(95 ℃，3 min)、變性(95 ℃，30 s)、退火(55 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，30 s)，27個(gè)循環(huán)后再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。按照Novaseq 6000系統(tǒng)的PE250平臺(tái)模式(中國(guó)廣州基迪奧生物科技有限公司)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)低質(zhì)量Reads進(jìn)行過濾，然后將雙端Reads拼接為Tag，再對(duì)Tag進(jìn)行低質(zhì)量過濾，得到Clean Tag。接下來基于Clean Tag，使用Usearch軟件進(jìn)行聚類，去除聚類過程中檢測(cè)到的嵌合體Tag，獲得操作分類單元(OTU)的豐度和OTU代表序列。將具有高度相似性(97%)的序列歸為1個(gè)OTU，對(duì)獲得的有效Tag序列進(jìn)行聚類，從而對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物OTU進(jìn)行比較分析。運(yùn)用BLAST比對(duì)程序在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類學(xué)分析，估算出樣品6個(gè)α多樣性值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用單因素方差分析對(duì)各組細(xì)菌群落組成進(jìn)行差異性分析。利用多組組間差異性檢驗(yàn)(Welch’st-test檢驗(yàn))的方法篩選屬水平下不同試驗(yàn)組的差異菌。物種豐度圖和物種堆疊圖用的是R包的GGPLOT2繪制，P<0.05代表顯著差異，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFM1與OTA對(duì)小鼠體重的影響

小鼠在適應(yīng)期結(jié)束后1 d開始對(duì)小鼠進(jìn)行體重稱量，體重變化如表1所示。從表1中可以看出，與對(duì)照組相比，初始體重在AFM1組與OTA組中均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。AFM1組和AFM1+OTA組中小鼠體重顯著下降出現(xiàn)在霉菌毒素處理7 d之后(P<0.05)。灌胃21 d后，相比于對(duì)照組，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組小鼠體重均顯著降低(P<0.05)。灌胃35 d時(shí)，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組小鼠體重均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 AFM1和OTA對(duì)小鼠體重的影響Table 1 Effects of AFM1 and OTA on body weight of mice (n=12) g

2.2 各組間小鼠腸道內(nèi)容物OTU比較分析

由圖1所示，與對(duì)照組相比，AFM1組中有1 032個(gè)共有OTU，特有532個(gè)OTU；OTA組中有1 095個(gè)共有OTU，特有669個(gè)OTU；AFM1+OTA組中有1 065個(gè)共有OTU，特有967個(gè)OTU。這表明AFM1+OTA組比AFM1組、OTA組小鼠腸道微生物變化更加顯著。

圖1 對(duì)照組及試驗(yàn)組OTU韋恩圖Fig.1 Venn analysis of OTU in control group and experimental groups

2.3 各組間小鼠結(jié)腸內(nèi)容物α多樣性分析

由表2可知，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組之間Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)存在顯著性差異(P<0.05)，但是OTA組與AFM1+OTA組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這表明與對(duì)照組相比，小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性在霉菌毒素處理之后都發(fā)生了變化。

表2 霉菌毒素處理對(duì)小鼠結(jié)腸內(nèi)容物α多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effects of mycotoxin treatment on α diversity indexes of colonic contents in mice (n=12)

2.4 各組間小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成分析

由圖2可知，在門水平上，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組與對(duì)照組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成無(wú)顯著差異(P>0.05)，小鼠腸道細(xì)菌群落90%以上為優(yōu)勢(shì)菌群，分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門和疣微菌門。與對(duì)照組相比，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中的厚壁菌門相對(duì)豐度降低，所占比例從50.58%(對(duì)照組)下降到36.87%(AFM1組)、45.93%(OTA組)及39.67%(AFM1+OTA組)；而擬桿菌門相對(duì)豐度增加，所占比例從23.81%(對(duì)照組)上升到41.98%(AFM1組)、29.23%(OTA組)及31.05%(AFM1+OTA組)；變形菌門相對(duì)豐度略有上升，所占比例從7.89%(對(duì)照組)上升到9.09%(AFM1組)、9.79%(OTA組)及11.36%(AFM1+OTA組)。相比于對(duì)照組，AFM1組和OTA組中有2種細(xì)菌相對(duì)豐度降低，分別是藍(lán)細(xì)菌門和疣微菌門，而在AFM1+OTA組中這2種細(xì)菌相對(duì)豐度升高。為進(jìn)一步探究，采用霉菌毒素處理后影響腸道菌群的前20個(gè)門水平上的相對(duì)豐度來制作門水平物種豐度圖，得到圖3。從圖中可以看出，變形菌門在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中相對(duì)豐度增加，而厚壁菌門在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中相對(duì)豐度降低。

Unclassified：未分類的；Other：其他；Chloroflexi：綠屈撓菌門；Patescibacteria：髕骨細(xì)菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Deferribacteres： 脫鐵桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門。圖2 各組小鼠腸道細(xì)菌門水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of intestinal bacteria of mice at phylum level in each group

Bacteroidetes：擬桿菌門；Patescibacteria：髕骨細(xì)菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Kiritimatiellaeota：赤鐵礦菌門；Actinobacteria：放線菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Chlamydiae：衣原體；Firmicutes：厚壁菌門；Chloroflexi：綠屈撓菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Spirochaetes：螺旋體門；Deinococcus-Thermus：異常球菌-棲熱菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌門圖3 各組小鼠腸道細(xì)菌門水平豐度圖Fig.3 Abundance map of intestinal bacteria of mice at phylum level in each group

在科水平上，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組與對(duì)照組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成也無(wú)較大差異，由圖4可知，與對(duì)照組相比，Muribaculaceae在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中相對(duì)豐度均增加，AFM1組顯示相對(duì)豐度最高(33.09%)，高于OTA組(21.88%)和AFM1+OTA組(21.79%)，而乳桿菌科和普雷沃氏菌科相對(duì)豐度在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中均降低。毛螺旋菌科相對(duì)豐度占比無(wú)明顯變化。疣微菌科相對(duì)豐度在對(duì)照組、AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中變化不一致，前2組中相對(duì)豐度無(wú)變化，后2組中相對(duì)豐度增加。為進(jìn)一步探究，采用霉菌毒素處理后影響腸道菌群的前20個(gè)科水平上的相對(duì)豐度來制作門水平物種豐度圖，得到圖5。從圖中可以看出，AFM1+OTA組中相對(duì)豐度增加的細(xì)菌分別是疣微菌科和腸桿菌科。

Unclassified：未分類的；Other：其他；Bacteroidaceae：擬桿菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Rhizobiaceae：根瘤菌科；Akkermansiaceae：艾克曼菌科；Prevotellaceae：普雷沃菌科；Lactobacillaceae：乳桿菌科；Ruminococcaceae：瘤胃菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科。圖4 各組小鼠腸道細(xì)菌科水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal bacteria of mice at famliy level in each group

Rhizobiaceae：根瘤菌科；Erysipelotrichaceae：韋榮球菌科；Bifidobacteriaceae：雙歧桿菌科；Ruminococcaceae：瘤胃菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Akkermansiaceae：艾曼菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Rhodanobacteraceae：羅丹諾桿菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科；Burkholderiaceae：伯克氏菌科；Clostridiaceae_1：梭菌科_1；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Bacteroidaceae：擬桿菌科；Micrococcaceae：微球菌科；Dermabacteraceae：皮桿菌科。圖5 各組小鼠腸道細(xì)菌科水平豐度圖Fig.5 Abundance map of intestinal bacteria of mice at famliy level in each group

由圖6可知，在屬水平上，40～60%為未知菌。與對(duì)照組相比，毛螺菌屬相對(duì)豐度在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中均下降，所占比例從9.13%(對(duì)照組)降至8.07%(AFM1組)、7.88%(OTA組)及7.61%(AFM1+OTA組)，同時(shí)，乳酸菌屬相對(duì)豐度在AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組中也下降，所占比例從14.08%(對(duì)照組)降至7.37%(AFM1組)、7.48%(OTA組)及3.03%(AFM1+OTA組)。艾克曼菌屬相對(duì)豐度在AFM1組和OTA組中下降，但在AFM1+OTA組中上升。為進(jìn)一步探究，采用霉菌毒素處理后影響腸道菌群的前20個(gè)門水平上的相對(duì)豐度來制作門水平物種豐度圖，得到圖7。從圖中可以看出，AFM1+OTA組中，相對(duì)豐度降低的細(xì)菌分別是乳酸菌屬和擬普雷沃菌屬。

Unclassified：未分類的；Other：其他；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌屬_UCG-001；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃氏菌屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌屬NK4A136群。圖6 各組小鼠腸道細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of intestinal bacteria of mice at genus level in each group

Lachnospiraceae_NK4A136_group：毛螺菌屬NK4A136群；Lactobacillus：乳桿菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌屬_UCG-001；Alloprevotella：擬普雷沃氏菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Brachybacterium：短狀桿菌屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃菌科屬_UCG-014；Blautia：勞特氏菌；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9腸道群；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；Oscillibacter：顫桿菌克屬。圖7 各組小鼠腸道細(xì)菌屬水平豐度圖Fig.7 Abundance map of intestinal bacteria of mice at genus level in each group

2.5 各組間小鼠結(jié)腸內(nèi)容物差異菌群篩選結(jié)果分析

采用Welch’st-檢驗(yàn)篩選得到了門、科和屬水平下不同組的差異菌群并對(duì)其進(jìn)行分析(圖8～圖10)，結(jié)果以P<0.05為閾值。

Chloroflexi：綠屈撓菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；BRC1：BRC1門；95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Mean abundance：物種豐度均值；Diff in mean proportions：組間豐度差值。圖8 各組小鼠腸道細(xì)菌門水平差異菌群Fig.8 Difference flora of intestinal bacteria of mice at phyla level in each group

Propionibacteriaceae：丙酸桿菌科；Sphingobacteriaceae：鞘脂桿菌科；Erysipelotrichaceae：韋榮球菌科；95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Mean abundance：物種豐度均值；Diff in mean proportions：組間豐度差值。圖9 各組小鼠腸道細(xì)菌科水平差異菌群Fig.9 Difference flora of intestinal bacteria of mice at family level in each group

Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃菌科屬_UCG-014；Methylobacterium：甲基桿菌屬；Eubacterium_brachy_group：短優(yōu)桿菌屬群；Clostridium_sensu_stricto_1：梭狀芽胞桿菌屬；Candidatus_Saccharimonas：候選單胞生糖菌屬；Brevundimonas：短波單胞菌屬；Eubacterium_coprostanoligenes_group：真桿菌屬群；Vibrio：弧菌屬；Veillonella：韋榮氏球菌屬；Intestinibacter：腸桿菌屬；95% confidence intervals：95%置信區(qū)間；Mean abundance：物種豐度均值；Diff in mean proportions：組間豐度差值。圖10 各組小鼠腸道細(xì)菌屬水平差異菌群Fig.10 Difference flora of intestinal bacteria of mice at genus level in each group

由圖8可知，在門水平，與對(duì)照組相比，AFM1組、OTA組、AFM1+OTA組相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)的細(xì)菌分別為：綠屈撓菌門、酸桿菌門、BRC1門、綠屈撓菌門細(xì)菌。

由圖9可知，在科水平，與對(duì)照組相比，Muribaculaceae和Saccharimonadaceae、韋榮球菌科3種細(xì)菌相對(duì)豐度均顯著增加(P< 0.05)，前2種細(xì)菌相對(duì)豐度的變化出現(xiàn)在AFM1組中，而后1種細(xì)菌相對(duì)豐度的變化出現(xiàn)在OTA組中；丙酸桿菌科、柄桿菌科、鞘脂桿菌科、丙酸桿菌科這4種細(xì)菌相對(duì)表達(dá)豐度均顯著下降(P<0.05)，同樣，前2種細(xì)菌相對(duì)豐度的變化出現(xiàn)在AFM1組中，而后2種細(xì)菌相對(duì)豐度的變化出現(xiàn)在OTA組中；AFM1+OTA組中無(wú)顯著差異細(xì)菌。

由圖10可知，在屬水平，與對(duì)照組相比，AFM1(灌胃3.5 mg/kg BW AFM1)處理后，表達(dá)豐度顯著升高(P<0.05)的細(xì)菌為瘤胃菌科屬_UCG-014、候選單胞生糖菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、和短優(yōu)桿菌屬；表達(dá)豐度顯著降低(P<0.05)的細(xì)菌為甲基桿菌屬和短波單胞菌屬。在OTA組(灌胃3.5 mg/kg BW OTA)中，相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)的細(xì)菌為瘤胃菌科屬、真桿菌屬、短優(yōu)桿菌屬、Family_XIII_AD3011_group。AFM1+OTA(混合灌胃3.5 mg/kg BW AFM1+3.5 mg/kg BWOTA)處理后，相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)的細(xì)菌為梭狀芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、短優(yōu)桿菌屬和韋榮氏球菌屬；相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)的細(xì)菌只有弧菌屬。

3 討 論

近年來隨著研究的不斷深入，腸道菌群與人類健康之間的關(guān)系備受關(guān)注。腸道菌群被證明能夠結(jié)合、轉(zhuǎn)化、降解和轉(zhuǎn)移霉菌毒素[24-26]，許多外部環(huán)境因素影響著其多樣性、形態(tài)結(jié)構(gòu)和豐度[27]，并且在調(diào)節(jié)機(jī)體生理和病理生理的變化中有著不可或缺的作用[28]。健康的腸道微生物可以調(diào)節(jié)腸道感染，維持免疫系統(tǒng)活躍度，在腸道中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[29]。腸道菌群失衡可導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)過度活躍，從而引發(fā)宿主炎癥和自身免疫性疾病[30-31]。目前的研究報(bào)道表明，腸道微生物的變化從某種角度上反映著動(dòng)物是否健康，微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化可能誘發(fā)某些疾病[32-33]。

霉菌毒素?cái)z入機(jī)體后最終會(huì)影響腸道原有的微生物屏障功能。本研究從門、科、屬水平對(duì)各組間小鼠腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成分析可知，AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理并未使小鼠腸道菌群多樣性發(fā)生明顯變化。霉菌毒素組與對(duì)照組相比優(yōu)勢(shì)菌群無(wú)明顯差異，但是霉菌毒素組造成了菌種相對(duì)表達(dá)豐度的變化。門水平上，與對(duì)照組相比，厚壁菌門細(xì)菌在單獨(dú)或聯(lián)合霉菌毒素處理組中相對(duì)表達(dá)豐度均下降，這與小鼠體重下降趨勢(shì)一致。先前研究表明，厚壁菌門相對(duì)豐度的下降與體重有關(guān)[34]，但另外一項(xiàng)研究中，厚壁菌門與擬桿菌門相對(duì)豐度在高體重生長(zhǎng)豬和低體重生長(zhǎng)豬之間無(wú)顯著差異[35]。這表明霉菌毒素處理與體重之間存在聯(lián)系，而本研究結(jié)果顯示霉菌毒素處理之后小鼠體重明顯下降。研究報(bào)道短時(shí)間暴露在ZEN中并未引起腸道菌群結(jié)構(gòu)(多樣性)發(fā)生顯著變化[36]，這與本研究結(jié)果一致。研究報(bào)道，肉雞攝入脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)污染的飼料或用ZEN、DON處理小鼠等，腸道中3種細(xì)菌，如厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門相對(duì)豐度均會(huì)發(fā)生變化，但變化情況不同[37-39]。這些不一致性可能是由于動(dòng)物類型和年齡、霉菌濃度、毒素條件(自然污染或純化粉末)、處理時(shí)間、天氣條件和膳食組成的變化所造成的。在科水平，先前研究報(bào)道短期ZEN暴露明顯引起腸道乳桿菌相對(duì)豐度減少[36]，這與本研究霉菌毒素處理導(dǎo)致乳桿菌科的相對(duì)豐度降低結(jié)果一致。另一研究中表明，小鼠在經(jīng)過DON處理后毛螺旋菌科相對(duì)豐度增加[40]。而本研究中3個(gè)霉菌毒素處理組中毛螺旋菌科相對(duì)豐度未發(fā)生變化，瘤胃球菌科以及腸桿菌科這2種細(xì)菌在小鼠腸道內(nèi)相對(duì)豐度增加。所以，AFM1和OTA這2種霉菌毒素可能會(huì)通過增加致病菌數(shù)量來?yè)p傷小鼠微生物屏障。在屬水平，霉菌毒素處理后會(huì)降低有益菌種相對(duì)豐度，這與前人研究OTA進(jìn)入腸道后會(huì)改變腸道穩(wěn)態(tài)，還會(huì)降低有益菌種相對(duì)豐度[18]結(jié)果一致。但研究報(bào)道OTA在對(duì)大鼠進(jìn)行28 d灌胃后，其腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，乳酸菌屬相對(duì)豐度增加[41]，這與本研究結(jié)果相反。這表明AFM1和OTA這2種霉菌毒素可能會(huì)通過降低益生菌相對(duì)豐度來?yè)p傷小鼠微生物屏障。通過對(duì)各組小鼠腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)的分析可知，無(wú)論是門水平、科水平還是屬水平，與對(duì)照組相比，霉菌毒素處理組并未使腸道微生物多樣性發(fā)生顯著變化，但不同的霉菌毒素處理造成了不同門、科及屬水平菌群相對(duì)豐度的差異變化。

α多樣性指數(shù)常用來反映腸道菌群的多樣性和豐富度。Chao1、Sobs、Ace指數(shù)越大說明腸道菌群的豐富度越高，物種越豐富，而Simpson指數(shù)則反映的是多樣性，其值越大說明群落多樣性越低，Shannon指數(shù)剛好相反。對(duì)本試驗(yàn)中48個(gè)樣本的α多樣性分析結(jié)果表明，雖然AFM1與OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理未顯著影響小鼠腸道微生物群落豐富度和多樣性，但與對(duì)照組相比，小鼠腸道細(xì)菌相對(duì)豐度有增加趨勢(shì)。研究表明，黃曲霉毒素會(huì)導(dǎo)致原生動(dòng)物瘤胃菌群失調(diào)，從而對(duì)纖維素利用率、揮發(fā)性脂肪酸含量、酶活性等產(chǎn)生影響，最終會(huì)影響奶牛的產(chǎn)奶量和進(jìn)食量[42]，因此，推測(cè)AFM1與OTA聯(lián)合處理可能是通過腸道微生物來影響動(dòng)物健康的。在本試驗(yàn)中，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在不同組間差異性均不顯著，這可能與本試驗(yàn)采用霉菌毒素處理時(shí)間相關(guān)，因?yàn)槟c道菌群在腸道中的定植需要較長(zhǎng)一段時(shí)間。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，利用16S rRNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，雖然AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理并未使小鼠腸道菌群總體豐度和多樣性明顯發(fā)生變化，但在菌群總體相對(duì)豐度上，AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理在門、科、屬水平上存在差異。AFM1和OTA單獨(dú)及聯(lián)合處理增加了影響小鼠腸道健康的致病菌相對(duì)豐度，降低了保護(hù)小鼠腸道健康的益生菌相對(duì)豐度，從而改變了腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步損傷腸道微生物屏障，這表明AFM1和OTA這2種霉菌毒素可能破壞了小鼠腸道微生物屏障。