吳德光 胡智慧 劉廣新 時(shí) 偉

(1. 茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州 仁懷 564500；2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；3. 安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003)

料酒是一類(lèi)專用于烹飪的調(diào)味用酒，具有去腥解膩[1]、減輕膻味[2]、提味增鮮[3]、增香賦色[4]的功效。除乙醇之外，料酒還含有豐富的酯類(lèi)、氨基酸、維生素和微量元素等，不僅能賦予食物特殊的香味，還具有提供營(yíng)養(yǎng)的作用[5]。近年來(lái)，隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展，多樣化的料酒釀造原料與工藝創(chuàng)新受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中尋求低成本的新型釀造原料對(duì)降低企業(yè)生產(chǎn)成本，促進(jìn)料酒行業(yè)的發(fā)展有著重大意義。甘蔗糖蜜是蔗糖生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，約含有46%的糖、3%的粗蛋白和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[6]，通常用來(lái)生產(chǎn)活性干酵母、酒精、乳酸、茁霉多糖等各種食品或醫(yī)藥化工產(chǎn)品[7-9]。其中絕大部分被用于酒精生產(chǎn)，每年因糖蜜酒精產(chǎn)生的廢水排放量高達(dá)650萬(wàn)t[10]。若以甘蔗糖蜜為原料釀造料酒不僅可以拓展糖蜜的應(yīng)用途徑，而且可以減少?gòu)U水排放量。

研究擬以甘蔗糖蜜為原料，對(duì)甘蔗糖蜜料酒的發(fā)酵、脫色等工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為糖蜜料酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)與參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

甘蔗糖蜜：天津某制糖企業(yè)；

黃酒專用活性干酵母(Y-ADY)：安琪酵母股份有限公司；

MgSO4：分析純，天津市化學(xué)試劑廠；

NaCl、KH2PO4、CaO、(NH4)2SO4：分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；

葡萄糖：分析純，天津江天化工技術(shù)有限公司；

玉米漿：河北康欣制藥有限公司；

糖液脫色專用活性炭(符合GB/T 13803.3—1999 優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn))、食鹽、味精、食用香辛料(肉桂、丁香、茴香、黃酒香精)：市售；

乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、琥珀酸二異酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品：色譜級(jí)，純度≥98.0%，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器及設(shè)備

酸度計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

精密酒度計(jì)：HK6542型，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；

凱氏定氮儀：KDN-818型，上海纖檢儀器有限公司；

5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐：GS-8000型，上海廣世生物工程設(shè)備有限公司；

紫外分光光度計(jì)：752N型，上海儀電分析儀器有限公司；

氣相色譜儀：Agilent7890A型，配FID檢測(cè)器，HP-INNOWax 1909IN-213(30 m×0.32 mm×5 μm)，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；

液相色譜儀：Agilent1200型，DAD檢測(cè)器，HPX-87H柱(300 mm×7.8 mm×9 μm)，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糖蜜料酒工藝流程

1.3.2 糖蜜發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)

(1)甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度的確定：在250 mL三角瓶發(fā)酵過(guò)程中，設(shè)定甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度(以葡萄糖計(jì))分別為180，200，220，240 g/L，酒母醪中其他成分為玉米漿添加量5 g/L，(NH4)2SO4添加量2 g/L，MgSO4添加量0.2 g/L，NaCl添加量0.5 g/L，KH2PO4添加量0.5 g/L，CaO添加量0.2 g/L。裝液量為200 mL，30 ℃下靜態(tài)發(fā)酵，每隔12 h稱重，當(dāng)CO2失重小于0.1 g時(shí)即為發(fā)酵結(jié)束?？疾旄收崽敲鄢跆琴|(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵酒精度、殘?zhí)且约癈O2累積失重的影響。

(2)玉米漿添加量的確定：在250 mL三角瓶發(fā)酵過(guò)程中，設(shè)定玉米漿添加量分別為2.5，5.0，7.5，10.0 g/L，酒母醪中其他成分為甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度200 g/L，(NH4)2SO4添加量2 g/L，MgSO4添加量0.2 g/L，NaCl添加量0.5 g/L，KH2PO4添加量0.5 g/L，CaO添加量0.2 g/L。裝液量為200 mL，30 ℃下靜態(tài)發(fā)酵，每隔12 h稱重，當(dāng)CO2失重小于0.1 g時(shí)即為發(fā)酵結(jié)束?？疾煊衩诐{添加量對(duì)發(fā)酵酒精度、殘?zhí)且约癈O2累積失重的影響。

(3)硫酸銨添加量的確定：在250 mL三角瓶發(fā)酵過(guò)程中，設(shè)定硫酸銨添加量分別為0.5，1.0，1.5，2.0 g/L，酒母醪中其他成分為甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度200 g/L，玉米漿添加量5 g/L，MgSO4添加量0.2 g/L，NaCl添加量0.5 g/L，KH2PO4添加量0.5 g/L，CaO添加量0.2 g/L。裝液量為200 mL，30 ℃下靜態(tài)發(fā)酵，每隔12 h稱重，當(dāng)CO2失重小于0.1 g時(shí)即為發(fā)酵結(jié)束?？疾炝蛩徜@添加量對(duì)發(fā)酵酒精度、殘?zhí)且约癈O2累積失重的影響。

1.3.3 糖蜜發(fā)酵酒小試制備 以單因素試驗(yàn)優(yōu)化出的營(yíng)養(yǎng)成分配方配制4 L酒母醪，將其裝入5 L發(fā)酵罐中，Y-ADY接種量2 g/L，轉(zhuǎn)速50 r/min，發(fā)酵溫度30 ℃，每隔12 h取樣測(cè)定酒精度和殘?zhí)?，?dāng)殘?zhí)堑陀? g/L時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)。發(fā)酵液經(jīng)離心、過(guò)濾除菌后得到糖蜜發(fā)酵酒。

1.3.4 糖蜜發(fā)酵酒的脫色 為確定糖蜜發(fā)酵酒的最佳脫色處理工藝條件，以1.3.3中制備的糖蜜發(fā)酵酒為處理對(duì)象，根據(jù)有關(guān)活性炭處理糖蜜酒精廢液的文獻(xiàn)報(bào)道[11]，選取活性炭用量、脫色時(shí)間、脫色溫度3個(gè)影響因素，并根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平(見(jiàn)表1)，以脫色率為指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

糖蜜發(fā)酵酒經(jīng)活性炭吸附后采用雙層濾紙過(guò)濾，在380 nm測(cè)定其透光度并計(jì)算脫色率[12]。最后測(cè)定糖蜜發(fā)酵酒經(jīng)最佳脫色工藝處理后的酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮以及主要風(fēng)味物質(zhì)。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 糖蜜料酒的調(diào)配 設(shè)置食鹽的添加梯度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/100 mL；味精的添加梯度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 g/100 mL。4種香精(肉桂、丁香、茴香、黃酒)按1∶1∶1∶1配制成混合香辛料后設(shè)置添加梯度(體積分?jǐn)?shù))為0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%。每種調(diào)味劑的調(diào)配試驗(yàn)各取6份200 mL的糖蜜發(fā)酵酒，分別按上述分組添加不同濃度梯度的相應(yīng)調(diào)味劑。經(jīng)充分?jǐn)嚢枞芙夂?，?0名專業(yè)品酒師對(duì)其進(jìn)行感官品評(píng)后投票，選出每種調(diào)味劑的最適添加量。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

1.4.1 糖蜜總糖 蘭因—艾農(nóng)法[13]607-610。

1.4.2 非發(fā)酵糖、殘?zhí)?斐林試劑法[13]611-613。

1.4.3 總氮 凱氏定氮法[14]。

1.4.4 酒精度 按GB 5009.225—2016執(zhí)行。

1.4.5 食鹽、總酸、氨基酸態(tài)氮 按SB/T 10416—2007執(zhí)行。

1.4.6 主要揮發(fā)性風(fēng)味成分 氣相色譜法[15]。

(1)氣相色譜條件：柱溫75 ℃；進(jìn)樣室溫度200 ℃；FID檢測(cè)器溫度230 ℃；H2流量30 mL/min，N2流量20 mL/min，空氣流量400 mL/min；隔墊吹掃流量3 mL/min；分流比20∶1；進(jìn)樣量1 μL。

(2)定量方法：內(nèi)標(biāo)法。以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)量濃度為2 mg/L。

1.4.7 主要有機(jī)酸含量 液相色譜法[16]。

(1)液相色譜條件：流動(dòng)相為5 mmol/L 的硫酸溶液，柱溫60 ℃，流速0.6 mL/min，檢測(cè)時(shí)間48 min，進(jìn)樣量為20 μL。

(2)定量方法：外標(biāo)法。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘蔗糖蜜常規(guī)指標(biāo)

試驗(yàn)所用甘蔗糖蜜樣品常規(guī)指標(biāo)見(jiàn)表2。從表2可以看出，甘蔗糖蜜中總糖質(zhì)量百分比為66.89%，且總氮質(zhì)量百分比為0.68%，表明糖蜜作為天然的發(fā)酵原料，可以為料酒釀造的微生物繁殖提供豐富的碳源、氮源。而且糖蜜中的活性物質(zhì)一些也可能對(duì)料酒發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用[17]。

表2 糖蜜常規(guī)指標(biāo)Table 2 Molasses regular index

2.2 糖蜜料酒發(fā)酵工藝確定

2.2.1 甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度的確定 料酒是一種低酒精度的配制酒，其酒精度一般在15%vol以下，試驗(yàn)擬選取料酒的酒精度范圍為12%vol～13%vol。由圖1可以看出，隨著初糖質(zhì)量濃度的增加，酒精度和殘?zhí)请S之增加。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為180 g/L時(shí)，殘?zhí)亲畹?，但酒精度低于選取的范圍；且此時(shí)的CO2累積失重也最少，而糖質(zhì)量濃度在200 g/L及以上時(shí)CO2累積失重?zé)o明顯差異，說(shuō)明糖質(zhì)量濃度為180 g/L時(shí)酒母醪中表現(xiàn)為底物不足。當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)到220 g/L及以上時(shí)，酒精度雖升高，但殘?zhí)且搽S之增加。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為200 g/L時(shí)，酒精度為12.6%vol，殘?zhí)菫?0.7 g/L，酒精度符合要求且發(fā)酵較為徹底。故酒母醪中最佳甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度確定為200 g/L。

2.2.2 玉米漿添加量的確定 由圖2(a)可以看出，隨著玉米漿添加量的增加，酒精度逐漸上升，殘?zhí)呛恐饾u下降。由圖2(b)可以看出，隨著玉米漿添加量的增加，CO2累積失重也隨之稍有增加，說(shuō)明氮源供給充足可促進(jìn)發(fā)酵更為徹底。當(dāng)玉米漿添加量為10 g/L時(shí)，酒精度為12.8%vol，殘?zhí)菫? g/L，發(fā)酵最為徹底。故酒母醪中玉米漿的最佳添加量確定為10 g/L。

2.2.3 硫酸銨添加量的確定 由圖3可以看出，隨著硫酸銨添加量的增大，酒精度呈先上升后下降的趨勢(shì)，殘?zhí)呛恐饾u下降。當(dāng)硫酸銨添加量為1 g/L時(shí)，酒精度最高(13%vol)，殘?zhí)且草^低(5.2 g/L)，且此時(shí)CO2累積失重與其他各試驗(yàn)組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明當(dāng)硫酸銨添加量為1 g/L 時(shí)酒母醪中的氮源供給已滿足該發(fā)酵體系的需求。故酒母醪中硫酸銨的最佳添加量確定為1 g/L。

圖1 酒母醪中甘蔗糖蜜初糖濃度的優(yōu)化Figure 1 Optimization of initial sugar concentration of sugarcane molasses in barm mash

圖2 酒母醪中玉米漿添加量的優(yōu)化Figure 2 Optimization of steepwater concentration in barm mash

圖3 酒母醪中硫酸銨添加量的優(yōu)化Figure 3 Optimization of ammonium sulfate concentration in barm mash

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，利用甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)料酒的最佳酒母醪配方為：初糖質(zhì)量濃度200 g/L，玉米漿添加量10 g/L，(NH4)2SO4添加量 1.0 g/L，同時(shí)其他微量元素添加量為：MgSO40.2 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，CaO 0.2 g/L。

2.3 糖蜜發(fā)酵酒小試制備

以甘蔗糖蜜為發(fā)酵原料，根據(jù)2.2中確定的酒母醪配方進(jìn)行5 L發(fā)酵罐小試，酒精度、糖質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線如圖4所示。由圖4可以看出，隨著糖分的消耗，酒精度逐漸升高；待糖分消耗殆盡時(shí)，酒精度也趨于平緩。在發(fā)酵0～12 h時(shí)，糖質(zhì)量濃度下降較慢、酒精度上升較慢，主要是由于此階段為酵母生長(zhǎng)的延滯期，同時(shí)酵母菌利用發(fā)酵酒母醪中的溶氧進(jìn)行細(xì)胞增殖；在發(fā)酵12～36 h 時(shí)，耗糖速度最快，酒精度增幅最大；發(fā)酵36 h后，隨著耗糖速度的減慢，酒精度增幅也隨之減小，并趨于平緩。由此說(shuō)明，該糖蜜料酒的發(fā)酵工藝符合生物工業(yè)發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，具有切實(shí)的可行性。

2.4 糖蜜發(fā)酵酒脫色

甘蔗糖蜜中含有較多的酚類(lèi)色素與焦糖色素，使其色度大、顏色深，經(jīng)酒精發(fā)酵后不但不會(huì)減弱或消褪，而且還會(huì)產(chǎn)生少許的酒精臭味，故糖蜜發(fā)酵酒作為調(diào)味料酒的酒基必須對(duì)其進(jìn)行脫色除臭。常用于釀酒和酒精工業(yè)的脫色介質(zhì)主要有活性炭、淀粉、硅藻土等材料[18-19]，其中活性炭對(duì)以糖蜜為原料的發(fā)酵醪液有極佳的脫色除臭效果且成本低廉，故選用活性炭作為糖蜜發(fā)酵酒的脫色劑。在前期預(yù)試驗(yàn)中對(duì)影響脫色效果的3個(gè)主要因素(活性炭用量、脫色時(shí)間、脫色溫度)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并進(jìn)行了正交試驗(yàn)，其結(jié)果如表3所示。

圖4 酒精度、糖質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線Figure 4 The curve of alcohol and sugar concentration changing with time

由表3可知，影響活性炭脫色的各因素主次順序?yàn)榛钚蕴继砑恿?脫色時(shí)間>脫色溫度。此外，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析，可以確定糖蜜發(fā)酵酒的最佳脫色工藝參數(shù)組合為A2B2C3，即活性炭添加量為2%，脫色時(shí)間為30 min，脫色溫度為55 ℃。

2.5 糖蜜發(fā)酵酒品質(zhì)分析

在最佳脫色工藝條件下，對(duì)2.3中制備的糖蜜發(fā)酵酒進(jìn)行脫色、過(guò)濾后，測(cè)定其主要理化指標(biāo)與風(fēng)味物質(zhì)。

2.5.1 主要理化指標(biāo) 由表4可知，經(jīng)脫色處理后的糖蜜發(fā)酵酒其酒精度為12.8%vol，總糖2.8%，總酸(以乳酸計(jì))4.8 g/L，氨基酸態(tài)氮0.33 g/L，符合調(diào)味料酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SB/T 10416—2007)的相關(guān)要求，適合做糖蜜料酒的酒基。

2.5.2 主要風(fēng)味物質(zhì) 由表5可知，糖蜜發(fā)酵酒中含有豐富的醇類(lèi)、酯類(lèi)和有機(jī)酸。其中醇類(lèi)主要包括β-苯乙醇、異戊醇、異丁醇等，能賦予酒體的醇厚感，同時(shí)對(duì)肉類(lèi)食材具有去腥解膩的作用[20]；酯類(lèi)主要包括乙酸乙酯、乳酸乙酯等，是料酒香氣的主要骨架成分[21]；有機(jī)酸主要包括乙酸、乳酸等，是料酒中的重要呈味物質(zhì)[22]，因此利用甘蔗糖蜜作為釀造料酒的代用原料具有良好的推廣價(jià)值與應(yīng)用前景。

2.6 糖蜜料酒調(diào)配

以脫色后的糖蜜發(fā)酵酒為酒基，參照調(diào)味料酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SB/T 10416—2007)及食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760—2014)的相關(guān)要求，分別對(duì)食鹽、味精、混合香辛料進(jìn)行不同添加量的單因素試驗(yàn)，經(jīng)感官品評(píng)后，10位品酒師中8人優(yōu)選1.5 g/100 mL的食鹽添加量為適宜咸感；6人優(yōu)選0.4 g/100 mL的味精添加量為適宜鮮感；7人優(yōu)選0.06%的混合香辛料添加量為適宜香味。因此按照遵循適合大眾口感的原則，確定糖蜜料酒調(diào)味劑的最適添加量配方為：食鹽1.5 g/100 mL，味精0.4 g/100 mL，混合香辛料0.06%。

表3 活性炭脫色正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Results and analysis of orthogonal test for decolorization of activated carbon

表4 糖蜜發(fā)酵酒主要理化指標(biāo)Table 4 Main physical and chemical indexes of molasses fermented wine

表5 糖蜜發(fā)酵酒中主要風(fēng)味物質(zhì)及其含量Table 5 The content of molasses cooking wine main flavor substances mg/100 mL

2.7 糖蜜料酒質(zhì)量評(píng)定

2.7.1 感官指標(biāo) 色澤：淡黃色，清亮透明，有光澤；香氣：濃郁舒適的香料氣味，香氣協(xié)調(diào)平穩(wěn)；口味：醇厚，柔和鮮爽，無(wú)異雜味；風(fēng)味：酒體協(xié)調(diào)，具有調(diào)味料酒的典型風(fēng)格。

2.7.2 理化指標(biāo) 酒精度(20 ℃)≥12%vol；氨基酸態(tài)氮(以氮計(jì))≥0.2 g/L；總酸(以乳酸計(jì))4.0～5.0 g/L；食鹽(以氯化鈉計(jì))≥10 g/L。

2.7.3 微生物指標(biāo) 細(xì)菌總數(shù)≤50 CFU/mL，大腸菌群≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出。

3 結(jié)論

以甘蔗糖蜜為原料釀造料酒，在基礎(chǔ)微量成分(MgSO4添加量0.2 g/L，NaCl添加量0.5 g/L，KH2PO4添加量0.5 g/L，CaO添加量0.2 g/L)確定的前提下，經(jīng)單因素試驗(yàn)優(yōu)化得到甘蔗糖蜜初糖質(zhì)量濃度為200 g/L、硫酸銨添加量為1.0 g/L、玉米漿添加量為10 g/L。其最佳脫色工藝條件為活性炭添加量2%，脫色時(shí)間30 min，脫色溫度55 ℃。以經(jīng)脫色后得到的糖蜜發(fā)酵酒為酒基開(kāi)發(fā)的新型糖蜜料酒符合調(diào)味料酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SB/T 10416—2007)。后續(xù)將對(duì)甘蔗糖蜜料酒的食品安全、風(fēng)味特征以及烹飪功效等方面進(jìn)行更深入的研究，以期實(shí)現(xiàn)糖蜜料酒的工業(yè)化生產(chǎn)。