王 棟 杜垣逸 鄭 鐸 尤振東 劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室，哈爾濱 150030)

犢牛腹瀉發(fā)病率高，且容易繼發(fā)感染呼吸道疾病，是造成犢牛生長遲緩和死亡的主要原因之一，給奶牛養(yǎng)殖造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。生產(chǎn)上主要使用抗生素防控犢牛腹瀉，雖然抗生素可以有效緩解犢牛腹瀉，提高犢牛的生長性能，但由于抗生素的耐藥性和殘留問題越來越受到社會的關注[2]，此外，我國也已經(jīng)全面停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料。因此，尋找合適的抗生素替代品便成為當前研究的熱點。

凹凸棒土(palygorskite，PAL)，又名坡縷石，是一種硅鎂鋁酸鹽粘土礦物質，廣泛存在于自然界，其特有的層狀晶體結構賦予其良好的吸附性、離子交換性、流變性、脫色性以及粘性等理化特性[3]。在動物生產(chǎn)上，PAL具有促進動物機體新陳代謝，提高飼料轉化率，提高抗氧化能力，改善機體免疫狀態(tài)和抑制致病菌定植的作用[4]。研究表明，飼糧中添加PAL可以有效地吸附黃曲霉毒素，緩解黃曲霉毒素對仔豬和肉雞的損傷[5]。Zhang等[6]的研究表明，飼糧中添加2 000 mg/kg的PAL能降低斷奶仔豬的斷奶應激，改善腸道屏障功能，降低腹瀉率，提高生長性能。此外，Qiao等[7]的研究還發(fā)現(xiàn)PAL具有調節(jié)蛋雞盲腸微生物菌群的作用。目前，PAL的研究主要集中在豬、肉雞和蛋雞，尚缺乏對犢牛的相關研究。因此，本研究以荷斯坦犢牛為研究對象，通過在飼糧中添加PAL研究其對犢牛生長性能、腹瀉率、血清生化指標和腸道菌群的影響，為PAL在犢牛生產(chǎn)中的合理應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用PAL中凹凸棒含量≥75%，膨潤土含量≤25%，鎂含量<4%，水分含量≤18%，粒度為60目。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在黑龍江省尚志市現(xiàn)代牧業(yè)進行。選取健康的初生犢牛30頭，采用單因素完全隨機試驗設計，隨機分為2個組，每個組15個重復，每個重復1頭牛。犢牛于出生后2 h內(nèi)灌服初乳4 L。第2～21天，飼喂常乳，每天2次(08:00、16:30)，每次3 L。第22～31天，飼喂代乳粉，每天2次(08:00、16:30)，每次4.5 L。第32天至斷奶，飼喂代乳粉，每天2次(08:00、16:30)，每次5 L。代乳粉主要成分含量：乳糖≥40%，蛋白質≥22%，脂肪≥19%，水分≤4.0%，粗灰分≤8.0%，粗纖維≤0.3%。代乳粉用37 ℃溫水稀釋(150 g/L)后飼喂。犢牛出生后第3天開始添加開食料，其中對照組飼喂基礎飼糧，PAL組飼喂基礎飼糧+2 000 mg/kg PAL，自由采食和飲水。基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。PAL的使用劑量參考Zhang等[6]的研究結果。試驗期63 d，分3個階段：飼喂牛乳階段(1～21日齡)，飼喂代乳粉階段(22～56日齡)和斷奶后1周(57～63日齡)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 樣品采集與指標檢測

1.3.1 生長性能和腹瀉率

準確稱量犢牛初生體重并在犢牛21、56和63日齡晨飼前空腹稱重，計算犢牛的平均日增重(ADG)。試驗期間準確記錄犢牛的采食量，計算犢牛平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。根據(jù)Wen等[8]的方法進行糞便評分(0=堅固，1=黏稠度疏松或適中，2=非常松散或輕度腹瀉，3=水樣稀便)，糞便評分≥2，連續(xù)2 d或以上定義為腹瀉，記錄犢牛腹瀉天數(shù)和腹瀉頭數(shù)，計算腹瀉率。

腹瀉率(%)=[腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)/
(試驗頭數(shù)×試驗天數(shù))]×100。

1.3.2 血清生化指標

犢牛分別于21、56和63日齡晨飼前進行頸靜脈采血，離心后制備血清。采用全自動生化儀檢測犢牛血清總蛋白(TP)濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法在全自動生化儀上檢測檢測血清免疫球蛋白[免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)]、炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)]、生長激素(GH)、胰島素樣生長因子(IGFs)濃度。犢牛血清抗氧化指標[總超氧化物歧化酶(T-SOD)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)濃度]采用分光光度計法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 腸道菌群

分別于21、56和63日齡晨飼前無菌采集犢牛直腸糞便，采用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測犢牛直腸糞便中菌群的組成，具體操作參考焦金真等[9]的方法。采用TIANamp Stool DNA Kit試劑盒提取直腸糞便總細菌DNA，用ND-1000分析儀檢測DNA的濃度和純度。首先將提取的總細菌DNA分別與不同濃度總細菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、大腸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌和乳酸菌的標準質粒進行qPCR檢測，將標準質粒濃度和Ct值做回歸分析，繪制標準曲線。然后將樣品Ct值帶入回歸方程計算目標菌屬DNA拷貝數(shù)，結果用每克內(nèi)容物中細菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)[lg(拷貝數(shù)/g)]表示。PCR所用引物見表2。

表2 微生物的特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences for microbes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行整理，采用軟件SPSS 20.0的獨立樣本t檢驗進行組間試驗數(shù)據(jù)分析，P<0.05時為差異顯著，P<0.01時為差異極顯著。結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示。

2 結 果

2.1 飼糧中添加PAL對犢牛生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL可顯著提高1～21日齡犢牛的ADG(P<0.05)，顯著增加1～21日齡和57～63日齡犢牛的ADFI(P<0.05)；飼糧中添加PAL增加了22～56日齡和57～63日齡犢牛的ADG，但差異不顯著(P>0.05)；在整個試驗期間，與對照組相比，飼糧中添加PAL對犢牛的F/G無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中添加PAL對犢牛生長性能的影響Table 3 Effects of PAL supplementation on growth performance of calves

2.2 飼糧中添加PAL對犢牛糞便評分和腹瀉率的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL可顯著降低1～21日齡和57～63日齡犢牛的糞便評分(P<0.05)，對22～56日齡犢牛的糞便評分無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加PAL在不同階段均降低了犢牛的腹瀉率，其中1～21日齡和57～63日齡犢牛的腹瀉率顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 飼糧中添加PAL對犢牛糞便評分和腹瀉率的影響Table 4 Effects of PAL supplementation on fecal score and diarrhea incidence of calves

2.3 飼糧中添加PAL對犢牛血清TP、GH、IGFs以及免疫球蛋白濃度的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL對各日齡犢牛血清TP、GH、IGFs的濃度均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛血清IgA、IgM以及56日齡犢牛血清IgG和63日齡犢牛血清IgA的濃度(P<0.05)。

表5 飼糧中添加PAL對犢牛血清TP、GH、IGFs和免疫球蛋白濃度的影響Table 5 Effects of PAL supplementation on serum TP, GH, IGFs and immunoglobulin concentrations of calves

續(xù)表5項目 Items日齡 Days of age組別 Groups對照 Control凹凸棒土 PALP值 P-value免疫球蛋白AIgA/(μg/mL)2164.04±1.91b75.55±3.86a0.0445666.01±3.1382.28±6.490.0876367.55±2.22b82.58±3.83a0.028免疫球蛋白GIgG/(μg/mL)21895.35±30.251164.58±35.810.12156860.91±56.81b1219.63±50.83a0.03663956.23±52.201195.91±59.530.119免疫球蛋白MIgM/(μg/mL)2166.81±5.01b82.01±2.15a0.0495669.20±5.3280.21±9.830.3816378.44±6.0298.95±10.100.228

2.4 飼糧中添加PAL對犢牛血清炎癥因子濃度和抗氧化指標的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛血清IL-4的濃度(P<0.05)，顯著降低了63日齡犢牛血清TNF-α和IL-6的濃度(P<0.05)。與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了63日齡犢牛血清GSH-Px的活性和T-AOC(P<0.05)，顯著降低了63日齡犢牛血清MDA的濃度(P<0.05)。

表6 飼糧中添加PAL對犢牛血清炎癥因子濃度和抗氧化指標的影響Table 6 Effects of PAL supplementation on serum inflammation cytokine concentrations and antioxidant indexes of calves

2.5 飼糧中添加PAL對犢牛腸道菌群的影響

由表7可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛腸道總菌以及63日齡犢牛腸道雙歧桿菌和芽孢桿菌的數(shù)量(P<0.05)，顯著降低了21和63日齡犢牛腸道大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05)，對犢牛腸道乳酸菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量沒有顯著影響(P>0.05)。

表7 飼糧中添加PAL對犢牛腸道菌群的影響Table 7 Effects of PAL supplementation on intestinal microflora of calves lg(拷貝數(shù)/g)

3 討 論

3.1 飼糧中添加PAL對犢牛生長性能和腹瀉率的影響

犢牛腹瀉是犢牛的多發(fā)疾病，也是世界各地養(yǎng)牛企業(yè)生產(chǎn)力和經(jīng)濟損失的主要原因。2007年美國乳制品國家動物健康監(jiān)測系統(tǒng)的報告指出，半數(shù)未斷奶犢牛的死亡歸因于腹瀉[13]。因此，對腹瀉的有效防控是犢牛生產(chǎn)管理中的一項重要議題。研究發(fā)現(xiàn)，PAL不但能夠改善飼糧的適口性，促進動物機體新陳代謝和提高飼料轉化率，而且還具有吸除腸道毒素，提高腸道屏障完整性和維持腸道微生態(tài)平衡的作用[14]。對泌乳奶牛的研究表明，飼糧中添加PAL能顯著提高泌乳奶牛的產(chǎn)奶量和牛乳中蛋白質的含量，且無毒副作用[15]。在斷奶仔豬[16]和肉雞[17]的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL可顯著提高生長性能且與抗生素促生長劑的差異不顯著。此外，Su等[18]的研究表明，飼糧中添加PAL能通過增加肉雞空腸和回腸的絨毛高度以及黏蛋白2(MUC2)、閉鎖連接蛋白-1(ZO-1)和緊密連接蛋白2(Claudin2)的mRNA和蛋白表達提高腸道屏障的功能，降低腹瀉率，提高生長性能。Lv等[19]的研究也表明，飼糧中添加2 000 mg/kg的PAL能顯著降低斷奶仔豬的糞便評分和腹瀉率，提高生長性能。目前，對PAL的研究主要集中于仔豬和肉雞，缺乏對犢牛的相關研究。本研究通過在犢牛飼糧中添加2 000 mg/kg的PAL發(fā)現(xiàn)，添加PAL不但顯著提高了1～21日齡犢牛的ADG和ADFI，而且顯著降低了1～21日齡犢牛的糞便評分和腹瀉率。綜合前人和本研究的結果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL有提高動物生長性能和降低腹瀉率的作用。在本研究中犢牛ADG和ADFI的提高可能與降低了腹瀉率有關，而腹瀉率的降低可能與PAL提高了犢牛的腸道屏障功能和抑制大腸桿菌等有害菌的生長、維持正常的腸道微生態(tài)平衡有關。

3.2 飼糧中添加PAL對犢牛血清生化指標的影響

PAL的抗炎和免疫調節(jié)作用已被廣泛報道。免疫球蛋白是反映機體免疫功能的重要指標，主要包括IgG、IgM、IgA，由淋巴細胞和漿細胞分泌產(chǎn)生，是機體抵御疾病、防范感染的重要屏障[20]。因此，血清中免疫球蛋白的濃度與犢牛的免疫力密切相關。此外，炎癥因子在免疫調節(jié)和炎癥反應中也發(fā)揮重要作用，IL-6和TNF-α由單核巨噬細胞和Th1細胞分泌，主要起促發(fā)炎癥的作用，是應激性損傷的直接介導物，IL-4和IL-10由Th2細胞分泌，可減輕炎癥反應，在激活局部及全身抗體應答中起關鍵作用[21]。研究表明，飼糧中添加PAL不僅可以提高肉雞的ADG，還能夠提高肉雞血清IgA、IgG、IgM的濃度和降低肉雞血清和腸道IL-6、TNF-α、白細胞介素-8(IL-8)和干擾素-γ(IFN-γ)的濃度，調節(jié)免疫和炎癥反應[22]。Zhang等[6]對斷奶仔豬的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結果。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛血清IgA、IgM、IL-4和56日齡犢牛血清IgG的濃度，顯著降低了63日齡犢牛血清IL-6和TNF-α的濃度，與以上研究結果一致。綜上所述，飼糧中添加PAL能通過提高動物機體的免疫功能和降低炎癥反應維持機體的健康狀態(tài)。動物機體免疫功能的提高和炎癥反應的降低有利于抵抗應激，這可能也是PAL組犢牛ADG增加和腹瀉率降低的原因之一。

機體細胞內(nèi)環(huán)境隨著生物代謝的進行會產(chǎn)生超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等活性氧簇，當累積超過一定限度，便會對細胞產(chǎn)生毒害作用，通常情況下，自由基的產(chǎn)生、利用和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當過多的自由基無法被清除時，就會引起機體氧化損傷[23-24]。因此，抗氧化能力是維持機體健康的重要因素。血清GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC均可反映機體的抗氧化能力，MDA是細胞膜脂質過氧化的產(chǎn)物，其濃度能反映體內(nèi)自由基的含量和細胞的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，63日齡犢牛血清MDA的濃度高于21和56日齡犢牛，推測這可能與斷奶對犢牛造成了應激有關，相較于對照組，PAL組63日齡犢牛血清GSH-Px的活性和T-AOC顯著提高，而MDA的濃度則顯著降低，這表明飼糧中添加PAL可改善犢牛由于斷奶而產(chǎn)生的氧化應激反應。Zhou等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2%的PAL能顯著提高肉雞血清和空腸T-AOC，降低MDA的濃度。此外，對斷奶仔豬的研究也表明，飼糧中添加PAL能顯著降低血清和小腸中過氧化氫、MDA和機體內(nèi)自由基等的濃度[15]。綜上可知，飼糧中添加PAL能通過提高抗氧化酶活性和降低氧化終產(chǎn)物濃度提高動物機體抗氧化應激的能力。

3.3 飼糧中添加PAL對犢牛腸道菌群的影響

穩(wěn)定的腸道菌群對犢牛的生長、健康和免疫功能至關重要。犢牛由于胃腸道尚未完全發(fā)育，為病原菌在腸道內(nèi)定植提供了有利條件，導致腹瀉等腸道相關疾病的發(fā)生，其中大腸桿菌是誘發(fā)犢牛腹瀉的主要原因之一[26]。雙歧桿菌、芽孢桿菌、乳酸菌等腸道有益菌能通過競爭營養(yǎng)物質和位點，產(chǎn)生多黏菌素和短桿菌肽等生物活性物質抑制病原菌的入侵和定植，保護腸道免受損傷[27-28]。Qiao等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL可以通過增加蛋雞盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量有益調節(jié)腸道菌群結構。此外，Yao等[29]的研究表明，喂服PAL能有效防治鼠沙門氏菌感染引起的小鼠腹瀉。這與本研究的結果類似，本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，PAL組1～21日齡和57～63日齡犢牛的糞便評分和腹瀉率顯著降低，PAL組21和63日齡犢牛腸道大腸桿菌的數(shù)量也顯著降低，而63日齡犢牛腸道有益菌雙歧桿菌和芽孢桿菌的數(shù)量則顯著增加。因此，我們推測PAL降低犢牛腹瀉的原因可能與腸道大腸桿菌數(shù)量的減少和雙歧桿菌、芽孢桿菌數(shù)量的增加有關。以上結果表明PAL在維持腸道微生態(tài)平衡和機體健康方面具有有益的作用。

4 結 論

本試驗條件下，飼糧中添加2 000 mg/kg PAL能提高荷斯坦犢牛的ADG(1～21日齡)，提高血清免疫球蛋白濃度和抗氧化應激能力，降低炎癥反應，促進腸道有益菌和抑制大腸桿菌的生長，降低腹瀉率。