彭 凱 蕭鴻發(fā) 莫文艷 王國霞* 黃燕華

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣州 510640；2.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣州 510640;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣州 510225)

魚粉資源匱乏及價格居高不下是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的限制因素，當前亟待尋求新的飼料原料以替代魚粉。在過去十幾年時間里，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)移到昆蟲資源，其中黑水虻(Hermetiaillucens)倍受世界關(guān)注。黑水虻屬于雙翅目水虻科昆蟲，其幼蟲(干物質(zhì)基礎(chǔ))含有35%～40%蛋白質(zhì)和35%～40%脂肪，且富含月桂酸、抗菌肽、幾丁質(zhì)等活性物質(zhì)，是理想的動物飼料原料。黑水虻與魚粉有較為相似的必需氨基酸模式[1]，因此，黑水虻是替代魚粉的良好選擇。大量研究表明，當基礎(chǔ)飼料中魚粉含量為10%～30%，黑水虻幼蟲粉部分或完全替代魚粉不影響水產(chǎn)動物的生長性能[2-12]。盡管多數(shù)研究已經(jīng)評價了黑水虻幼蟲粉替代魚粉對水產(chǎn)動物生長性能的影響，但對動物新陳代謝和機體健康的影響研究仍相當缺乏。

黑水虻幼蟲粉替代魚粉對水產(chǎn)動物機體健康既有積極影響又有消極影響。胡俊茹等[6]報道，黑水虻幼蟲粉替代50%魚粉可增加花鱸魚體脂肪沉積，損傷肝臟和腸道組織結(jié)構(gòu)。Hu等[5]研究表明，黑水虻幼蟲粉替代20%魚粉顯著增加了黃顙魚血漿球蛋白和一氧化氮含量，損害動物肝功能。Li等[13]報道，脫脂黑水虻幼蟲粉替代75%魚粉可顯著提高建鯉抗氧化能力，但損害了腸道組織結(jié)構(gòu)，增加了魚體氧化應(yīng)激。Xiao等[10]研究表明，黑水虻幼蟲粉100%替代魚粉不但不影響黃顙魚生長性能，還能提高血清超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，增強動物機體免疫力。胡俊茹等[14]報道，黑水虻幼蟲粉替代15%～20%魚粉可顯著增強凡納濱對蝦幼蝦血清抗氧化酶活性，提高對蝦抗氧化狀態(tài)。然而，Wang等[11]報道，脫脂黑水虻幼蟲粉替代64%魚粉不影響花鱸肝臟和腸道組織結(jié)構(gòu)，對血清免疫指標也無顯著影響。相似地，Wang等[12]研究表明，脫脂黑水虻幼蟲粉替代60%魚粉不影響凡納濱對蝦血清抗氧化能力和免疫力。以上研究結(jié)果之間的差異可能歸因于試驗動物、黑水虻來源、添加劑量、試驗條件的不同。黑水虻幼蟲粉替代魚粉對動物健康的影響及作用機理有待進一步研究。

加州鱸(Micropterussalmoides)是近年來興起的優(yōu)質(zhì)淡水魚品種，其生長速度快、發(fā)病率低、養(yǎng)殖密度大、經(jīng)濟價值高，因為肉質(zhì)鮮美，深受消費者青睞。本試驗旨在研究飼料中添加黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清代謝物、抗氧化與免疫指標及腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，旨在為黑水虻幼蟲粉替代魚粉及其在加州鱸養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗飼料組成及營養(yǎng)水平如表1所示，其中黑水虻幼蟲粉來源于廣州某生物科技有限公司，營養(yǎng)成分含量如下：粗蛋白質(zhì)36%、粗脂肪38%、粗灰分13%、幾丁質(zhì)6%?；A(chǔ)飼料G0中魚粉含量為45%，在G0基礎(chǔ)上添加黑水虻幼蟲粉，按重量比例分別替代7.5%(G7.5)、15.0%(G15.0)、22.5%(G22.5)和30.0%(G30.0)魚粉，共配制5種等氮等脂飼料。所有飼料原料經(jīng)粉碎并全部通過60目標準篩，混合均勻后通過雙螺桿擠壓機型制成2.0 mm顆粒料，經(jīng)55 ℃烘干，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

本試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究中心養(yǎng)殖基地進行。魚苗購于佛山市三水白金水產(chǎn)種苗有限公司，于水泥池中暫養(yǎng)7 d。選擇初始體重為(4.9±0.1) g的健康加州鱸魚苗525尾，隨機分為5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)35尾，以重復(fù)為單位隨機分配到15個養(yǎng)殖缸(容積為350 L)，每組投喂1種試驗飼料，養(yǎng)殖周期為62 d。采取飽食投喂方式，每天于08:00和18:00各投喂1次，記錄飼料投喂量、魚苗死亡情況及水質(zhì)情況。試驗期間保持自然光照，水溫27～30 ℃，溶解氧濃度>6.0 mg/L，氨氮濃度<0.10 mg/L，亞硝酸鹽濃度<0.01 mg/L，pH 7.6～7.9。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，先禁食24 h，隨后采集樣品。每缸隨機取10尾魚，采用40 mg/L的MS-222麻醉劑以浸浴的方式麻醉，然后使用1 mL注射器于尾靜脈取血，每缸血液樣品混合，于室溫下靜置2 h，3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，分離的血清置于-80 ℃中保存，用于血清代謝物、抗氧化與免疫指標的分析。每缸隨機取4尾魚，解剖后分離出腸道，取1 cm中腸置于4%福爾馬林固定液中保存48 h，然后制備石蠟組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，顯微鏡下觀察腸絨毛形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

采用日立7600生化分析儀測定血清代謝物含量。血清抗氧化及免疫指標包括：總抗氧化能力(T-AOC，比色法)、超氧化物歧化酶(SOD，羥胺法)、過氧化氫酶(CAT，鉬酸銨法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx，比色法)、酸性磷酸酶(ACP，分光光度法)、堿性磷酸酶(AKP，比色法)、溶菌酶(LZM，比濁法)活性及丙二醛(MDA，硫代巴比妥酸法)、補體3(C3，免疫比濁法)含量，選用南京建成生物工程研究所的商業(yè)試劑盒并參照說明書步驟分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

首先對試驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若滿足方差齊性，則采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比較法分析差異顯著性。若不滿足方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗法進行多重比較。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤的形式表示，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清代謝物含量的影響

由表2可知，與G0組相比，G22.5和G30.0組血清總蛋白和球蛋白含量顯著升高(P<0.05)，膽固醇含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低(P<0.05)，G15.0、G22.5和G30.0組血清白蛋白含量顯著升高(P<0.05)，G30.0組血清高密度脂蛋白膽固醇含量顯著升高(P<0.05)。各組間血清白蛋白/球蛋白以及低密度脂蛋白膽固醇、尿素氮、葡萄糖含量與谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著差異(P>0.05)。

表2 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清代謝物含量的影響Table 2 Effects of fishmeal replaced by black soldier fly larvae meal on serum metabolites contents of Microptenus salmoides

2.2 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清抗氧化指標的影響

由表3可知，與G0組相比，G7.5、G15.0、G22.5和G30.0組血清谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著升高(P<0.05)。各組間血清總抗氧化能力、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性及丙二醛含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清抗氧化指標的影響Table 3 Effects of fishmeal replaced by black soldier fly larvae meal on serum antioxidant indexes of Microptenus salmoides

2.3 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清免疫指標的影響

由表4可知，與G0組相比，G15.0、G22.5和G30.0組血清酸性磷酸酶活性顯著升高(P<0.05)，G7.5、G15.0、G22.5和G30.0組血清補體3含量顯著升高(P<0.05)。各組間血清堿性磷酸酶和溶菌酶活性無顯著差異(P>0.05)。

表4 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清免疫指標的影響Table 4 Effects of fishmeal replaced by black soldier fly larvae meal on serum immune indexes of Microptenus salmoides

2.4 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，與G0組相比，G7.5～G30.0組腸道組織有不同程度的損傷，表現(xiàn)為腸絨毛長度縮短，形態(tài)萎縮，結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，且隨著黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例升高，腸道組織損傷越嚴重。

圖1 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色)Fig.5 Effects of fishmeal replaced by black soldier fly larvae meal on intestinal histological appearance of Microptenus salmoides (HE stain, 200×)

3 討 論

3.1 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清代謝物含量的影響

本研究前期報道了黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸生長性能的影響，結(jié)果表明，黑水虻幼蟲粉替代30%魚粉可顯著增加加州鱸的飼料系數(shù)和腸體比，降低蛋白質(zhì)效率和肝體比，并抑制全魚中粗灰分和鈣的沉積[15]，導(dǎo)致加州鱸的生長性能下降。然而，黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清代謝物含量的影響仍未見報道。血清代謝物水平通常反映魚體健康程度及對營養(yǎng)與環(huán)境因素的適應(yīng)狀況[16]。本試驗研究了黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清代謝物含量的影響，結(jié)果表明飼料中適量添加黑水虻幼蟲粉可顯著增加加州鱸血清白蛋白、球蛋白及高密度脂蛋白膽固醇含量，說明黑水虻幼蟲粉替代魚粉損傷了加州鱸的肝功能，并干擾了脂肪代謝，這些變化可能是導(dǎo)致加州鱸生長性能下降的原因之一。血清白蛋白在肝臟內(nèi)合成，主要用于修補組織和提供能量，反映肝臟功能的損傷程度；血清球蛋白是由B細胞轉(zhuǎn)化成漿細胞后分泌的，反映機體的抵抗力。白蛋白與球蛋白含量升高通常與機體代謝紊亂或者肝功能和腎功能損傷有關(guān)[17]。研究表明，黑水虻幼蟲粉替代20%魚粉顯著增加了花鱸[6]和黃顙魚[5]血漿中球蛋白的含量，本研究結(jié)果與之相似。然而，另有研究報道，黑水虻幼蟲粉部分或完全替代魚粉并不影響魚類血液中白蛋白和球蛋白的含量[11,13,18]。張放等[19]研究表明，飼料中添加25%黑水虻幼蟲粉顯著降低了生長豬血清白蛋白含量。而即使是同一物種，如黃顙魚，Hu等[5]和陳曉瑛等[18]的研究結(jié)果也不一致。以上不同研究結(jié)果之間的差異可能歸因于動物品種、黑水虻來源、添加劑量、不同試驗條件等影響因素。

血清膽固醇主要由肝臟合成和供給，因此其含量變化反映肝臟脂肪代謝的功能。研究表明，飼料中添加黑水虻幼蟲粉能夠明顯降低不同水產(chǎn)動物的血清膽固醇含量，如黃顙魚[20]、花鱸[11]、歐洲鱸[8]、建鯉[13]和南美白對蝦[12]。本試驗結(jié)果表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉顯著降低加州鱸血清膽固醇含量，這與前人研究結(jié)果一致。黑水虻幼蟲粉對膽固醇含量的降低效應(yīng)至今原因不明，一方面可能歸因于飼料中n-3不飽和脂肪酸含量的下降，因為飼料中添加黑水虻幼蟲粉可降低n-3不飽和脂肪酸含量[12]，而n-3不飽和脂肪酸被發(fā)現(xiàn)能夠抑制膽固醇生成及體內(nèi)脂肪沉積[21]；另一方面可能歸因于黑水虻蟲粉中含有的幾丁質(zhì)，因為幾丁質(zhì)已被發(fā)現(xiàn)能夠降低魚類膽固醇含量[22]，主要歸因于幾丁質(zhì)與脂質(zhì)微粒結(jié)合從而干擾膽固醇的吸收[23]。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是與細胞損傷或應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的指標，正常情況下存在于細胞內(nèi)，不易穿過細胞膜屏障；而當細胞損傷或存在應(yīng)激反應(yīng)時，細胞膜通透性升高使其得到快速釋放，導(dǎo)致血液中酶的活性升高[23]。Li等[13]報道，黑水虻幼蟲粉100%替代魚粉并不影響建鯉血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性。Xu等[24]在黑水虻蟲漿飼喂鏡鯉的試驗中得到相似結(jié)果。本試驗結(jié)果表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉顯著降低加州鱸血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，但不影響谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，具體原因有待進一步研究。

3.2 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸血清抗氧化和免疫指標的影響

血清抗氧化指標是衡量機體抗氧化狀態(tài)的主要參考依據(jù)。本試驗結(jié)果表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉顯著增加了血清谷胱甘肽過氧化物酶活性，證明飼料中添加黑水虻幼蟲粉可增加加州鱸抗氧化能力。相似的結(jié)論也在花鱸[11]、建鯉[7,13]、黃顙魚[10]、凡納濱對蝦[12,14]和鏡鯉[25]上進行了報道。Ural等[25]報道，谷胱甘肽過氧化物酶催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為水，在過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物的還原中起重要作用，被認為是一種有效的脂質(zhì)過氧化保護酶。飼料中添加黑水虻幼蟲粉提高加州鱸血清谷胱甘肽過氧化物酶活性的原因可能是由于幾丁質(zhì)的作用。黑水虻幼蟲外殼中含有幾丁質(zhì)[26]，其含量在黑水虻幼蟲粉中高達5.42%[27]。幾丁質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗氧化作用效果[28-29]。

酸性磷酸酶是一種參與磷酸基轉(zhuǎn)移和代謝的水解酶，反映機體的免疫功能狀態(tài)[30]。有文獻報道，酸性磷酸酶活性受膳食營養(yǎng)水平的影響[31]。補體3是血清中含量最高的補體成分，主要由巨噬細胞和肝臟合成，血清中補體3含量升高表示機體組織損傷或炎癥反應(yīng)增強。本試驗結(jié)果表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉顯著增加了血清酸性磷酸酶活性及補體3含量，證明飼料中添加黑水虻幼蟲粉可提高加州鱸免疫力，這可能與黑水虻本身含有的免疫活性物質(zhì)有關(guān)，如幾丁質(zhì)、抗菌肽等。Xiao等[10]研究表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉顯著提高了黃顙魚免疫力，主要歸因于幾丁質(zhì)和抗菌肽的作用。飼料中添加幾丁質(zhì)可提高金頭鯛、虹鱒等魚類的非特異性免疫力，激活巨噬細胞活性[32]。Dong等[33]報道，鯉魚飼料中添加抗菌肽可顯著增強機體免疫力。

本試驗結(jié)果表明，飼料中添加黑水虻幼蟲粉替代魚粉導(dǎo)致加州鱸血清中谷胱甘肽過氧化物酶和酸性磷酸酶活性升高以及補體3含量升高的原因也可能歸因于加州鱸對腸道氧化損傷的一種生理反應(yīng)或生理應(yīng)對策略。從腸道切片觀察，飼料中添加黑水虻幼蟲粉對加州鱸腸道造成一定程度的氧化損傷，從而誘導(dǎo)血清谷胱甘肽過氧化物酶和酸性磷酸酶活性升高以及補體3含量升高，具體作用機理有待進一步深入研究。此外，加州鱸血清抗氧化和免疫指標的增加也說明機體氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，這可能是黑水虻幼蟲粉替代魚粉導(dǎo)致加州鱸生長性能下降的另一個原因。

3.3 黑水虻幼蟲粉替代魚粉對加州鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道組織結(jié)構(gòu)通常用來評價飼料對動物腸道健康的影響。黑水虻幼蟲粉替代魚粉對動物腸道組織結(jié)構(gòu)的影響已在花鱸[6,11]、建鯉[13]、鏡鯉[25]、斑馬魚[34]和虹鱒[9,35]等水產(chǎn)動物上進行了報道，但仍未見其對加州鱸的影響效果如何。本試驗結(jié)果表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉不同程度地損傷了加州鱸腸道組織結(jié)構(gòu)，且隨著黑水虻幼蟲粉替代魚粉比例的增加，腸道組織損傷程度越嚴重，這與Wang等[11]在花鱸和Li等[13]在建鯉上的研究結(jié)論一致。胡俊茹等[6]研究表明，黑水虻幼蟲粉替代魚粉顯著降低了花鱸腸道絨毛長度、絨毛寬度和固有層厚度，破壞了腸道組織結(jié)構(gòu)。黑水虻幼蟲粉替代魚粉損傷加州鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的原因可能歸因于黑水虻含有的幾丁質(zhì)，因為過量的幾丁質(zhì)可誘導(dǎo)腸道炎癥反應(yīng)，從而破壞腸道組織結(jié)構(gòu)的完整性[6,36]。相反，另有研究表明，飼料中添加黑水虻幼蟲粉部分或完全替代魚粉，并不影響虹鱒的腸道組織結(jié)構(gòu)[9,35]，這可能是由于試驗動物對象和黑水虻幼蟲粉添加量不同的原因?qū)е碌??？偠灾?，飼料中添加黑水虻幼蟲粉應(yīng)當控制好劑量，避免過量添加對魚類腸道組織結(jié)構(gòu)的損傷，從而影響動物的生長和健康。

4 結(jié) 論

飼料中添加黑水虻幼蟲粉替代魚粉(基礎(chǔ)飼料中魚粉含量為45%)增加了加州鱸血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、高密度脂蛋白膽固醇和補體3的含量，提高了血清谷胱甘肽過氧化物酶和酸性磷酸酶活性，降低了血清膽固醇含量和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，且不同程度地損傷了加州鱸腸道組織結(jié)構(gòu)，建議飼料中應(yīng)當謹慎添加。