艾曉青 竇磊 喬新 楊德琴

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科 口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶401147

牙髓間充質(zhì)細(xì)胞（dental pulp stromal cells，DPSCs）是一種從牙髓組織中分離獲得的常用的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞，已應(yīng)用在多種組織修復(fù)和再生研究中。DPSCs來(lái)源于神經(jīng)嵴，具有自我更新和多向分化的高增殖潛力[1]。外泌體（exosomes）為細(xì)胞通過(guò)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的小囊泡，內(nèi)含豐富的活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）等，可在細(xì)胞間的信息交流與物質(zhì)交換方面發(fā)揮作用[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)：牙髓間充質(zhì)細(xì)胞外泌體（dental pulp stromal cell-exosomes，DPSC-Exo）具有多種治療作用，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有一些應(yīng)用報(bào)道。微環(huán)境對(duì)外泌體的分泌有明顯影響，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境可能起到優(yōu)化細(xì)胞外泌體成分的作用，從而改變外泌體的治療潛能。

細(xì)胞在體內(nèi)呈三維（three-dimension，3D）立體狀態(tài)生長(zhǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞及胞外基質(zhì)之間呈相互作用的狀態(tài)，而目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究均采用傳統(tǒng)的二維（two-dimension，2D）單層細(xì)胞培養(yǎng)模式，即細(xì)胞在平面單層生長(zhǎng)，并且只會(huì)沿著平面延伸，不能很好地復(fù)制細(xì)胞的體內(nèi)微環(huán)境，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能、基因表達(dá)、胞外囊泡分泌和分化能力都有影響。在此基礎(chǔ)上，學(xué)者們[5]嘗試在3D條件下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，主要方式是將細(xì)胞植入到具有3D結(jié)構(gòu)的載體中培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在3D立體空間結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)、增殖、遷移及分化，發(fā)現(xiàn)其干性、增殖及分化潛能與2D培養(yǎng)的細(xì)胞相比存在一些差異，3D培養(yǎng)可放大間充質(zhì)細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)。外泌體作為細(xì)胞旁分泌的重要產(chǎn)物，其分泌及所含miRNA會(huì)隨著細(xì)胞自身狀態(tài)及培養(yǎng)環(huán)境的不同而變化[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)：DPSCs微球較常規(guī)2D培養(yǎng)具有更強(qiáng)的多向分化能力，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq）技術(shù)檢測(cè)，前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、雙調(diào)蛋白（amphiregulin，AREG）、上皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin，EREG）等與血管再生，細(xì)胞遷移、分化、增殖相關(guān)基因的表達(dá)也顯著增高。本課題組在前期研究[8]中也分析了3D培養(yǎng)條件下人DPSCs的基因表達(dá)和蛋白組學(xué)，推測(cè)3D培養(yǎng)也可能會(huì)調(diào)節(jié)DPSC-Exo的miRNA成分，提高DPSC-Exo的治療潛能。

本研究擬對(duì)3D培養(yǎng)模式下的DPSC-Exo miRNA進(jìn)行表達(dá)譜分析，并與2D培養(yǎng)模式下的DPSCExo miRNA進(jìn)行比較，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，探索2種培養(yǎng)條件下DPSC-Exo miRNA的表達(dá)差異，并對(duì)部分差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，評(píng)估3D培養(yǎng)調(diào)節(jié)外泌體的治療應(yīng)用潛能。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)）；培養(yǎng)皿、孔板（Corning公司，美國(guó)）；0.22μm注射式過(guò)濾器、超濾管（Millipore公司，美國(guó)）；低熔點(diǎn)瓊脂糖（Sigma公司，美國(guó)）；exoEasy Maxi Kit試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）；BCA試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人CD63、CD9抗體（南京巴傲得生物科技有限公司）；Goat Anti-rabbit IgG/HRP抗體（ThermoFisher公司，美國(guó)）；顯影儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）（Hitachi公司，日本）；納米顆粒追蹤分析儀（ZetaView公司，德國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及無(wú)血清上清收集

1.2.1 DPSCs的2D培養(yǎng)與上清液收集 經(jīng)患者及家屬知情同意后，收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科門診因正畸拔除的健康前磨牙。本項(xiàng)目倫理方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為CQHS-REC-2020（LSNo.68）。從釉牙骨質(zhì)界將牙齒截?cái)?，在超凈臺(tái)里取出牙髓，改良酶消化法分離培養(yǎng)DPSCs，取第3代細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)，換不含血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集上清液，離心去除沉淀，0.22μm注射式過(guò)濾器過(guò)濾后置于-80℃保存。

1.2.2 DPSCs的3D培養(yǎng)與上清液收集 取同一個(gè)體第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DPSCs，以密度為每毫升6×106個(gè)細(xì)胞的懸液與1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖按體積比1∶1混合，接種至12孔板（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）。靜置30 min待其結(jié)膠后，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基1 mL，3 d后換不含血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，收集上清液，過(guò)濾后置于-80℃保存。

1.3 DPSC-Exo提取

采用exoEasy Maxi Kit試劑盒提取外泌體。將收集的上清液4℃條件下解凍，使用超濾管濃縮，按試劑盒說(shuō)明書要求，依次加X(jué)BP（XBPbinding buffer）和XWP（XWPwash buffer），離心后棄濾液，最后加X(jué)E（XE elution buffer）洗脫重懸，即為外泌體溶液。

1.4 DPSC-Exo鑒定

1.4.1 TEM觀察DPSC-Exo形態(tài) 取新鮮提取的2D和3D培養(yǎng)條件下DPSC-Exo懸液20μL滴于銅網(wǎng)上，10 min后加10μL 2%的醋酸雙氧鈾于銅網(wǎng)上作用1 min，清洗，室溫干燥，樣品上機(jī)，TEM鏡下觀察拍照。

1.4.2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)2D及3D條件下DPSCExo標(biāo)記蛋白CD63、CD9 以體積比外泌體∶RIPA裂解液為2∶1的比例提取外泌體蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，5×蛋白上樣緩沖液混勻后變性10 min，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，根據(jù)說(shuō)明書稀釋兔抗人CD63、CD9抗體，4℃孵育過(guò)夜，室溫下孵二抗1 h。洗膜后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.4.3 納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA） 取新鮮提取的2D及3D培養(yǎng)條件下的DPSC-Exo 50μL準(zhǔn)備檢測(cè)：1）以去離子水清洗樣本池，2）儀器以聚苯乙烯微球（110 nm）校準(zhǔn)，3）以1×PBS buffer（Biological Industries公司，以色列）清洗樣本池，4）樣本以1×PBSbuffer稀釋后進(jìn)樣檢測(cè)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，該檢測(cè)由重慶榮達(dá)生物技術(shù)有限公司合作完成。

1.5 DPSC-Exo miRNA高通量測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)中的DPSC-Exo miRNA高通量測(cè)序由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司合作完成，使用BGISEQ-500進(jìn)行樣本測(cè)序。采用BCA法進(jìn)行外泌體蛋白濃度校正，然后進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建具體流程為：1）總RNA分離，連接5’端和3’端；2）去接頭后cDNA合成；3）cDNA擴(kuò)增，分離目的片段；4）文庫(kù)定量及混合后pooling環(huán)化；5）質(zhì)量檢測(cè)，上機(jī)測(cè)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)去接頭、去低質(zhì)量、去污染等得到可信的備用分析的目標(biāo)序列，對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用華大基因旗下的Dr.Tom平臺(tái)對(duì)miRNA表達(dá)譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)差異倍數(shù)取對(duì)數(shù)，設(shè)置當(dāng)︱log2(3D/2D)︱≥1并Qvalue≤0.001時(shí)視為顯著差異miRNA。選擇基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能，選擇京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對(duì)差異miRNA進(jìn)行通路富集分析，根據(jù)TargetScan靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)部分miRNA進(jìn)行再生修復(fù)相關(guān)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 DPSCs的培養(yǎng)及外泌體的提取鑒定

2D培養(yǎng)條件下，DPSCs貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭狀的成纖維細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)（圖1A）；3D培養(yǎng)條件下，DPSCs細(xì)胞呈球形，分布于膠內(nèi)（圖1B）。通過(guò)柱膜法成功從培養(yǎng)上清中分離出外泌體，TEM檢測(cè)結(jié)果顯示：2D與3D培養(yǎng)DPSC-Exo均呈典型的茶托狀雙層膜結(jié)構(gòu)（圖1C、D）。蛋白免疫印跡法檢測(cè)顯示：2D-DPSC-Exo與3D-DPSC-Exo均表達(dá)CD63、CD9膜蛋白標(biāo)記物（圖1E、F）。NTA檢測(cè)結(jié)果顯示：2D及3D組外泌體粒徑值為30～150 nm（圖1G、H），符合外泌體特征。

圖1 2D及3D培養(yǎng)條件下DPSCs與Exo的培養(yǎng)鑒定Fig 1 Culture and identifite of DPSCs and Exo under 2D and 3D culture conditions

2.2 DPSC-Exo miRNA高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 miRNA差異表達(dá) 共檢測(cè)出253個(gè)miRNA，其中3D組檢測(cè)出222個(gè)，表達(dá)量前5位的miRNA分別為hsa-miR-34a-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-302b-3p和hsa-miR-100-5p；2D組檢測(cè)出154個(gè)，表達(dá)量最高的為let-7家族及hsa-miR-34a-5p；兩組共同表達(dá)的123個(gè)，3D-DPSC-Exo特有表達(dá)的99個(gè)（圖2A），其中顯著差異表達(dá)miRNA 60個(gè)，與2D組相比，3D組表達(dá)上調(diào)27個(gè)，下調(diào)33個(gè)[(︱log2(3D/2D)︱≥1，Qvalue≤0.001]（圖2B）。上調(diào)基因中，hsa-miR-302a/b/c/d-3p家族均顯著增高，差異倍數(shù)（log）分別為5.23、3.04、4.27、4.74倍；同時(shí)，hsa-miR-24-3p（5.37倍）、hsamiR-27b-3p（1.44倍）、hsa-miR-34a-5p（1.38倍）、hsa-miR-100-5p（1.23倍）等均為本底表達(dá)量較高且在3D培養(yǎng)條件下表達(dá)量顯著增高的miRNA（表1）；下調(diào)基因中，本底表達(dá)量均較低，且變化不大。表達(dá)量聚類熱圖見(jiàn)圖3。

圖2 差異miRNA表達(dá)Fig 2 Differential miRNA expression

圖3 2D-DPSC-Exo和3D-DPSC-Exo顯著差異表達(dá)miRNA聚類熱圖Fig 3 Significantly differentially expressed miRNAs in 2D DPSC-Exo and 3D DPSC-Exo

表1 部分上調(diào)差異miRNATab 1 Partial up-regulated miRNA

2.2.2 靶基因預(yù)測(cè) 根據(jù)TargetScan靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異倍數(shù)最大的2個(gè)miRNA進(jìn)行再生修復(fù)有關(guān)的靶基因預(yù)測(cè)：hsa-miR-302的候選靶基因有成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF）19和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等；hsa-miR-24-3p的候選靶基因包括神經(jīng)再生相關(guān)和血管再生、細(xì)胞遷移生長(zhǎng)等相關(guān)，其中神經(jīng)再生相關(guān)的基因包括神經(jīng)元分化因子（neuronal differentiation，NEUROD）2、神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子（neuroepithelial cell transforming，NET）1、NEUROD1、神經(jīng)元再生相關(guān)蛋白（neuronal regeneration-related protein，NREP），而血管再生和細(xì)胞遷移生長(zhǎng)等相關(guān)的基因包括FGF11、FGF結(jié) 合 蛋 白（FGF binding protein，F(xiàn)GFBP）3、FGF受體（FGF receptor，F(xiàn)GFR）3、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β多肽（platelet-derived growth factor receptor beta polypeptide，PDGFRB）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha polypeptide，PDGFRA）、血管生成素（angiopoietin，ANGPT）4、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding protein，IGFBP）5等，部分靶基因見(jiàn)表2。

表2 TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)hsa-miR-302a/b/c/d-3p與hsa-miR-24-3p部分靶基因Tab 2 TargetScan website predicts partial target gene of hsa-miR-302a/b/c/d-3p and hsa-miR-24-3p

2.2.3 GO分析 GO分析結(jié)果顯示：差異miRNA靶基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞過(guò)程（cellular process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）等，主要涉及的分子功能為結(jié)合（binding），且這些差異基因大多為細(xì)胞成分（cell part）（圖4），分別在RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)控（regulation of transcription by RNA polymeraseⅡ）、蛋白結(jié)合（protein binding）、膜（membrane）等方面出現(xiàn)顯著性GO富集（圖5）。

圖4 2D-DPSC-Exo與3D-DPSC-Exo顯著差異表達(dá)miRNA靶基因的GO注釋分類Fig 4 GO annotation classification of target genesof differential miRNA in 2D and 3D-DPSC-Exo

圖5 2D-DPSC-Exo與3D-DPSC-Exo顯著差異表達(dá)miRNA靶基因分別在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能的GO富集情況（Qvalue≤0.05）Fig 5 GOterm histogram of enrichment of target genesof differential miRNAin biological process,cell component and molecular function of 2D-DPSC-Exo and 3D-DPSC-Exo(Qvalue≤0.05)

2.2.4 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析的前20條通路見(jiàn)圖6：代謝通路（metabolic pathways）的富集程度最高，所含靶基因數(shù)目最多，為1 610個(gè)；其次為癌癥相關(guān)通路（pathways in cancer），含靶基因632個(gè)；此外，在Hippo信號(hào)通路（Hippo signaling pathway）、自噬（autophagy）等通路上也存在顯著富集。

圖6 2D-DPSC-Exo與3D-DPSC-Exo顯著差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG通路分析（Qvalue≤0.05）Fig 6 KEGGenrichment pathway of target genesof differential miRNA in 2D-DPSC-Exo and 3D-DPSC-Exo(Qvalue≤0.05)

3 討論

外泌體作為細(xì)胞分泌囊泡中的一類功能成分，避免了直接應(yīng)用細(xì)胞的弊端，具有較高的研究和臨床轉(zhuǎn)換價(jià)值。牙源性干細(xì)胞外泌體已被證明在多種疾病治療中存在作用，如新型的仿生蓋髓術(shù)[9]、創(chuàng)傷后的腦損傷功能恢復(fù)[10]等，但絕大多數(shù)研究都是應(yīng)用2D培養(yǎng)的細(xì)胞外泌體。本研究獲得了3D-DPSC-Exo miRNA表達(dá)譜，證明其與2D培養(yǎng)存在一些差異，為優(yōu)化DPSC-Exo生物功效提供了依據(jù)，也是一次重要嘗試。本研究共檢測(cè)出253個(gè)miRNA，3D組222個(gè)，2D組154個(gè)，其中60個(gè)存在顯著差異，對(duì)其中部分通路相關(guān)的差異miRNA進(jìn)行初步探討，并進(jìn)行生物學(xué)分析和組織再生修復(fù)相關(guān)靶基因預(yù)測(cè)。

miR-302a/b/c/d家族能夠通過(guò)雙調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡途徑來(lái)調(diào)控人胚胎干細(xì)胞的自我更新，是一類在干細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化等方面都有顯著作用的miRNA[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-302a/b/c/d在3D培養(yǎng)下表達(dá)量均顯著增高，可靶向FGF19與EGFR的表達(dá)，發(fā)揮組織再生與修復(fù)功能。FGF19與脂質(zhì)、葡萄糖等多種代謝途徑相關(guān)，而人體中表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TGF-α）是EGFR最重要的兩種配體，發(fā)揮著細(xì)胞增殖、血管生成、抑制凋亡等生理功能[13]。miR-302家族在腫瘤疾病中也具有重要的調(diào)控作用。有研究[14]報(bào)道：外泌體來(lái)源的miR-302b可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型受體（transforming growth factor beta typeⅡreceptor，TGFβRⅡ）/細(xì)胞外蛋白調(diào)節(jié)信號(hào)激酶（extra cellular signal-regulated protein kinase，ERK）途徑抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，為人類肺癌治療提供了潛在靶點(diǎn)。綜上所述，miR-302家族具有干細(xì)胞特性及腫瘤抑制因子特性，3D培養(yǎng)可優(yōu)化DPSC-Exo miR-302a/b/c/d表達(dá)。

miR-24-3p作為一個(gè)表觀遺傳調(diào)控因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等方面均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[15]，是被廣泛深入研究的miRNA之一。靶基因預(yù)測(cè)顯示，hsa-miR-24-3p可靶向多個(gè)mRNA發(fā)揮組織再生功能，如與神經(jīng)再生相關(guān)的NEUROD2、NET1、NEUROD1和NREP，與血管再生和細(xì)胞遷移生長(zhǎng)等相關(guān)的FGF11、FGFBP3、FGFR3、PDGFRB、PDGFRA、ANGPT4、IGFBP5等。本研究中，3D培養(yǎng)DPSC-Exo表達(dá)量顯著增加，表明3D培養(yǎng)模式可有效提高miR-24-3p的表達(dá)，為其在再生修復(fù)相關(guān)領(lǐng)域的深入研究奠定基礎(chǔ)。

KEGG通路富集分析顯示：2D與3D條件下DPSC-Exo差異miRNA的靶基因富集于多個(gè)通路，具有一定的研究前景。最顯著的是代謝通路（metabolic pathways），所含靶基因數(shù)目最多，該通路在次生代謝物的生物合成和嘌呤代謝通路上也存在富集作用，這可能與細(xì)胞在2D與3D培養(yǎng)條件下不同的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。3D條件下，細(xì)胞成球形生長(zhǎng)，增殖緩慢，部分miRNA表達(dá)顯著增高，如上述的miR-302和miR-24-3p等；同時(shí)，顯著差異表達(dá)的miRNA靶基因在癌癥通路也存在富集作用，如miR-27b-3p與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16-17]；差異miRNA在Hippo信號(hào)通路、自噬等通路上同樣存在富集。Hippo信號(hào)通路在器官大小、癌癥發(fā)生、組織再生等功能上均有重要作用[18]；而自噬是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。miR-34a-5p與miR-100-5p在2D及3D中表達(dá)量均較高，多項(xiàng)研究[19-20]已證明它們?cè)谘装Y抑制方面具有顯著作用，且與自噬相關(guān)。miR-34a-5p與miR-100-5p在一些炎癥疾病的治療中可能發(fā)揮一定的作用。

近年來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的興起，多項(xiàng)研究[21-23]表明3D培養(yǎng)比2D培養(yǎng)更適合用于多種領(lǐng)域，包括組織再生及癌癥生物學(xué)。如3D培養(yǎng)Hertwig上皮 性 根 鞘 細(xì) 胞（Hertwig’s epithelial root sheath，HERS）促進(jìn)了細(xì)胞的擴(kuò)張率，產(chǎn)生了更多的礦化組織并促進(jìn)了牙本質(zhì)樣組織的形成，這可能會(huì)開創(chuàng)牙齒相關(guān)組織再生領(lǐng)域的新時(shí)代[21]；過(guò)表達(dá)血小板源性生長(zhǎng)因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）并包裹在熱敏水凝膠中的人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）可以更好地發(fā)揮治療牙槽骨缺損的作用[22]。而通過(guò)3D培養(yǎng)技術(shù)，成功發(fā)現(xiàn)MG53（mitsugumin-53）可通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinaseB，AKT）信號(hào)通路抑制舌癌細(xì)胞的發(fā)展[23]。隨著3D培養(yǎng)技術(shù)及外泌體應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展，二者結(jié)合將有更廣闊的運(yùn)用前景。

綜上，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，對(duì)2D-DPSC-Exo及3D-DPSC-Exo miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3D-DPSCExo中部分miRNA表達(dá)量顯著升高，差異miRNA主要富集在代謝、腫瘤、Hippo與自噬等相關(guān)通路，可能靶向多種mRNA從而起到促進(jìn)組織修復(fù)再生的治療作用。3D培養(yǎng)條件下DPSC-Exo可能更具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，在今后采用DPSC-Exo進(jìn)行組織再生修復(fù)、腫瘤、發(fā)育代謝等研究時(shí)，不妨提取3D生長(zhǎng)條件下的細(xì)胞外泌體。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。