王紅明 丁雪婧 陳 儉 宋守鋼 譚北平,2 章 雙,2*

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088；2.農(nóng)業(yè)部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524088)

寡糖，又稱低聚糖，是一種具有2～20個(gè)糖單位的碳水化合物，糖單位間通過(guò)糖苷鍵連接而成。孫青云等[5]研究表明，寡糖能降低動(dòng)物腸道pH、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)動(dòng)物腸道內(nèi)健康微生物菌群形成和提高動(dòng)物機(jī)體免疫力。而甘露寡糖(mannan-oligosaccharides，MOS)作為一類從酵母細(xì)胞壁提取出來(lái)的葡萄糖-甘露寡糖蛋白復(fù)合物，能參與多種生物功能和多種生理過(guò)程，具有吸附病原菌的功能[6]。在家禽[7]和仔豬[8]等動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖可通過(guò)提高機(jī)體腸道的微生態(tài)狀況，減少胃腸道疾病，從而提高動(dòng)物免疫功能。甘露寡糖作為綠色添加劑在水產(chǎn)動(dòng)物研究較為廣泛，可以提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，優(yōu)化腸道菌群，促進(jìn)腸道發(fā)育，提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能，在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[9]、大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)[10]、奧尼羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus×Oreochromisaureus)[11]、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[12]、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[13]、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[14]等物種的養(yǎng)殖中均有應(yīng)用。甘露寡糖在水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖中的積極作用已被廣泛證實(shí)，但是大多從動(dòng)物生長(zhǎng)性能、生理生化和組織形態(tài)改變等宏觀層面進(jìn)行考察，利用高通量測(cè)序技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組和腸道菌群方面對(duì)甘露寡糖功能進(jìn)行的研究還不多見(jiàn)。

高通量測(cè)序已經(jīng)成為一種常規(guī)的試驗(yàn)技術(shù)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)錄水平和腸道菌群分析等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)利用高通量測(cè)序來(lái)全面快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息和表達(dá)信息，準(zhǔn)確地分析基因表達(dá)差異、結(jié)構(gòu)變異和分子標(biāo)記等生命科學(xué)的重要問(wèn)題[15]?；?6S rRNA基因高通量測(cè)序已成為動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成及多樣性分析的常用技術(shù)[16]。在水產(chǎn)動(dòng)物中，高通量測(cè)序也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組和腸道菌群分析，用以研究生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫等相關(guān)生命活動(dòng)的作用機(jī)制[17-18]。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和腸道菌群分析已被用于石斑魚(yú)生長(zhǎng)調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)的作用機(jī)制研究。王登東等[19]和張海艷等[20]采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分別分析了云龍石斑魚(yú)雜交生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)形成的機(jī)制和β-葡聚糖調(diào)節(jié)魚(yú)類免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制。Ye等[21-22]采用16S rRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)了花生粕和脫酚棉籽蛋白對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)生長(zhǎng)和腸道健康的影響作用。

甘露寡糖已被用于石斑魚(yú)養(yǎng)殖中。Ren等[23]從免疫相關(guān)酶活性、免疫相關(guān)基因表達(dá)、腸道切片以及生長(zhǎng)性能等方面研究珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)，結(jié)果表明飼料中添加甘露寡糖料不能改善珍珠龍膽石斑魚(yú)幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能和飼料利用率，但可以通過(guò)改善腸道形態(tài)完整性、增強(qiáng)抗氧化能力和非特異性免疫、增加免疫相關(guān)基因表達(dá)、降低腸道和肝臟中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腸道健康和維持免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，多種魚(yú)類消化道內(nèi)某些細(xì)菌能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白質(zhì)水解酶、脂肪分解酶等胞外酶，用以促進(jìn)魚(yú)類消化脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，進(jìn)而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率[18]。目前為止，利用高通量測(cè)序分析甘露寡糖對(duì)石斑魚(yú)影響的研究暫未有報(bào)道?；诖耍狙芯窟x取珍珠龍膽石斑魚(yú)為研究對(duì)象，研究飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能、血清免疫指標(biāo)、轉(zhuǎn)錄組及腸道菌群的影響，以探究甘露寡糖調(diào)控珍珠龍膽石斑魚(yú)免疫的作用機(jī)理，為水產(chǎn)飼料行業(yè)尋求替代抗生素的物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料

以魚(yú)粉、豆粕、玉米蛋白粉為主要蛋白質(zhì)源，以魚(yú)油、玉米油為主要脂肪源，配制基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，甘露寡糖組在基礎(chǔ)飼料中添加100 mg/kg甘露寡糖。甘露寡糖購(gòu)自青島某生物技術(shù)有限公司，甘露寡糖添加量參照于朝磊等[9]、Ren等[23]、徐磊等[24]的研究。試驗(yàn)飼料具體制作及營(yíng)養(yǎng)成分分析方法參照本實(shí)驗(yàn)室Ye等[22]、Liu等[25]的研究。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content預(yù)混料 Premix1.00誘食劑 Attractant0.15磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.50維生素C Vitamin C0.20氯化膽堿 Choline chloride0.50抗氧化劑 Antioxidant0.05合計(jì) Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels粗蛋白質(zhì) Crude protein50.18粗脂肪 Crude lipid 11.63

每千克預(yù)混料含 One kg premix contained the following: VA 675 000 IU，VD3180 000 IU，VE 6 000 mg，VK31 200 mg，VB1900 mg，VB21 350 mg，VB61 050 mg，VB127.5 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 4 500 mg，煙酸 nicotinic acid 6 750 mg，葉酸 folic acid 375 mg，生物素 biotin 15 mg，維生素C磷酸酯 vitamin C phosphate 42 860 mg，肌醇 inositol 10 000 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 64 286 mg，ZnSO4·H2O 26 283 mg，MnSO4·H2O 19 688 mg，Ca(IO3)2·H2O 128.6 mg，CoCl2·6H2O 323 mg，CuSO4·5H2O 2,357 mg，Na2SeO387.6 mg。

1.2 試驗(yàn)用魚(yú)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用魚(yú)來(lái)源于湛江市南三島商業(yè)養(yǎng)殖基地，購(gòu)回后于4.5 m×4.9 m×1.8 m的室外水泥池暫養(yǎng)2周，以適應(yīng)試驗(yàn)條件。試驗(yàn)在玻璃鋼桶(0.5 m3)中進(jìn)行，挑選240尾初始平均體重為(6.00±0.32) g的體質(zhì)健壯無(wú)病的幼魚(yú)，隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾魚(yú)，養(yǎng)殖8周。養(yǎng)殖過(guò)程中，每天分別于08:00和17:00按照魚(yú)體重的3%～5%進(jìn)行飽食投喂2次(第1顆飼料沉入桶底未被攝食視為飽食)，投喂量依據(jù)攝食情況和天氣變化調(diào)整。具體養(yǎng)殖條件為：水體溫度28～30 ℃，鹽度21%～24%，溶氧量≥6.8 mg/L。每天按照換養(yǎng)殖水體1/3的水量換水1次。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)用魚(yú)在養(yǎng)殖期結(jié)束后禁食24 h。記錄存活尾數(shù)、體重和體長(zhǎng)，以進(jìn)行生長(zhǎng)性能分析。從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取8尾魚(yú)，丁香酚麻醉后采用尾靜脈取血法抽取全血，每尾魚(yú)抽取1 mL后混合。按照海水魚(yú)淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：P9980，北京索萊寶科技有限公司始)說(shuō)明書進(jìn)行操作，得到血細(xì)胞和血清樣品，于-80 ℃保存待測(cè)。其中，對(duì)照組和甘露寡糖組中3個(gè)重復(fù)的血細(xì)胞樣品分別混合后用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每組中每個(gè)重復(fù)的血清樣品分別用于免疫指標(biāo)測(cè)定。另外，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取4尾魚(yú)，取剝離腸道外脂肪組織的后腸混合成為1個(gè)樣品，置于液氮后于-80 ℃保存待測(cè)，用于腸道菌群測(cè)定。

1.4 生長(zhǎng)性能分析

選用存活率(survival rate，SR)、增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR)、肥滿度(condition factor，CF)、飼料系數(shù)(feed coefficient rate，F(xiàn)CR)作為生長(zhǎng)性能指標(biāo)，參照Ye等[22]和Liu等[25]的研究，分別按以下公式計(jì)算：

SR(%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；
WGR(%)=100×(終末總重-
初始總重)/初始總重；
SGR(%/d)=100×(ln終末總重-
ln初始總重)/飼喂天數(shù)；
CF(g/cm3)=100×魚(yú)體重/魚(yú)體長(zhǎng)度3;
FCR=攝入飼料干重/(終末總重+
死亡個(gè)體總重-初始總重)。

1.5 血清免疫指標(biāo)分析

選用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、溶菌酶(lysozyme，LZM)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)作為血清免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。血清SOD、CAT、ACP、AKP、LZM活性和MDA含量分別采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的SOD(產(chǎn)品編號(hào)：A001-3-2)、CAT(產(chǎn)品編號(hào)：A007-1-1)、ACP(產(chǎn)品編號(hào)：A060-2-1)、AKP(產(chǎn)品編號(hào)：A059-2-2)、LZM(產(chǎn)品編號(hào)：A050-1-1)、MDA(產(chǎn)品編號(hào)：A003-1-2)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.6 血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

采用TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))提取樣品總RNA后，委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序工作，建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina HiSeqTM進(jìn)行測(cè)序。去除測(cè)序接頭和低質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后，采用Trinity Assembly Software軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接并聚類，取最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為非重復(fù)序列基因(Unigene)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和統(tǒng)計(jì)。所有Unigene分別在6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，其中包括Nr、KEGG、Swissprot和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)。利用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)和log2差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)來(lái)進(jìn)行篩選，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。對(duì)基因進(jìn)行定量和差異分析，取差異顯著的基因用于KEGG和GO富集分析。

1.7 腸道菌群分析

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

如表2所示，甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚(yú)的終末體重、WGR、SGR和CF均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。甘露寡糖組和對(duì)照組之間珍珠龍膽石斑魚(yú)的FCR和SR無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary MOS on growth performance of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3)

2.2 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響

如表3所示，與對(duì)照組相比，甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚(yú)的血清SOD、CAT、LZM和AKP活性均顯著升高(P<0.05)，血清MDA含量顯著降低(P<0.05)。甘露寡糖組和對(duì)照組之間珍珠龍膽石斑魚(yú)的血清ACP活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary MOS on serum immune indices of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3)

2.3 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

2.3.1 血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和序列組裝

利用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，如表4所示，除去銜接子并過(guò)濾了低質(zhì)量序列后留下了高質(zhì)量堿基(clean bases)合計(jì)為14 462 786 068 nt。從原始讀長(zhǎng)(raw reads)濾過(guò)后得到97 715 428個(gè)高質(zhì)量讀長(zhǎng)(clean reads)。其中，對(duì)照組從47 953 578個(gè)原始讀長(zhǎng)中產(chǎn)生了46 493 708個(gè)高質(zhì)量讀長(zhǎng)，甘露寡糖組從52 713 580個(gè)原始讀長(zhǎng)中產(chǎn)生了51 221 720個(gè)高質(zhì)量讀長(zhǎng)。

表4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 4 Transcriptome sequencing data statistics

如表5所示，通過(guò)Trinity軟件組裝獲得總長(zhǎng)度為74 614 602 nt，Unigene總數(shù)為79 291個(gè)，Unigene平均長(zhǎng)度為941 bp，N50長(zhǎng)度為2 141 bp，N90長(zhǎng)度為318 bp。

表5 轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of transcriptome assembly data

進(jìn)一步對(duì)Unigene做質(zhì)量評(píng)估，作長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)圖，如圖1所示，長(zhǎng)度小于1 000 bp的Unigene較集中分布在2 700～2 999 nt區(qū)間；長(zhǎng)度大于1 000 bp的Unigene有63 455個(gè)，占總數(shù)80.03%。組裝結(jié)果表明測(cè)序質(zhì)量良好。

圖1 Unigene序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)Fig.1 Unigene sequence length statistics

2.3.2 Unigene功能注釋

如圖2所示，通過(guò)對(duì)組裝的測(cè)序結(jié)果分析，一共注釋到28 811個(gè)Unigene，占比36.34%。其中，在Nr、KEGG、Swissprot和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋到28 664、14 866、19 668和16 506個(gè)Unigene。將組裝獲得的Unigene在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示注釋最多的5個(gè)物種分別為大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)(6 381個(gè)，22.26%)、盲曹魚(yú)(Latescalcarifer)(6 335個(gè)，22.10%)、斑馬魚(yú)(Stegastespartitus)(2 493個(gè)，8.70%)、革首南極魚(yú)(Nototheniacoriiceps)(1 578個(gè)，5.51%)和尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)(1 128個(gè)，3.94%)。

圖2 轉(zhuǎn)錄組中Unigene的注釋 Fig.2 Annotation of Unigene from transcriptome

如圖3所示，KOG注釋結(jié)果顯示，32 518個(gè)Unigene聚類被分為25個(gè)功能類別。Unigene在一般功能預(yù)測(cè)(general function prediction only)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(singnal transduction)和翻譯后藥物、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶(posttranslational medication, protein turnover, chaperones)3個(gè)功能類別中富集最多，含有Unigene數(shù)目分別為6 347、6 108和3 129個(gè)，分別占比19.52%、18.78%和9.62%。其中，富集于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(cell motility)功能上的Unigene最少，只有88個(gè)。

圖3 KOG聚類分析圖Fig.3 KOG cluster analysis diagram

如圖4所示，通過(guò)Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息，分別有17 795、7 625和9 745個(gè)Unigene注釋到參與到生物過(guò)程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組成(cell component)中。在生物過(guò)程一類中，Unigene主要注釋到細(xì)胞過(guò)程(cell process)和新陳代謝過(guò)程(metabolic process)，分別有4 026和3 557個(gè)Unigene。在分子功能一類中，Unigene主要注釋到催化活性(catalytic activity)(2 988個(gè)Unigene)和結(jié)合(binding)，分別有2988和3 499個(gè)Unigene。在細(xì)胞組成一類中，Unigene主要注釋到細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)，均有2 130個(gè)Unigene。

圖4 Unigene的GO分類Fig.4 GO classification of Unigene

根據(jù)KEGG注釋信息可知，總共6 912個(gè)Unigene注釋到5個(gè)特定的通路中，包括生物系統(tǒng)(organism system)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、遺傳信息處理(genetic information processing)、代謝(mentabolism)和細(xì)胞過(guò)程。

2.3.3 差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)分析

以FDR<0.05且|log2FC|>1為條件篩選甘露寡糖組和對(duì)照組之間DEG，結(jié)果如圖5所示，一共鑒定出9 964個(gè)DEG，包含3 801個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和6 163個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。

橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示FDR的負(fù)Log10值。The abscissa represented the logarithm value of difference multiple, and the ordinate represented the negative log10 value of FDR.圖5 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.5 Volcano map of DEG

DEG的GO功能富集分析結(jié)果如圖6所示，分別有5 592、3 131和5 274個(gè)Unigene注釋到參與的生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能中。在生物過(guò)程一類中，富集到細(xì)胞過(guò)程的DEG數(shù)目最多(72.59%顯著下調(diào))，其次為新陳代謝過(guò)程、單一生物代謝過(guò)程。在細(xì)胞組成一類中，富集到膜和膜部分中的DEG數(shù)目最多，其中膜有53.85%顯著下調(diào)，膜部分有47.34%顯著下調(diào)。在分子功能一類中，富集到結(jié)合中的DEG數(shù)目最多，有66.98%顯著下調(diào)。

圖6 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Fig.6 GO functional enrichment analysis of DEG

DEG的KEEG富集分析如圖7所示，共有741個(gè)DEG被注釋到171個(gè)通路中，甘露寡糖和對(duì)照組之間差異最大的20條KEGG富集通路中，與新陳代謝有關(guān)且差異顯著的信號(hào)通路有11個(gè)，分別為煙酸與煙酰胺代謝(nicotinate and nicotinamide metabolism)、精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)、微生物在不同環(huán)境中的代謝(microbial metabolism in diverse environments)、泛酸與CoA生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、初級(jí)膽汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、芳香族化合物的降解(degradation of aromatic compounds)、D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝(D-glutamine andD-glutamate metabolism)、亞油酸代謝(linoleic acid metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、初級(jí)膽汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)。與免疫有關(guān)且差異顯著的信號(hào)通路有4個(gè)，分別為吞噬體(phagosome)、細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)(intestinal immune network for IgA production)。其中，吞噬體和細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路為顯著富集DEG數(shù)目最多的2條信號(hào)通路，含有DEG數(shù)目分別為52和46個(gè)。此外，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路中顯著富集的DEG數(shù)目有34個(gè)，免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路中顯著富集的DEG數(shù)目有13個(gè)。

圖7 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEG

2.4 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群的影響

2.4.1 珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群多樣性分析

珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群α多樣性分析如表6所示，甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群的OTU數(shù)量、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，甘露寡糖組和對(duì)照組之間Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表6 珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群α多樣性分析Table 6 Alpha diversity analysis of intestinal microflora of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3)

基于加權(quán)Bray-Curtis距離進(jìn)行的PCoA如圖8所示，2個(gè)PCoA軸占2組之間變異的80.09%。甘露寡糖組在圖的下方，靠近主坐標(biāo)(PCo1)，占總變化的71.52%。β多樣性分析結(jié)果表明不同處理可顯著影響腸道菌群的組成。

圖8 主坐標(biāo)分析Fig.8 PCoA

2.4.2 腸道菌群組成

珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道門水平菌群組成如圖9所示，在門水平上，對(duì)照組和甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道中的菌群組成相同，包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，四者總相對(duì)豐度都超過(guò)了98%，還有部分未鑒定出及相對(duì)豐度極少的門類。不同門類菌群在2組中相對(duì)豐度有差異，甘露寡糖組中變形菌門相對(duì)豐度小于對(duì)照組，而擬桿菌門、藍(lán)藻門、厚壁菌門相對(duì)豐度高于對(duì)照組，其中，甘露寡糖組擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

A：?jiǎn)蝹€(gè)樣品中菌群相對(duì)豐度；B：不同組中菌群的平均相對(duì)豐度；C：優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度比較。*代表與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。下表同。A: microflora relative abundance of single sample; B: microflora mean relative abundance of indifferent groups; C: comparison of dominant microflora relative abundance. * mean significant difference compared with the control group (P<0.05). The same as below.圖9 珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道門水平菌群組成Fig.9 Intestinal microflora composition at phylum level of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus

如圖10所示，在屬水平上，對(duì)照組和甘露寡糖組珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道中菌群組成相同，包括無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)。與對(duì)照組相比，甘露寡糖組中發(fā)光桿菌屬相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)，而德沃斯氏菌屬、鹽單胞菌屬和甲基桿菌屬相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。

圖10 珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道屬水平菌群組成Fig.10 Intestinal microflora composition at genus level of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus

3 討 論

3.1 飼料中添加甘露聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

基于國(guó)內(nèi)外研究，飼料中添加甘露寡糖對(duì)畜禽類動(dòng)物幼體有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[8,26]。而飼料中添加適宜的甘露寡糖是否能夠有效促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能尚存在較大的爭(zhēng)議[23]。Lu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加不同水平的甘露寡糖可提高草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)幼魚(yú)終末體重和WGR。馬志紅等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1 g/kg甘露寡糖添能顯著提高鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)的WGR，降低FCR。高瞻[29]研究表明，飼料中添加甘露寡糖可以降低花鱸(Lateolabraxjaponicas)機(jī)體水分含量，同時(shí)提高機(jī)體粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量，有效改善魚(yú)肉的品質(zhì)，提高WGR，降低FCR。本試驗(yàn)中，飼料中添加100 mg/kg甘露寡糖顯著提高了珍珠龍膽石斑魚(yú)的終末體重、WGR、SGR和CF，但對(duì)SR和FCR無(wú)顯著影響。但是，Ren等[23]在飼料中添加甘露寡糖的研究表明，添加0.3%～2.0%的甘露寡糖對(duì)龍虎斑的生長(zhǎng)性能均無(wú)顯著影響，這可能與甘露寡糖的添加量有直接關(guān)系，0.3%～2.0%的甘露寡糖添加量與其他研究相比，明顯高出許多?？傮w而言，上述研究表明，盡管養(yǎng)殖品種有所差異，飼料中添加適量的甘露寡糖可顯著提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。

3.2 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響

SOD可催化氧自由基對(duì)過(guò)氧化氫和分子氧的歧化作用，提高吞噬細(xì)胞防御功能，在動(dòng)物機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中起重要作用[30]。LZM是一種水解N-乙酰壁酸和N-乙酰葡糖胺的酶，是生物體內(nèi)重要的免疫因子之一，已在魚(yú)類組織、血清和黏液中發(fā)現(xiàn)，并且大量存在于血細(xì)胞中。AKP是一種非特異性磷酸水解酶，可催化磷酸單脂的水解，促進(jìn)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在動(dòng)物代謝中發(fā)揮重要調(diào)控作用[31]。CAT可清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，是一種保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整的酶類[32]。甘露寡糖具有抗原的特性，能夠刺激動(dòng)物機(jī)體做出免疫應(yīng)答反應(yīng)[30]。本試驗(yàn)中，飼料中添加甘露寡糖顯著提高了珍珠龍膽石斑魚(yú)血清中SOD、AKP、LZM和CAT活性。與本試驗(yàn)結(jié)果一致的是，飼料中添加甘露寡糖顯著提高半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)稚魚(yú)體內(nèi)SOD、CAT和LZM活性，提高腸道發(fā)育和非特異性免疫水平[9]；飼料中添加0.2%～0.3%魔芋甘露寡糖可以顯著增強(qiáng)黃顙魚(yú)血清SOD和LZM活性，增加其免疫器官指數(shù)[33]；楊敏等[14]在飼料中添加適宜的甘露寡糖，可顯著提高歐洲鰻鱺血清SOD、AKP、LZM活性。劉愛(ài)君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露寡糖能顯著提高奧尼羅非魚(yú)血清SOD和AKP活性。MDA是一種有害物質(zhì)，其含量的升高是氧自由基過(guò)多產(chǎn)生的一種反應(yīng)，損害細(xì)胞膜的流動(dòng)性，MDA含量降低表明對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性降低。此外，在本研究中，甘露聚糖組珍珠龍膽石斑魚(yú)血清MDA含量較對(duì)照組顯著降低，這與Lu等[27]在草魚(yú)中的研究結(jié)果一致。上述研究都表明飼料中添加甘露寡糖能在一定程度提高動(dòng)物機(jī)體的免疫相關(guān)酶活性，從而提高動(dòng)物免疫功能。

3.3 飼料中添加甘露聚糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響

轉(zhuǎn)錄組研究可基于特定條件下基因的表達(dá)信息來(lái)推測(cè)未知基因的功能，進(jìn)而揭示基因在相應(yīng)通路中的作用機(jī)制。在魚(yú)類中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已被廣泛應(yīng)用，主要用途包括檢測(cè)基因功能、篩選DEG及開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記等。例如張海艷等[20]對(duì)β-葡聚糖刺激下斜帶石斑魚(yú)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，獲得了DEG以及免疫相關(guān)條目，并篩選出部分顯著性差異表達(dá)的免疫基因。石立冬等[34]研究?；撬釋?duì)紅鰭東方鲀的熱應(yīng)激調(diào)控的影響，獲得了DEG的數(shù)據(jù)以及DEG注釋的具體通路，為研究牛磺酸對(duì)紅鰭東方鲀的熱應(yīng)激調(diào)控的影響和?；撬峥箲?yīng)激功能提供參考數(shù)據(jù)。朱婷芳等[35]對(duì)大彈涂魚(yú)單核巨噬細(xì)胞低氧脅迫比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，獲得了不同時(shí)間巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并且篩選出了相關(guān)DEG。珍珠龍膽石斑魚(yú)作為重要的海水養(yǎng)殖品種，其全基因序列還未公布，從基因水平研究飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)免疫保護(hù)機(jī)制存在限制。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，鑒定出DEG顯著影響了魚(yú)體細(xì)胞組成、細(xì)胞代謝過(guò)程和分子功能等方面，這些改變暗示了細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)與功能可能發(fā)生了重大改變。本研究中發(fā)現(xiàn)具有最多Unigene的條目是結(jié)合、催化活性、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和細(xì)胞組成，這些過(guò)程對(duì)機(jī)體正常生命活動(dòng)很重要。此外，KEEG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，DEG被注釋到171個(gè)通路中，與免疫緊密相關(guān)的吞噬體通路、細(xì)胞黏附因子通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路以及免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)通路差異顯著，且顯著富集的DEG數(shù)目較多，其中吞噬體通路和細(xì)胞黏附因子通路是顯著富集DEG數(shù)目最多的2條信號(hào)通路，這些結(jié)果提示甘露寡糖的添加對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)的免疫功能產(chǎn)生了顯著影響。吞噬體是通過(guò)吞噬固有免疫細(xì)胞攝取顆粒而形成的高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，在微生物清除和抗原呈遞中發(fā)揮關(guān)鍵作用[36]。細(xì)胞黏附分子是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱，以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生等重要生理病理過(guò)程的分子基礎(chǔ)[37]。細(xì)胞因子是指主要由免疫細(xì)胞分泌的小分子多肽，具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長(zhǎng)等多種功能，其發(fā)揮作用是通過(guò)與靶細(xì)胞膜表面的受體相結(jié)合并將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部而完成的，在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[38]。由此可見(jiàn)，飼料中添加甘露寡糖調(diào)控珍珠龍膽石斑魚(yú)的免疫功能的可能機(jī)制是甘露寡糖的攝入激活魚(yú)體內(nèi)免疫細(xì)胞中吞噬體的產(chǎn)生，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞黏附分子信號(hào)通路將信號(hào)傳遞，刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子，起到免疫調(diào)節(jié)作用。這一機(jī)制在單胃動(dòng)物的研究中已被提出[39]，但在魚(yú)類中還有待進(jìn)一步證實(shí)。

3.4 飼料中添加甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群的影響

腸道本身具有重要的功能，腸道微生物的作用也不可忽視，腸道有益菌群具有營(yíng)養(yǎng)、免疫、抑制病原菌、定植阻抗等作用[40]，而有害菌會(huì)使黏膜層滲透性增加，讓病原和食物大分子穿過(guò)黏膜屏障[41]。腸道微生物對(duì)魚(yú)類的健康也發(fā)揮重要作用。在斑馬魚(yú)(Daniorerio)中，腸道微生物可以調(diào)節(jié)消化道基因的表達(dá)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)代謝和免疫反應(yīng)[42]。在人類及其他哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物蛇[43]和蜥蜴[44]、青石斑魚(yú)[45]腸道菌群中，厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，其中的大部分細(xì)菌參與了食物的消化和代謝。本研究中，飼料中添加甘露寡糖后，珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道中擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著升高。擬桿菌門和厚壁菌門是人類腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)有益菌，結(jié)合本研究中甘露寡糖對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)免疫的促進(jìn)作用可知，飼料中添加甘露寡糖可能通過(guò)提高珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道中有益菌的相對(duì)豐度進(jìn)而使其免疫功能得到提高，這一結(jié)果與譚蓉等[46]的研究結(jié)果中腸道炎癥伴隨著擬桿菌門相對(duì)豐度的下降相吻合。飼料中添加甘露寡糖后珍珠龍膽石斑魚(yú)腸道菌群在屬水平上相對(duì)豐度的變化也進(jìn)一步說(shuō)明了這一點(diǎn)。與對(duì)照組相比，甘露寡糖組石斑魚(yú)腸道中發(fā)光桿菌屬相對(duì)豐度顯著下降，而德沃斯氏菌屬、鹽單胞菌屬和甲基桿菌屬相對(duì)豐度顯著升高。發(fā)光桿菌屬屬于弧菌科，由弧菌屬細(xì)菌引起的疾病是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大的細(xì)菌性疾病[47]。德沃斯氏菌屬、鹽單胞菌屬和甲基桿菌屬則是3種已知的益生菌[48]。類似地，王琨等[49]、何遠(yuǎn)法等[50]和張琴等[51]分別在牙鲆、對(duì)蝦凡納濱和刺參中研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露寡糖可顯著降低腸道弧菌的數(shù)量。綜合而言，本研究結(jié)果表明甘露寡糖可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡來(lái)提高珍珠龍膽石斑魚(yú)免疫功能，該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相吻合，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，免疫球蛋白A產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)相關(guān)信號(hào)通路被顯著激活，這也為深入研究甘露寡糖提高魚(yú)類免疫力的作用機(jī)制提供了重要參考。

4 結(jié) 論

飼料中添加100 mg/kg甘露寡糖可以改善珍珠龍膽石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能和腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高機(jī)體免疫功能，并在轉(zhuǎn)錄組水平產(chǎn)生有利的免疫應(yīng)答效應(yīng)。