高霞，賀曾賢，喬成芳

（商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院/陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西商洛 726000）

近年來，隨著選礦過程中浮選藥劑使用量的增加，殘留浮選劑的選礦廢水引發(fā)的環(huán)境問題日益突出[1-3]。大部分浮選藥劑高毒、高污染、難降解，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重危害。其中黑藥是浮選廢水中主要難降解有機(jī)污染物。目前，浮選廢水中有關(guān)黑藥的降解方法有臭氧氧化[4]、化學(xué)氧化[5]、催化氧化[6]等物理化學(xué)法，以及生物法[7]。有研究表明，物理化學(xué)法成本較高，且處理效果不理想，容易造成二次污染；而生物法經(jīng)濟(jì)、有效且不會(huì)產(chǎn)生二次污染[7]，近年來備受關(guān)注。宋衛(wèi)峰等[8]先后采用自制SBR（序批式活性污泥）系統(tǒng)研究了外加基質(zhì)對(duì)含苯胺黑藥模擬廢水處理效果的影響，并對(duì)模擬苯胺黑藥廢水進(jìn)行了小試處理，對(duì)礦山生態(tài)環(huán)境的改善具有推動(dòng)意義。但由于SBR法的間歇性運(yùn)行特點(diǎn)導(dǎo)致其不能處理連續(xù)大規(guī)模的廢水，同時(shí)還存在處理速度慢以及規(guī)模小等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)高效、低耗且穩(wěn)定達(dá)標(biāo)的浮選廢水處理新技術(shù)已日趨重要。

與傳統(tǒng)的廢水處理法相比，生物酶催化技術(shù)具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快，對(duì)溫度、濃度和有毒物質(zhì)適應(yīng)范圍廣以及可重復(fù)使用等特性[9]，在生活污水、印染等工業(yè)廢水處理中應(yīng)用較為廣泛，而在浮選廢水的處理研究涉及較少。生物酶處理有機(jī)污染物的機(jī)理是先通過酶促反應(yīng)形成游離基，進(jìn)而游離基發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)生成高分子化合物沉淀，經(jīng)過濾即可除去。與其他微生物處理方法相比，生物酶處理法具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、對(duì)設(shè)備要求低、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。然而，酶分子在使用過程中存在穩(wěn)定性差、成本高以及難以從反應(yīng)體系中回收再利用等問題，將生物酶分子負(fù)載到固相載體上被認(rèn)為是提升酶的穩(wěn)定性最有效的途徑之一，同時(shí)負(fù)載在固相載體上的酶可通過固液分離實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)使用，從而降低酶的使用成本。

近年來，多孔納米材料因其具有大的比表面積、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等獨(dú)特的性能優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注[10-11]，在催化[11]、吸附[12]、超級(jí)電容器[13]、能量儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化[14]等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。通常多孔納米材料的制備方法主要有化學(xué)刻蝕法[15]、離子交換法[16]、模板法[17]以及電弧法[18]，其中以模板法最為常見。與傳統(tǒng)模板法相比，基于金屬有機(jī)骨架（MOFs）前驅(qū)體煅燒制備多孔納米材料的方法簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，所制備的多孔納米材料不僅具有MOFs自身的優(yōu)勢(shì)，還具有可調(diào)的孔隙結(jié)構(gòu)、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)良特性，可以成為理想的酶固定化載體。然而，迄今為止，基于MOF前驅(qū)體制備多孔材料用于固載酶的報(bào)道較少[19-20]。本文基于“自犧牲模板”策略通過熱分解Cr-MOF制備得到兩種具有微孔-介孔結(jié)構(gòu)的多級(jí)孔MHCr2O3材料，再以“聚多巴胺（PDA）”仿生膜對(duì)材料表面進(jìn)行功能化修飾后首次對(duì)辣根過氧化物酶（HRP）進(jìn)行固載，并研究了固定化酶在黑藥降解中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

辣根過氧化物酶（HRP），95%，北京索萊寶科技有限公司；1,3,5-苯三甲酸（H3BTC），分析純，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；九水合硝酸鉻（Cr(NO3)3·9H2O）、冰乙酸、六亞甲基四胺（HMTA）和過氧化氫（H2O2，體積分?jǐn)?shù)30%）均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸多巴胺（DA），分析純，上海索萊寶生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），99.5%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2'-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS），98%，Sigma-Aldrich公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP），99%，Sigma-Aldrich公司；苯胺黑藥和丁銨黑藥均為分析純，廣東翁江化學(xué)試劑有限公司；SX3型陶瓷纖維節(jié)能高溫箱式電阻爐（北京科偉永興儀器有限公司）；D/Max-3C型全自動(dòng)X-射線衍射儀（XRD，日本Rigalcu）；UV-1780型紫外可見分光光度計(jì)（UV-Vis，日本島津公司）；GL-20B型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LSHZ-300型冷凍水浴恒溫振蕩器（蘇州市培英儀器設(shè)備有限公司）；ASAP 2460系列物理吸附儀（美國麥克公司）；202-1AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FV1200型激光共聚焦顯微鏡（CLSM，奧林巴斯）。

1.2 多級(jí)孔MHCr2O3的制備及功能化修飾

將0.4002gCr(NO3)3·9H2O、0.2102gH3BTC、0.655gPVP和1 mL冰乙酸以及29 mL蒸餾水置于50 mL聚四氟乙烯水熱反應(yīng)釜中，超聲30 min，密封后在5 h內(nèi)升溫至220℃，恒溫24 h，然后緩慢冷卻至室溫，產(chǎn)物用無水乙醇洗滌多次，80℃真空干燥12 h，得到Cr-MOF前驅(qū)體。

取Cr-MOF前驅(qū)體約100mg于瓷坩堝中，置于電阻爐中，以2℃/min的速率升溫至400～600℃，并分別在400℃和600℃溫度條件下保持4 h，然后自然冷卻至室溫，得到兩種MHCr2O3材料，分別標(biāo)記為 MHCr2O3-400和 MHCr2O3-600。將0.241gMHCr2O3和0.0095gDA分散在50 mL超純水中，再加入0.102gHMTA，密封渦流30 s后，在90℃條件下溫育3 h，自然冷卻到室溫，離心分離，用無水乙醇洗滌數(shù)次，80℃真空干燥12 h，得到PDA@MHCr2O3載體材料。

1.3 HRP@PDA@MHCr2O3的制備

向5 mg PDA@MHCr2O3載體中加入1400 μL pH=3.0的磷酸緩沖液（0.1 mol/L），然后加入 100 μL 0.25 mmol/L的HRP溶液，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩1 h，離心分離，洗滌除去載體表面未固載的HRP，得到HRP@PDA@MHCr2O3。測(cè)定上清液中殘留HRP的濃度，計(jì)算酶的固載量：

式(1)中，△A為HRP在紫外波長403 nm處的吸光度值的變化，V為體系最終的體積（mL），ε為HRP的摩爾吸光系數(shù)102000 L/（mol·cm），l為所用比色皿的寬度（cm），m為加入載體的質(zhì)量（g）。

1.4 酶催化活性測(cè)定

以HRP催化氧化ABTS的過氧化反應(yīng)為模型反應(yīng)，以ABTS的轉(zhuǎn)化率來表征HRP的活性。向pH=5.0的磷酸緩沖液中加入30 μL 0.01 mol/L ABTS和一定量的游離HRP或含等量HRP的HRP@PDA@MHCr2O3，最后加入 30 μL 0.1 mol/L H2O2，搖勻，待反應(yīng)5 min后離心分離，測(cè)定上清液在415 nm處的吸光度值，根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法計(jì)算ABTS的轉(zhuǎn)化率。

1.5 熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性的測(cè)定

將一定量的游離HRP和含等量HRP的HRP@PDA@MHCr2O3加入磷酸緩沖液置于30～100℃溫度下溫育1 h，再將溫育過的游離HRP和固定化酶用于催化ABTS過氧化反應(yīng)，比較游離HRP和固定化酶的熱穩(wěn)定性。

將每次反應(yīng)后的固定化酶離心分離洗滌，再次用于催化ABTS過氧化反應(yīng)，以第一次使用固定化酶的活性記作100%，將之后每次的催化活性與第一次的比較，以殘余催化活性表征固定化酶的重復(fù)使用性。

1.6 HRP@PDA@MHCr2O3在黑藥降解中的應(yīng)用

1.6.1 模擬廢水的配制

根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法配制模擬浮選廢水，由NH4Cl（4 mg/L）、KH2PO4（24 mg/L）、MgSO4（5 mg/L）、CaCl2（2.4 mg/L）、NaOH（35 mg/L）配制得到，利用pH=1.0的HCl調(diào)節(jié)模擬廢水至pH=6.5，試驗(yàn)用模擬廢水均為新鮮配制。

1.6.2 黑藥降解

向模擬廢水水樣中加入一定量的游離HRP和含等量HRP的固定化酶，然后加入一定體積的底物苯胺黑藥或丁銨黑藥（最終濃度為30 mg/L），再向體系中加入80 μL 0.1 mol/L H2O2，保持最終體積為3 mL。室溫下避光反應(yīng)30 min，根據(jù)底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及降解后測(cè)得吸光度值計(jì)算底物降解率（%）：

式(2)中，C0為底物的初始濃度，Ct為底物在t時(shí)刻的濃度。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制一系列質(zhì)量濃度為5～100 mg/L的底物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定不同濃度苯胺黑藥（或丁銨黑藥）標(biāo)準(zhǔn)溶液在230 nm（或220 nm）處的吸光度，繪制底物濃度與吸光度的工作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，苯胺黑藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.0488x-0.0192，R2=0.9997，丁銨黑藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0503x+0.0767，R2=0.9994。

圖1 底物測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.6.4 化學(xué)耗氧量（COD）的測(cè)定

化學(xué)耗氧量（COD）即化學(xué)需氧量，指的是在一定的體系中，采用氧化性較強(qiáng)的氧化劑處理時(shí)所消耗掉的氧化劑的量。向20 mL試管中依次加入2.5 mL空白樣（蒸餾水），標(biāo)樣和待測(cè)樣（固定化酶降解黑藥后上清液），在每一個(gè)試管中分別加入0.7 mL D試劑和4.8 mL E試劑。再將加入D試劑和E試劑的試管置于預(yù)熱好的COD檢測(cè)儀中，加熱10 min后取出試管，經(jīng)空氣冷卻2 min后依次在每個(gè)試管中加入2.5 mL蒸餾水，振蕩搖勻，水浴冷卻2 min。最后依次按順序?qū)⒃嚬苤械臉拥谷胍褱?zhǔn)備好的比色皿中用以檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相載體及其固定化酶的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 X射線粉末衍射（XRD）

圖2為Cr2O3的XRD標(biāo)準(zhǔn)譜圖以及MHCr2O3的XRD譜圖。由圖 2可知，MHCr2O3-400和MHCr2O3-600 在衍射角 2θ為 24.49°，33.60°，36.20°，41.48°，50.22°，54.85°，63.45°，65.10°，73.33°和76.85°處出現(xiàn)的衍射特征峰，分別對(duì)應(yīng)于六方體結(jié)構(gòu) Cr2O3的 (012)、(104)、(110)、(113)、(024)、(116)、(214)、(300)、(119)、(220)晶面，符合標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)（標(biāo)準(zhǔn)卡片JCPDS 38-1479），表明Cr-MOF前驅(qū)體在400℃和600℃的空氣氣氛條件下煅燒4 h后均完全分解為Cr2O3。

圖2 Cr2O3的XRD標(biāo)準(zhǔn)譜圖以及MHCr2O3的XRD譜圖

2.1.2 N2吸脫附分析

將制備的兩種MHCr2O3材料經(jīng)180℃下過夜脫氣后，在液氮溫度下（77 K）進(jìn)行氮?dú)馕摳綔y(cè)試，結(jié)果見圖3和表1。如圖3所示，兩種MHCr2O3材料的氮?dú)馕摳降葴鼐€存在明顯滯后環(huán)，說明材料具有介孔結(jié)構(gòu)。表1顯示兩種MHCr2O3材料均含有幾類大小不同的孔道，進(jìn)一步表明所制備的材料具有多級(jí)孔孔隙結(jié)構(gòu)。

表1 多級(jí)孔MHCr2O3材料的孔性質(zhì)

圖3 MHCr2O3材料的N2吸脫附等溫線

2.1.3 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM）和透射電子顯微鏡（FETEM）

為了研究熱分解過程是否對(duì)Cr-MOF前驅(qū)體的結(jié)構(gòu)造成影響，取一定量Cr-MOF前驅(qū)體和MHCr2O3材料進(jìn)行FESEM和FETEM測(cè)試，結(jié)果見圖4和圖5。從圖4（a）和圖4（b)可以看出，Cr-MOF前驅(qū)體的形貌是由大小基本均一的花瓣?duì)罴{米顆粒結(jié)構(gòu)構(gòu)成。與圖 4（c）、圖 4（d）、圖4（e）和圖4（f）對(duì)比可知，經(jīng)400℃和 600℃空氣氣氛條件煅燒后得到的MHCr2O3材料基本保留了與Cr-MOF前驅(qū)體相似的納米顆粒形貌結(jié)構(gòu)，但納米顆粒的堆積方式發(fā)生了一定的變化，煅燒后納米粒子的形態(tài)變得更為均一規(guī)則。從圖4和圖5可以看出，MHCr2O3-400材料的形貌是由大小均一的葡萄狀納米顆粒結(jié)構(gòu)堆積而成，而MHCr2O3-600材料的形貌是由大小均一的納米顆粒之間大量的孔隙形成的堆積結(jié)構(gòu)構(gòu)成，且呈現(xiàn)出較MHCr2O3-400材料的形貌結(jié)構(gòu)更為分散的特點(diǎn)。MHCr2O3-400和MHCr2O3-600兩種材料納米顆粒的尺寸大約在30～50 nm，且顆粒間的分散性良好。

圖4 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖

圖5 場(chǎng)發(fā)射透射電鏡圖

2.1.4 激光共聚焦顯微鏡（CLSM）

為了證明游離HRP在PDA@MHCr2O3載體材料中的成功固載，將用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記HRP制備的FITC-HRP@PDA@MHCr2O3用于激光共聚焦顯微鏡測(cè)試，結(jié)果見圖6。圖6（b）中可見許多均勻分布的綠色熒光斑點(diǎn)，由于載體材料自身不是熒光材料，通過觀察得知圖6（a）中確實(shí)沒有綠色熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)，故所觀察到的熒光信號(hào)來自于引入PDA@MHCr2O3的FITC-HRP。由此可以證實(shí)HRP被固載到了PDA@MHCr2O3材料中。

圖6 激光共聚焦顯微鏡圖

2.2 固定化酶性質(zhì)研究

2.2.1 熱穩(wěn)定性

將游離HRP和含等量HRP的固定化酶分別在 30～100 ℃下溫育1h，結(jié)果見圖7（a）。由圖7（a）可見，游離HRP和固定化酶的熱穩(wěn)定性在30～50℃差別不大，其最佳反應(yīng)溫度分別為40℃和50℃，但當(dāng)溫度超過60℃之后，游離HRP的催化活性明顯下降，在70℃條件下溫育1 h僅能保持18.1%的催化活性，而相同條件下，HRP@PDA@MHCr2O3-400和HRP@PDA@MHCr2O3-600仍分別能保持98.0%和92.7%的催化活性，甚至在90℃條件下溫育1 h仍分別能保持95.2%和83.9%的催化活性。結(jié)果表明，固定化酶的熱穩(wěn)定性較游離酶顯著提高，這是由于酶分子固載后，載體材料給游離酶抵御高溫提供了屏障，減少了溫度對(duì)固定化酶構(gòu)象的影響。HRP@PDA@MHCr2O3-400表現(xiàn)出較HRP@PDA@MHCr2O3-600更為突出的熱穩(wěn)定性，這是由于MHCr2O3-400和MHCr2O3-600兩種材料的孔徑效應(yīng)引起的。由表1可知，MHCr2O3-400和MHCr2O3-600的平均孔徑大小分別為12.8 nm和21.3 nm，根據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道，游離 HRP的分子尺寸為（4.0×4.4×6.8）nm。 與MHCr2O3-400相比，HRP分子在MHCr2O3-600孔道中在可以實(shí)現(xiàn)自由翻轉(zhuǎn)的同時(shí)可能會(huì)由于孔徑的進(jìn)一步擴(kuò)大而導(dǎo)致進(jìn)入載體孔道中的HRP分子增多，而孔道的限域效應(yīng)會(huì)引起酶分子的團(tuán)聚，底物通道可能瞬間被堵塞，同時(shí)也會(huì)使底物的傳質(zhì)阻力增大，從而降低酶的催化活性。此外，載體表面“PDA”仿生膜的構(gòu)建可以在一定程度上抑制材料離心過程中導(dǎo)致的酶分子脫落現(xiàn)象，從而使所制備的固定化酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖7 游離HRP和固定化酶的熱穩(wěn)定性

2.2.2 重復(fù)使用性

圖8為固定化酶在過氧化反應(yīng)中的重復(fù)使用性。由圖8可知，HRP@PDA@MHCr2O3-400和HRP@PDA@MHCr2O3-600兩種固定化酶均展現(xiàn)出良好的重復(fù)使用性，兩種固定化酶在重復(fù)使用10次后均能保持接近100%的催化活性。根據(jù)文獻(xiàn)[24]報(bào)道，介孔 MOF（Tb-TATB）固定化酶在重復(fù)使用7次后，僅能保持53%的催化活性。固定化漆酶[25]在重復(fù)使用10次后，僅能保持不到50%的催化活性。MOF固定化葡萄糖淀粉酶[26]在重復(fù)使用6次后，僅能保持57%的催化活性。與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相比，本文制備的HRP@PDA@MHCr2O3固定化酶展現(xiàn)出突出的重復(fù)使用性。HRP@PDA@MHCr2O3突出的重復(fù)使用性主要源于“PDA”仿生膜對(duì)材料表面進(jìn)行功能化修飾的結(jié)果。雖然本研究是利用物理吸附法將HRP固載到PDA@MHCr2O3材料中。與共價(jià)法相比，這種存在于酶與載體之間的弱相互作用會(huì)不可避免地導(dǎo)致酶的脫落，但由于載體表面“PDA”仿生膜的構(gòu)建使HRP@PDA@MHCr2O3中酶與載體之間的作用力增強(qiáng)。

圖8 固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)

2.3 黑藥降解應(yīng)用研究

為了考察固定化酶催化降解的實(shí)際應(yīng)用能力，本文采用生物酶催化降解法，利用固定化酶催化降解模擬浮選廢水中有機(jī)污染物苯胺黑藥和丁銨黑藥，根據(jù)降解率的大小評(píng)價(jià)固定化酶的催化性能，結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)苯胺黑藥和丁銨黑藥的濃度均達(dá)到30mg/L時(shí)，在30min內(nèi)含等量HRP的HRP@PDA@MHCr2O3-400和HRP@PDA@MHCr2O3-600對(duì)苯胺黑藥的降解率均達(dá)到70%以上，對(duì)丁銨黑藥的降解率均達(dá)到60%以上，而游離HRP對(duì)苯胺黑藥和丁銨黑藥的降解率均不到40%。結(jié)果表明，在同等條件下游離酶對(duì)有機(jī)污染物黑藥的催化效率較其固定化酶降低，且HRP@PDA@MHCr2O3-400對(duì)黑藥的催化效率明顯較HRP@PDA@MHCr2O3-600高。固定化酶較游離酶催化活性提高主要可歸因于兩個(gè)原因：一是載體的微-介孔多級(jí)結(jié)構(gòu)，其中較大的孔可以容納酶分子，而較小的孔可以作為底物和其它溶劑小分子的擴(kuò)散通道，實(shí)現(xiàn)了酶與底物各行其道，更有利于降解反應(yīng)的進(jìn)行。二是載體表面“PDA”仿生膜的構(gòu)建，抑制了固定化酶使用過程中酶的脫落，最大程度保留了酶的催化活性。HRP@PDA@MHCr2O3-400的催化效率較高可歸因于MHCr2O3-400的孔徑大小合適，能夠?yàn)槊阜肿犹峁┮粋€(gè)合適的翻轉(zhuǎn)空間，避免酶分子的團(tuán)聚。

表2 游離HRP及其固定化酶對(duì)黑藥的催化降解效率

經(jīng)測(cè)定有機(jī)污染物黑藥降解前后的COD值及其去除率如表3所示。由表3可知，對(duì)于底物來說，降解后的COD值都有一定程度的下降，COD的去除率為48.6%～58.6%，COD的去除率較高，說明降解后體系中有機(jī)物的含量降低了。因此，用辣根過氧化物酶（HRP）催化氧化降解有機(jī)污染物的這一類型反應(yīng)的應(yīng)用具有一定的可行性，符合綠色環(huán)保的理念。

表3 黑藥降解前后的COD值及其去除率

3 結(jié)論

本文基于Cr-MOF前驅(qū)體，采用“自犧牲模板”策略，成功制備出兩種具有介孔-微孔結(jié)構(gòu)的多級(jí)孔MHCr2O3材料，以“PDA”仿生膜對(duì)材料表面進(jìn)行功能化修飾，并將辣根過氧化物酶（HRP）引入材料中，構(gòu)筑了HRP@PDA@MHCr2O3固定化酶。本研究發(fā)現(xiàn)，利用介孔周圍豐富的微孔結(jié)構(gòu)富集底物可以減小其傳質(zhì)阻力補(bǔ)償固定化酶制備過程中酶催化活性的損失。采用構(gòu)建“PDA”仿生膜的策略能夠抑制固定化酶使用過程中酶的脫落，制備的固定化酶具有十分出色的熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，并且能保留較高催化活性。將固定化酶應(yīng)用于催化降解模擬廢水中有機(jī)污染物苯胺黑藥和丁銨黑藥具有反應(yīng)時(shí)間較短、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)表現(xiàn)出非常高效的催化降解有機(jī)污染物能力，更適合應(yīng)用于實(shí)際降解體系中。