王仁杰 趙金標(biāo) 賴金花 付慧洋 雷 燕 呂繼蓉 李 菊 武振龍*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都 611130；3.河南銀發(fā)牧業(yè)有限公司，鄭州 451100)

仔豬實(shí)施早期斷奶措施(通常在3～5周齡)是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵技術(shù)之一。然而，仔豬早期斷奶后受環(huán)境、心理和營(yíng)養(yǎng)等方面的應(yīng)激，會(huì)不同程度地?fù)p傷腸道屏障功能和腸內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致仔豬食欲下降、消化不良和腹瀉，甚至死亡[1]。為了解決仔豬斷奶應(yīng)激所引起的一系列問題，實(shí)際生產(chǎn)中往往添加大量的抗生素預(yù)防或者治療斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的腸道屏障損傷[2]。近年來，抗生素濫用導(dǎo)致畜產(chǎn)品安全和細(xì)菌耐藥性等問題日益突出，歐盟和美國(guó)分別在2006和2017年禁止在飼料中添加抗生素[3]，我國(guó)也在2020年7月1日起全面禁止在飼料中添加抗生素。因此，尋找高效的抗生素替代物以緩解仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的生長(zhǎng)性能下降、腹瀉、以及腸道屏障損傷等問題迫在眉睫，這對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

目前飼料中抗生素替代物主要包括有機(jī)酸[4]、酶制劑[5-6]、益生菌和益生素[7-8]、抗菌肽[9]、中鏈脂肪酸[10-11]和精油[12-14]。精油作為主要的抗生素替代物之一，已經(jīng)被許多研究證實(shí)其具有促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)腸道微生物的作用。李方方等[15]在斷奶仔豬飼糧中添加300 mg/kg植物精油(有效成分香芹酚和百里香酚含量為22.5 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)植物精油可以提高仔豬平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率。但也有結(jié)果不一致的報(bào)道，Li等[14]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中添加18 mg/kg百里香酚和肉桂醛的精油復(fù)合物可以提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，降低血液中白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量和糞便中大腸桿菌數(shù)量，提高血液中總抗氧化能力，但對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能無顯著影響。Van Noten等[16]在斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg百里香酚，發(fā)現(xiàn)降低了腸道的通透性從而降低腹瀉率，但對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能也沒有顯著影響。由此可見，目前斷奶仔豬飼糧中精油的添加水平差異較大，且添加效果不一，有待繼續(xù)研究。因此，本試驗(yàn)旨在探究復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)以及糞便中微生物數(shù)量和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的影響，為復(fù)合植物精油在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)選用160頭28日齡健康的長(zhǎng)×大二元去勢(shì)公豬，初始體重為(8.06±0.09) kg，根據(jù)體重按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)原則分為4個(gè)組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加300、450和600 mg/kg復(fù)合植物精油。復(fù)合植物精油由成都某生物科技有限公司提供，有效成分含量為：肉桂醛18.0%、百里香酚3.0%和香芹酚7.0%，其余成分為載體。試驗(yàn)飼糧參照NRC(2012)配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)飼糧為粉料，全程不添加抗生素類促生長(zhǎng)劑和其他藥物。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as-fed basis) %

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在河南銀發(fā)牧業(yè)有限公司完成，所有試驗(yàn)流程和操作均嚴(yán)格遵守農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料效價(jià)與安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)的豬飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)技術(shù)的規(guī)程。試驗(yàn)期控制室溫在24～26 ℃。試驗(yàn)仔豬分欄飼養(yǎng)于1.5 m×2.0 m的欄舍，水泥漏縫地板，鴨嘴式飲水器，可調(diào)式料槽。試驗(yàn)期仔豬全程自由采食和飲水。嚴(yán)格遵循豬場(chǎng)飼養(yǎng)和管理制度，每天觀察仔豬的采食、糞便和精神狀況。試驗(yàn)期14 d。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

在試驗(yàn)第1天和第14天早晨對(duì)每頭仔豬進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算平均日增重(ADG)；記錄試驗(yàn)第1～14天的耗料量，計(jì)算平均日采食量(ADFI)；料重比(F/G)為ADFI與ADG的比值。

腹瀉率和糞便指數(shù)根據(jù)Wei等[17]的方法進(jìn)行計(jì)算分析。糞便評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，糞便堅(jiān)實(shí)，正常；1分，糞便為糊狀，輕度腹瀉；2分，糞便為半流質(zhì)，不成形，中度腹瀉；3分，糞便為水樣和泡沫樣，重度腹瀉。

腹瀉率(%)=[腹瀉次數(shù)/(試驗(yàn)
仔豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))]×100；
糞便指數(shù)=(糞便評(píng)分之和)/試驗(yàn)仔豬頭數(shù)。

1.3.2 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)第14天早晨，每重復(fù)隨機(jī)選擇2頭仔豬，空腹12 h，用無抗凝劑的真空采血管前腔靜脈采血，室溫靜置1 h，3 500 r/min離心10 min以收集血清，-20 ℃保存待測(cè)。

血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、二胺氧化酶(DAO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和髓過氧化物酶(MPO)活性，總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均參照南京建成生物工程研究所對(duì)應(yīng)的試劑盒說明書測(cè)定。血清中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量分別使用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法試劑盒(BioLegend，美國(guó))測(cè)定，測(cè)定方法參照試劑盒說明書。

1.3.3 糞便中微生物數(shù)量和揮發(fā)性脂肪酸含量的測(cè)定

仔豬直腸糞樣中的大腸桿菌和乳酸菌數(shù)量采用選擇培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)[18-19]。于試驗(yàn)第14天早上從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1頭仔豬，取新鮮直腸糞樣10 g，一部分低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定，另一部分-80 ℃保存用于揮發(fā)性脂肪酸含量的測(cè)定。MRS和麥康凱瓊脂平板提前配備，瓊脂平板的制作以及菌液的涂布均在無菌操作臺(tái)內(nèi)完成。用天平稱取0.5 g糞便樣品溶于4.5 mL滅菌生理鹽水中，配制成1∶10樣品菌液稀釋液(即配制成10-1稀釋液)。用渦旋振蕩器振蕩3 min，混合均勻后用移液槍吸取該稀釋液0.5 mL加入10 mL離心管，再加入4.5 mL滅菌生理鹽水，振蕩3 min，配制成10-2稀釋液，然后逐級(jí)稀釋至10-8。取10-3～10-5菌液稀釋液100 μL均勻涂布于麥康凱固體培養(yǎng)基中，用于計(jì)數(shù)大腸桿菌數(shù)量；取10-6～10-8菌液稀釋液100 μL均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，用以計(jì)數(shù)乳酸菌數(shù)量。大腸桿菌和乳酸菌在37 ℃有氧培養(yǎng)24 h。每個(gè)樣品的每個(gè)稀釋梯度做2次重復(fù)，結(jié)果取2次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。糞便中微生物數(shù)量用每克糞樣中菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)表示，即lg(CFU/g)。

糞便中揮發(fā)性脂肪酸含量的測(cè)定參照Porter等[20]的方法。用天平稱取0.5 g樣品至于10 mL離心管中，然后加入2 mL 0.1%鹽酸，混勻后放于冰上靜置25 min，15 000 r/min離心15 min，用注射器吸取上清液，使用0.45 μm濾膜過濾(Millipore，美國(guó))，注入氣相色譜(Agilent，美國(guó))檢測(cè)糞便中揮發(fā)性脂肪酸含量。

氣象色譜分析條件：色譜柱為HP 19091N-213(30.0 m×320 nm×0.5 μm)，載氣為氮?dú)?N2)，流速為2.0 mL/min，分流比為20∶1，進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口185 ℃，檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(FID)，210 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，先檢測(cè)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布和方差齊性，后根據(jù)數(shù)據(jù)特征選用適用的one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，然后用Tukey氏法進(jìn)行多重比較。數(shù)值用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，飼糧中添加不同水平的復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬的ADFI、ADG和F/G沒有顯著影響(P>0.05)；但與對(duì)照組相比，飼糧中添加450 mg/kg復(fù)合植物精油使斷奶仔豬ADG提高了10.80%。與對(duì)照組相比，飼糧中添加450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著降低了斷奶仔豬的腹瀉率和糞便指數(shù)(P<0.05)。

表2 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of plant essential oil compounds on growth performance of weaned piglets

2.2 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，飼糧中添加不同水平的復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬的血清AST和ALT活性沒有顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加450 mg/kg復(fù)合植物精油顯著降低了斷奶仔豬的血清DAO活性(P<0.05)，飼糧中添加450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬血清T-AOC(P<0.05)，飼糧中添加300、450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬血清CAT活性(P<0.05)，飼糧中添加450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著降低了斷奶仔豬血清促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量(P<0.05)。

表3 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of plant essential oil compounds on serum biochemical parameters of weaned piglets

2.3 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬糞便中微生物數(shù)量和揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表4可知，飼糧中添加不同水平的復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬的糞便中大腸桿菌和乳酸菌數(shù)量沒有顯著影響(P>0.05)。

表4 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬糞便中微生物數(shù)量的影響Table 4 Effects of plant essential oil compounds on fecal microbial numbers of weaned piglets lg(CFU/g)

由表5可知，飼糧中添加不同水平的復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬的糞便中丙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸含量沒有顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加300、450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬的糞便中乙酸含量(P<0.05)，飼糧中添加600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬的糞便中戊酸和總揮發(fā)性性脂肪酸含量(P<0.05)。

表5 復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬糞便中揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 5 Effects of plant essential oil compounds on fecal VFA contents of weaned piglets mg/g

3 討 論

植物精油一般具有芳香氣味，可以刺激仔豬嗅覺感受器和促進(jìn)消化液分泌，從而提高仔豬采食量和飼料利用效率。吳勝等[21]在斷奶仔豬飼糧中添加36 mg/kg的精油(肉桂醛)，顯著提高了仔豬ADFI和ADG。李方方等[15]和Li等[1]分別在斷奶仔豬飼糧中添加22.5和70.0 mg/kg精油(百里香酚和香芹酚)，結(jié)果均顯著增加了斷奶仔豬ADG和飼料轉(zhuǎn)化率，但對(duì)ADFI沒有顯著影響。然而，也有不同的研究報(bào)道，Van Noten等[16]和Su等[22]分別在斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg的百里香酚和36 mg/kg復(fù)合植物精油(百里香酚和肉桂醛)，雖然ADFI和ADG在數(shù)值上有所提升，但差異不顯著。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，雖然飼糧中添加450 mg/kg復(fù)合植物精油(有效成分肉桂醛、香芹酚和百里香酚含量合計(jì)126 mg/kg)后仔豬ADFI和ADG分別提高了4.44%和10.80%，F(xiàn)/G下降了5.44%，但差異不顯著。精油對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能影響的差異性可能與精油的組成、添加水平以及試驗(yàn)動(dòng)物的生理狀態(tài)等多方面因素有關(guān)，其具體原因還有待進(jìn)一步研究。

仔豬腹瀉主要發(fā)生在斷奶前及斷奶后2周，有研究顯示一些規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的腹瀉率高達(dá)50%，死亡率為15%～20%[23]。仔豬腹瀉的本質(zhì)是腸道上皮轉(zhuǎn)運(yùn)和腸道屏障功能紊亂，導(dǎo)致腸腔內(nèi)溶質(zhì)吸收減少和分泌增加[24]。精油具有殺菌、抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能等作用[25]，許多研究證明了飼糧中添加適量的精油可以降低斷奶仔豬的腹瀉率，下降幅度達(dá)10.09%～55.36%[1,16-17,26-27]。與前人的報(bào)道相吻合，本試驗(yàn)飼糧中添加450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著降低了斷奶仔豬腹瀉率。DAO位于哺乳動(dòng)物的腸絨毛末端細(xì)胞中，是一種胺氧化酶，血液中DAO可作為小腸黏膜完整性和腸道通透性受損標(biāo)志物，當(dāng)腸道黏膜完整性受破壞，血液中DAO活性增加[28]。本研究中，與對(duì)照組相比，飼糧中添加450 mg/kg復(fù)合植物精油顯著降低了斷奶仔豬血清DAO活性，表明復(fù)合植物精油改善了仔豬腸道通透性，這與本試驗(yàn)中復(fù)合植物精油可以降低豬腹瀉率相吻合。精油改善腸道通透性的原因可能是通過提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。在動(dòng)物模型上，Zou等[29]在生長(zhǎng)豬飼糧中添加25 mg/kg復(fù)合植物精油，發(fā)現(xiàn)其可以提高空腸組織中緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸道屏障功能。在細(xì)胞模型上，Sun等[30]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充肉桂醛可以提高小腸上皮細(xì)胞(IPEC-1細(xì)胞)中緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸道上皮細(xì)胞通透性。

精油主要成分中的酚、醛及其衍生物具有抗氧化功能[31]。精油發(fā)揮抗氧化功能可以通過2個(gè)途徑：1)精油可以直接與氧自由基反應(yīng)，從而減少機(jī)體內(nèi)氧自由基的數(shù)量[32]；2)精油可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性，間接參與抗氧化功能[33]。前人的研究表明，在豬飼糧中添加牛至精油[34]、肉桂醛[35]以及肉桂醛和百里香酚混合物[36]，均有提高血清中抗氧化酶活性和降低MDA含量的效果。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼糧中添加450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬血清中CAT活性與T-AOC，與前人研究結(jié)果一致，說明復(fù)合植物精油提高了斷奶仔豬的抗氧化能力。

胃腸道不僅是膳食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和代謝的重要器官，它也是機(jī)體最大的免疫器官[37]。仔豬在斷奶后會(huì)遇到許多致病和非致病的挑戰(zhàn)，這將導(dǎo)致胃腸道免疫系統(tǒng)的激活。雖然健康的胃腸道被認(rèn)為是處于平衡的可控炎癥狀態(tài)[38]。但病原體感染、飲食的過敏原和斷奶應(yīng)激均會(huì)引發(fā)腸道的炎癥反應(yīng)[39]。胃腸道免疫系統(tǒng)在激活過程中會(huì)產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的過多產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致腸道損傷和功能障礙[40]，仔豬腸道屏障功能受損又會(huì)加劇仔豬腹瀉[24]。植物精油在一定程度上可以提高斷奶仔豬腸道免疫功能，從而提高腸道健康狀態(tài)[41]。Li等[14]報(bào)道在仔豬飼糧中添加百里香酚和肉桂醛混合精油降低了仔豬血液中IL-1β和IL-6的含量，降低了機(jī)體的炎癥水平。Omonijo等[42]用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)發(fā)生炎癥反應(yīng)，增加了促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)和TNF-α的表達(dá)和腸上皮細(xì)胞的通透性，然而補(bǔ)充百里香酚可以顯著降低豬小腸上皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子含量和腸上皮細(xì)胞的通透性。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼糧中添加450 mg/kg復(fù)合植物精油顯著降低了斷奶仔豬血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量及DAO活性，與前人報(bào)道一致。這表明復(fù)合植物精油可以緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，降低腸道通透性，有助于降低仔豬腹瀉。

精油還具有促進(jìn)腸道益生菌生長(zhǎng)和抑制病原菌增殖的功能，從而改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[43]。精油抑制病原菌的機(jī)制可能在于其活性成分具有較強(qiáng)的表面活性和脂溶性，能迅速穿透病原微生物的細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物流失，有效阻止線粒體內(nèi)的呼吸氧化過程，使微生物喪失能量來源而死亡[44]。Wei等[17]的研究結(jié)果表明，補(bǔ)充百里香酚和香芹酚混合物可以降低斷奶仔豬空腸食糜中腸球菌屬和大腸桿菌屬的相對(duì)豐度，提高乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度。Manzanilla等[45]在飼糧中添加15和30 mg/kg香芹酚、肉桂醛和辣椒精油的復(fù)合物可以顯著提高仔豬空腸食糜中乳酸菌和腸桿菌的比值。本試驗(yàn)中，飼糧中添加不同水平的復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬糞便中大腸桿菌和乳酸菌數(shù)量無顯著影響，但糞便中大腸桿菌數(shù)量在數(shù)值上有所減少，乳酸菌數(shù)量在數(shù)值有所增加，與前人研究結(jié)果類似。腸道中揮發(fā)性脂肪酸是腸道微生物的代謝產(chǎn)物。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼糧中添加300、450和600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬的糞便中乙酸含量，飼糧中添加600 mg/kg復(fù)合植物精油顯著提高了斷奶仔豬的糞便中總揮發(fā)性性脂肪酸含量，說明復(fù)合植物精油提高了斷奶仔豬腸道微生物的代謝功能。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加復(fù)合植物精油對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能無顯著影響，但可以降低仔豬腹瀉率，改善炎癥水平和腸道通透性，提高機(jī)體抗氧化能力和糞便中揮發(fā)性脂肪酸含量。

② 本試驗(yàn)條件下，斷奶仔豬飼糧中復(fù)合植物精油的適宜添加水平為450 mg/kg。