令狐克川 王 超 張瑞強(qiáng) 陳躍平 溫 超 周巖民
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095)
維生素E是一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的酚類(lèi)化合物,具有多種生物學(xué)功能,可通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)自由基而提高機(jī)體抗氧化能力,有效預(yù)防或減輕機(jī)體氧化損傷[1]。此外,維生素E還可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體信號(hào)通路增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力,發(fā)揮防治疾病的作用[2]。維生素E是蛋雞必需的脂溶性維生素,飼糧中添加適量維生素E可改善蛋雞生產(chǎn)性能和抗氧化能力,提高生產(chǎn)效率[3]。由于蛋雞品種、生長(zhǎng)階段、飼糧組成和飼養(yǎng)條件等的不同,飼糧中維生素E的推薦量不盡相同[4]。維生素E有合成和天然2種類(lèi)型,天然維生素E是從植物油精煉過(guò)程得到的脫臭餾出物中提取制得,含有α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚8種類(lèi)似物,其中α-生育酚含量最高,活性也最高[5]。而合成維生素E通常以三甲基氫醌等石油化工副產(chǎn)物為原料通過(guò)縮合反應(yīng)制備而成,主要成分是α-生育酚[6]。維生素E的合成工藝已相對(duì)成熟,其價(jià)格也較天然維生素E便宜,所以飼料中應(yīng)用的主要是合成維生素E。但與合成維生素E相比,天然維生素E具有更高的生物活性和吸收利用率[7]。研究表明,飼糧中添加28 IU/kg合成維生素E可以提高蛋雞生產(chǎn)性能和雞蛋品質(zhì)[8]。Cheng等[9]報(bào)道,飼糧中添加維生素E可以顯著提高肉仔雞的抗氧化功能和肌肉品質(zhì),且天然維生素E的效果優(yōu)于合成維生素E。吳迪[10]研究報(bào)道,飼糧中添加天然維生素E可以提高蛋雞產(chǎn)蛋率、血清生殖激素水平及雞蛋品質(zhì)。飼糧中添加150 mg/kg維生素E能有效提高蛋雞抗體效價(jià),提高機(jī)體免疫力[11]。在蛋雞產(chǎn)蛋后期,因雌激素水平下降而導(dǎo)致其產(chǎn)蛋率降低,維生素E可通過(guò)調(diào)節(jié)垂體前葉分泌促性腺激素而提高蛋雞繁殖能力[12]。研究已證實(shí),維生素E能提高蛋雞產(chǎn)蛋高峰期的生產(chǎn)性能及雞蛋品質(zhì)[3],但有關(guān)維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期的影響則鮮見(jiàn)報(bào)道。天然維生素E在提高蛋雞生產(chǎn)性能、抗氧化能力和改善蛋品質(zhì)方面比合成維生素E效果更佳[10]。因此,本試驗(yàn)旨在探討飼糧中添加天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能、維生素E沉積、抗氧化功能和雞蛋品質(zhì)的影響,以期為天然維生素E在蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)中的合理應(yīng)用和提高蛋雞生產(chǎn)效率提供參考依據(jù)。
本試驗(yàn)用天然維生素E產(chǎn)品(總生育酚含量≥30%,其中,α-生育酚含量為60%,β-生育酚含量為1%,γ-生育酚含量為37.5%,δ-生育酚含量為1.5%;其余70%為白炭黑和糊精)購(gòu)于江西某生命科學(xué)有限公司。
選取270只66周齡的海蘭褐蛋雞,隨機(jī)分成3組,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧(含合成維生素E 30 IU/kg),試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為42 d?;A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)在南京康欣禽業(yè)有限公司進(jìn)行。所有蛋雞飼養(yǎng)在同一雞舍的3層階梯籠中,自由采食和飲水,每天16 h連續(xù)光照。記錄試驗(yàn)蛋雞每天的產(chǎn)蛋數(shù)、產(chǎn)蛋量和死淘情況。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %
分別于試驗(yàn)第21天和第42天從每重復(fù)隨機(jī)選取3個(gè)雞蛋用于雞蛋品質(zhì)測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),于每重復(fù)中隨機(jī)挑選1只體重相近且健康狀態(tài)良好的蛋雞進(jìn)行屠宰。將蛋雞分別稱(chēng)重后,采用頸靜脈采血法收集血液于10 mL離心管中,并于4 ℃、3 500 r/min條件下離心10 min,將血清分裝于0.5 mL離心管中保存在-20 ℃冰箱待測(cè)。待雞死亡后剖開(kāi)腹腔,用自封袋收集肝臟保存于-20 ℃冰箱待測(cè),用潔凈載玻片刮取空腸黏膜于無(wú)菌凍存管中,用液氮速凍并保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。
1.4.1 生產(chǎn)性能
分別以重復(fù)為單位記錄每天的產(chǎn)蛋數(shù)和產(chǎn)蛋量,并統(tǒng)計(jì)各重復(fù)蛋雞試驗(yàn)期間的耗料量,計(jì)算產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。
1.4.2 維生素E沉積量
血清、肝臟和蛋黃中的維生素E含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定,測(cè)定方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.4.3 抗氧化指標(biāo)
肝臟和空腸黏膜的過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以及丙二醛(MDA)含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定,測(cè)定方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.4.4 抗氧化基因表達(dá)
根據(jù)Wen等[13]描述的方法,使用RNAiso試劑(大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司)從空腸黏膜中提取總RNA。用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度,根據(jù)濃度計(jì)算出稀釋至0.5 μg/μL所需要的焦炭酸二乙酯(DEPC),將其稀釋后用PrimeScript RT試劑盒(大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行總RNA的反轉(zhuǎn)錄。通過(guò)37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s的反轉(zhuǎn)錄程序得到cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參,根據(jù)GenBank已登錄的mRNA,用Primier Premier 5.0軟件對(duì)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、Kech樣ECH結(jié)合蛋白1(Keap1)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸:醌氧化還原酶1(NQO1)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶1(GSH-Px1)的引物設(shè)計(jì)參考張相倫[14]。GenBank登錄號(hào)、正向和反向引物的序列示于表2中。
表2 引物序列Table 2 Primer sequences
使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司)在ABI 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)中對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行mRNA定量。PCR反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s,最終解離階段95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。用內(nèi)參值進(jìn)行校正,使用2-ΔΔCt方法分析相對(duì)于對(duì)照組計(jì)算的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
1.4.5 雞蛋品質(zhì)
采用蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀測(cè)定蛋殼強(qiáng)度,多功能蛋品檢測(cè)儀測(cè)定蛋重、哈夫單位、蛋白高度和蛋黃顏色,螺旋測(cè)微器測(cè)定蛋殼厚度,精密電子天平測(cè)定蛋黃和蛋殼重量。計(jì)算蛋黃、蛋殼和蛋清指數(shù)公式如下:
蛋黃指數(shù)(%)=(蛋黃重量/雞蛋重量)×100;
蛋殼指數(shù)(%)=(蛋殼重量/雞蛋重量)×100;
蛋清指數(shù)(%)=[(雞蛋重量-蛋黃重量-
蛋殼重量)/雞蛋重量]×100。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行初步整理,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行多重比較,以P<0.05為顯著差異,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
由表3可知,天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比,基礎(chǔ)飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E使蛋雞產(chǎn)蛋率分別提高了4.13%和3.01%,平均日采食量分別提高了2.15%和1.75%;基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg/kg天然維生素E使平均蛋重略有提高,料蛋比有所降低。
表3 天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期生產(chǎn)性能的影響Table 3 Effects of natural vitamin E on performance of laying hens during late laying period
由表4可知,與對(duì)照組相比,飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可顯著提高蛋雞血清中維生素E含量(P<0.05);飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E均可顯著提高蛋雞肝臟中維生素E含量(P<0.05);飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E提高了蛋雞蛋黃中維生素E含量,分別提高了18.10%和9.10%,但差異不顯著(P>0.05)。
表4 天然維生素E對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血清、肝臟、蛋黃中維生素E含量的影響Table 4 Effects of natural vitamin E on content of vitamin E in serum, liver and yolk of laying hens during late laying period
由表5可知,與對(duì)照組相比,飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E均可顯著提高空腸黏膜GSH-Px活性(P<0.05);飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可顯著提高肝臟GSH-Px活性和空腸黏膜CAT活性(P<0.05),并顯著降低肝臟MDA含量(P<0.05)。
表5 天然維生素E對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟和空腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of natural vitamin E on liver and jejunal mucosa antioxidant indexes of laying hens during late laying period
由表6可知,與對(duì)照組相比,飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E均可以顯著提高空腸黏膜Cu/Zn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05);飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可顯著提高空腸黏膜Nrf2和GSH-Px1的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05);但飼糧中添加天然維生素E對(duì)空腸黏膜Keap1、HO-1、NQO1和CAT的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表6 天然維生素E對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞空腸黏膜抗氧化基因表達(dá)的影響Table 6 Effects of natural vitamin E on jejunal mucosa antioxidant gene expression of laying hens during late laying period
由表7可知,與對(duì)照組相比,飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可顯著提高試驗(yàn)第21天雞蛋的蛋白高度、哈夫單位和蛋殼厚度(P<0.05);飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可提高試驗(yàn)第21天的蛋殼強(qiáng)度、蛋黃顏色以及試驗(yàn)第42天的蛋黃顏色和蛋殼厚度,但差異不顯著(P>0.05)。
表7 天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后雞蛋品質(zhì)的影響Table 7 Effects of natural vitamin E on egg quality of laying hens during late laying period
由表8可知,飼糧中添加天然維生素E對(duì)試驗(yàn)第21天和第42天雞蛋的蛋黃、蛋殼和蛋清指數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表8 天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期雞蛋組成的影響Table 8 Effects of natural vitamin E on egg composition of laying hens during late laying period %
飼料中添加維生素E可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育,提高其生產(chǎn)性能。Jiang等[3]報(bào)道,飼糧中添加200 mg/kg維生素E可顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率。但關(guān)于維生素E對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能影響的研究結(jié)果并不完全一致。張桂芝等[15]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加不同水平維生素E對(duì)產(chǎn)蛋種雞產(chǎn)蛋量和料蛋比均無(wú)顯著影響。咼于明等[16]亦報(bào)道,不同水平維生素E對(duì)產(chǎn)蛋種雞的采食量、產(chǎn)蛋率、平均蛋重和飼料轉(zhuǎn)化率均無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E使蛋雞產(chǎn)蛋率分別提高了4.13%和3.01%,平均日采食量分別提高了2.15%和1.75%,但差異不顯著,提示飼糧中額外添加天然維生素E可在一定程度上提高蛋雞產(chǎn)蛋后期的生產(chǎn)性能。造成以上結(jié)果差異的原因可能與動(dòng)物品種、周齡和維生素E類(lèi)型及添加水平等有關(guān)。
研究表明,動(dòng)物攝入的維生素E含量會(huì)影響其在動(dòng)物組織中的沉積量,且維生素E在不同部位的沉積量亦有差異[17]。楊秋霞[18]的試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼糧中添加高水平維生素E可以顯著提高蛋雞心臟、肝臟以及蛋黃中維生素E的沉積量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,蛋雞血清中維生素E含量隨著飼糧中天然維生素E添加水平的提高而增加,但天然維生素E添加水平從100 mg/kg增加到200 mg/kg時(shí),蛋雞肝臟中維生素E含量沒(méi)有提高。譚芳等[19]報(bào)道,蛋雞飼糧中分別添加0、41.66、83.32、124.98、166.64和249.96 IU/kg維生素E時(shí),蛋黃中維生素E含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。Lin等[20]在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0、40、80和120 mg/kg的維生素E時(shí),蛋黃中維生素E含量隨飼糧中維生素E添加水平提高呈線性增加,但當(dāng)添加水平為160 mg/kg時(shí),蛋黃中維生素E含量降低。本試驗(yàn)研究亦得到類(lèi)似結(jié)果,200 mg/kg天然維生素E組蛋黃中維生素E含量低于100 mg/kg天然維生素E組。因此,本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加100和200 mg/kg天然維生素E均能不同程度提高維生素E在蛋雞組織中的沉積。
機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶包括SOD、CAT、GSH-Px等。SOD可以清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基或者催化其發(fā)生歧化反應(yīng)生成活性較弱的過(guò)氧化氫(H2O2);CAT和GSH-Px均可將H2O2分解為無(wú)毒無(wú)害的水(H2O)和氧氣(O2),GSH-Px還可以清除有機(jī)氫過(guò)氧化物[21-24]。MDA是機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成的產(chǎn)物,其含量是反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[25]。維生素E作為抗氧化劑具有增強(qiáng)動(dòng)物抗氧化功能的作用。吳迪[10]研究表明,飼糧中添加天然維生素E可以顯著提高蛋雞血清SOD活性,降低血清MDA含量。Zduńczyk等[26]報(bào)道,蛋雞血清中SOD活性隨飼糧中維生素E添加水平的增加而升高。本研究亦得到類(lèi)似結(jié)果,飼糧中添加天然維生素E可提高蛋雞產(chǎn)蛋后期空腸黏膜CAT、肝臟和空腸黏膜GSH-Px活性,并降低了肝臟MDA含量,提示飼糧中添加天然維生素E可以提高產(chǎn)蛋后期蛋雞機(jī)體的抗氧化功能,且200 mg/kg的添加水平效果較好。
研究表明,維生素E可影響機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)。該系統(tǒng)由一系列抗氧化酶、解毒酶和轉(zhuǎn)運(yùn)因子組成??寡趸赣蒒rf2調(diào)節(jié),Nrf2是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子,是體內(nèi)抗氧化和細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)最重要的調(diào)節(jié)因子[27]。在機(jī)體抗氧化機(jī)制中,Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)形成Nrf2-ARE通路發(fā)揮重要作用,啟動(dòng)下游抗氧化酶基因的表達(dá),包括HO-1、NOQ1、CAT和GSH-Px1等[28-29]。研究表明,維生素E能夠通過(guò)抑制Nrf2啟動(dòng)區(qū)域的甲基化狀態(tài)提高小鼠細(xì)胞內(nèi)Nrf2和NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量[30]。李黎云[31]報(bào)道,飼糧中添加400 mg/kg維生素E可提高育肥豬肝臟中GPX1和Nrf2的mRNA和蛋白的表達(dá)量,表明維生素E能夠通過(guò)激活Nrf2、上調(diào)Nrf2-ARE信號(hào)通路下游抗氧化基因的mRNA和蛋白表達(dá)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可顯著增加蛋雞產(chǎn)蛋后期空腸黏膜中Nrf2、Cu/Zn-SOD和GSH-Px1的mRNA相對(duì)表達(dá)量,提示維生素E可以激活Nrf2-ARE通路,誘導(dǎo)啟動(dòng)Cu/Zn-SOD和GSH-Px1基因的表達(dá)。綜上所述,飼糧中添加天然維生素E可以有效提高蛋雞產(chǎn)蛋后期空腸黏膜抗氧化功能,可能與維生素E通過(guò)上調(diào)Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量、激活下游抗氧化基因的表達(dá)有關(guān)。
蛋黃顏色是衡量雞蛋品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,消費(fèi)者通常認(rèn)為蛋黃顏色越深則雞蛋品質(zhì)越好。葉黃素是影響雞蛋的蛋黃顏色的主要因素之一,其不能在蛋雞體內(nèi)合成,必須從飼糧中獲取[32]。葉黃素在體內(nèi)容易被氧化,影響蛋黃著色效果,維生素E可防止色素氧化損失。吳迪[10]報(bào)道,飼糧中添加維生素E可以顯著提高雞蛋的蛋黃顏色。元娜[33]研究亦表明,飼糧中添加維生素E能夠顯著提高蛋黃比重,并有加深蛋黃顏色的趨勢(shì)。但也有研究表明,飼糧中添加維生素E對(duì)雞蛋的蛋黃顏色和蛋黃比重均無(wú)顯著影響[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期雞蛋的蛋黃顏色和蛋黃比重均無(wú)顯著影響,這可能與蛋雞周齡、維生素E類(lèi)型和添加水平有關(guān)。
蛋白高度和哈夫單位是評(píng)價(jià)雞蛋蛋白質(zhì)量和新鮮度的指標(biāo),二者的數(shù)值越大表示雞蛋品質(zhì)越好[35]。Kirunda等[36]報(bào)道,在熱應(yīng)激條件下,隨著飼糧中維生素E添加水平的增加,雞蛋的哈夫單位也隨之提高。Yan等[37]研究表明,飼糧中添加適量的合成和天然維生素E均可顯著提高雞蛋的哈夫單位。本試驗(yàn)中,飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E可顯著提高試驗(yàn)第21天雞蛋的蛋白高度和哈夫單位,提示天然維生素E對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期的蛋品質(zhì)有較好的改善效果。蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度是評(píng)價(jià)蛋殼質(zhì)量的指標(biāo),蛋殼質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)雞蛋的儲(chǔ)存、運(yùn)輸以及孵化均十分重要[38]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,飼糧中添加200 mg/kg天然維生素E產(chǎn)品可顯著提高試驗(yàn)第21天雞蛋的蛋殼厚度,但對(duì)蛋殼強(qiáng)度無(wú)顯著影響。Jiang等[3]報(bào)道,飼糧中添加維生素E對(duì)蛋殼強(qiáng)度無(wú)顯著影響,與本研究結(jié)果一致。
飼糧中添加天然維生素E可在一定程度提高蛋雞產(chǎn)蛋后期的產(chǎn)蛋率,促進(jìn)肝臟中維生素E的沉積,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能和改善雞蛋品質(zhì)。從提高蛋雞生產(chǎn)后期的生產(chǎn)性能來(lái)看,以添加100 mg/kg天然維生素E的效果較好;從改善蛋雞生產(chǎn)后期的抗氧化功能及雞蛋品質(zhì)來(lái)看,以添加200 mg/kg天然維生素E的效果較佳。綜合考慮養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和添加成本等因素,飼糧中以添加100 mg/kg天然維生素E為宜。
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2021年12期