唐雪妹，陳志廷，黃健祥，謝書越，劉 帥，王 剛，萬 凱*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)技術(shù)研究所，廣東 廣州 510640；2.國家農(nóng)業(yè)檢測(cè)基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（農(nóng)藥殘留），廣東 廣州 510640；3.廣東農(nóng)科監(jiān)測(cè)科技有限公司，廣東 廣州 510640）

如今，食品安全問題越來越受到公眾的關(guān)注，食品中未知污染物的存在對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅，因此開發(fā)非靶向分析方法以發(fā)現(xiàn)食品中潛在風(fēng)險(xiǎn)因子備受重視［1－2］。農(nóng)藥殘留是影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素之一，由于農(nóng)藥含量較低且大量干擾物質(zhì)可與農(nóng)藥共萃取，對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生不良影響，因此復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)仍然是一項(xiàng)有挑戰(zhàn)的工作［3］。開發(fā)農(nóng)產(chǎn)品中非靶向農(nóng)藥殘留分析方法對(duì)于保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全至關(guān)重要。

液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用正成為一種包括組學(xué)分析、環(huán)境分析和食品安全分析在內(nèi)的許多領(lǐng)域的重要分析工具［4－6］。對(duì)于特定目標(biāo)物的分析，三重四極桿質(zhì)譜儀（Triple quadrupole mass spectrometer，QQQ）具有良好的定量性能，是目前常用的質(zhì)譜儀。然而，QQQ 質(zhì)譜通常僅限于分析已知化合物，難以在復(fù)雜的食物基質(zhì)中檢測(cè)和識(shí)別未知化合物［7］。高分辨質(zhì)譜具有高分辨率和高質(zhì)量精確度，已成為一種有效的非靶向篩查儀器，在各種食品基質(zhì)中的不同有害物非靶向篩選中得到了廣泛應(yīng)用，如蔬菜水果［8］、畜禽水產(chǎn)［9－10］、茶葉［11］、中藥材［12］等。農(nóng)產(chǎn)品中風(fēng)險(xiǎn)因子的識(shí)別和確認(rèn)往往需要采用準(zhǔn)確質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間（tR）、特征碎片離子、同位素比等信息，基于包含大量化合物信息的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫以及結(jié)合Metlin、Massbank、Human Metabolome Database（HMDB）等在線數(shù)據(jù)庫搜索加以判斷［13］。然而受儀器參數(shù)、實(shí)驗(yàn)條件等影響，不同實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的數(shù)據(jù)庫難以實(shí)現(xiàn)通用，商業(yè)化數(shù)據(jù)庫應(yīng)用受到一定限制。

本研究開發(fā)了一種基于超高效液相色譜－高分辨率質(zhì)譜（UHPLC－HRMS）的農(nóng)藥殘留識(shí)別與確認(rèn)的非靶向篩選策略。建立了簡(jiǎn)單、高效的樣品預(yù)處理和分析方法，引用tR校準(zhǔn)方法校正不同LCMS 下產(chǎn)生的保留時(shí)間，在原有商品化高分辨二級(jí)碎片譜圖庫的基礎(chǔ)上，結(jié)合各國對(duì)農(nóng)產(chǎn)品不同農(nóng)藥限量的實(shí)際情況，建立了651 種農(nóng)藥高分辨二級(jí)碎片譜圖數(shù)據(jù)庫，并選擇其中的108 種典型農(nóng)藥作為代表進(jìn)行本方法的評(píng)估驗(yàn)證。將該策略應(yīng)用于果蔬農(nóng)藥殘留的非定性篩查，取得了滿意的篩選結(jié)果，為非靶向農(nóng)藥篩查打下了重要基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）；KQ－800 KDE 型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Multi Reax 自動(dòng)渦旋儀（德國Heidolph 公司）；5804 R 離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Milli－Q 超純水儀（Merk Millipore 公司）；電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）。乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸、甲酸銨（HPLC 級(jí)，Aladdin 公司）；NaCl、無水MgSO4（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；PSA（50～60μm）、GCB（40～120μm）（迪馬科技有限公司）。

1.2 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.001 mg）于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，進(jìn)一步用甲醇稀釋成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，－20 ℃貯存。

1.3 樣品前處理

豇豆用不銹鋼刀切成2 cm 大小的碎塊，在不銹鋼盆中充分混勻后以四分法分取200 g 左右，經(jīng)組織勻漿機(jī)勻漿后裝入樣品袋中，于－20 ℃保存。

準(zhǔn)確稱取豇豆樣品10 g（精確至0.001 g）于50 mL 離心管中，加入20 mL 1%乙酸乙腈，渦旋混勻2 min 后，加入2 g NaCl 和4 g 無水MgSO4，渦旋2 min，以5 000 r/min 離心5 min，取上清液1 mL，加入凈化試劑（PSA 20 mg，無水MgSO4150 mg，GCB 2.5 mg，C1820 mg），渦旋混勻1 min，于5 000 r/min離心5 min；取上清液用0.22μm有機(jī)濾膜過濾，待液相色譜－高分辨質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜條件：水相為0.1%甲酸－5 mmol/L 甲酸銨的水溶液，有機(jī)相為0.1%甲酸－5 mmol/L 甲酸銨的甲醇溶液，A 為水相－有機(jī)相（98∶2，體積比），B 為有機(jī)相－水相（98∶2，體積比）。梯度洗脫：0～1 min，20% B；1～5.5 min，20%～90% B；5.5～11 min，90%～100% B；11～11.5 min，100%～0%B；11.5～12 min，0%B。進(jìn)樣量：5μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；Accucore aQ C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6μm）。

質(zhì)譜條件：采用HESI 離子化方式；噴霧電壓3.0 kV；毛細(xì)管溫度325 ℃；加熱器溫度350 ℃；鞘氣40 arb，輔助氣10 arb；掃描模式為Full MS/dd－MS2，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～900，正離子采集模式；分辨率采用Full MS 70000 FWHM、dd－MS217500 FWHM、NCE：20、40和60。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的優(yōu)化非靶向篩查的目的是從樣品中獲取盡可能多的信息，因此前處理是樣品分析過程中的關(guān)鍵步驟?？焖兕A(yù)處理方法必須平衡大多數(shù)目標(biāo)化合物的回收率并有效地除去額外雜質(zhì)。本研究選擇包含殺蟲劑、殺菌劑、除草劑及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等不同類型、極性跨度大的108 種農(nóng)藥作為典型代表，采用改進(jìn)QuEChERS法對(duì)本方法的提取溶劑和凈化劑進(jìn)行優(yōu)化。

在分散固相萃取方法中，通常采用乙腈或甲醇作為提取劑，為保證不同類型化合物的穩(wěn)定性，往往需添加酸性、堿性或者緩沖鹽等［14］。由于甲醇溶解能力更強(qiáng)，導(dǎo)致提取的雜質(zhì)增多，因此本文比較了乙腈以及含0.1%、0.5%、1%乙酸的乙腈對(duì)豇豆樣品的萃取效率。結(jié)果顯示，90 種農(nóng)藥在中性和酸性乙腈條件下的提取回收率無明顯差異，并滿足定量實(shí)驗(yàn)的要求；而稻瘟靈和五氟磺草胺的提取回收率僅在酸性乙腈中滿足要求，霜霉威、氟啶脲和仲丁威的回收率隨著乙酸含量的增加而提高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乙腈中加酸可有效地保護(hù)一些不穩(wěn)定的農(nóng)藥［15］。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用含1%乙酸的乙腈作為提取劑，以滿足98%農(nóng)藥的回收率要求（見表1）。

表1 108種代表性農(nóng)藥在不同提取劑中的加標(biāo)回收率統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistical analysis of recoveries of 108 representative pesticides with different extraction solvents

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化與普通固相萃取法相比，QuEChERS法具有一定優(yōu)勢(shì)，常用PSA、C18和GCB等吸附劑進(jìn)行基質(zhì)凈化［16－17］。其中PSA可有效消除有機(jī)酸、脂肪酸和樣品中的碳水化合物，與C18結(jié)合使用可去除其他脂質(zhì)和固醇類。GCB 對(duì)色素、多酚以及其他極性化合物具有很強(qiáng)的去除效果，但對(duì)平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥存在一定的吸附作用，導(dǎo)致回收率降低。因此，本研究對(duì)比了不同凈化劑配比條件下，典型農(nóng)藥在豇豆和柑橘中的加標(biāo)回收情況。結(jié)果表明豇豆提取液顏色較深，有必要進(jìn)一步純化和去除色素，而選擇2.5 mg GCB 能夠很好去除色素并確保回收率，達(dá)到滿意結(jié)果。與豇豆相比，柑橘基質(zhì)含水量較高且含有高碳水化合物，色素含量較少，加入GCB 對(duì)目標(biāo)化合物的吸附效果明顯。進(jìn)一步對(duì)凈化劑的用量進(jìn)行優(yōu)化，研究表明深色蔬菜類選用20 mg PSA+20 mg C18+2.5 mg GCB+150 mg無水MgSO4凈化劑組合時(shí)效果較好，而淺色多糖水果類選用20 mg PSA+150 mg無水MgSO4凈化劑時(shí)效果較好。

2.1.3 色譜－質(zhì)譜條件的優(yōu)化通過實(shí)驗(yàn)比較，表明ThermoFisher Accucore aQ C18柱更適合多農(nóng)藥殘留的分析。選擇合適洗脫梯度，12 min 可完成樣品的分析。采用雙流動(dòng)相梯度洗脫模式，考察了不同酸堿度以及緩沖鹽條件下各農(nóng)藥的分離及離子化效率。本研究最終采用水（含0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸銨）與甲醇（含0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸銨）作為流動(dòng)相，建立了UHPLC－HRMS 快速分析方法。在12 min 內(nèi)，分離出108 種農(nóng)藥殘留，提取的離子色譜（EIC）如圖1 所示?？梢钥闯?，分析物的tR值在整個(gè)分析時(shí)間內(nèi)均勻分布，且分析物能與共洗脫基質(zhì)有效分離。

為選擇最佳質(zhì)譜參數(shù)以獲得更靈敏、更準(zhǔn)確的信息，本研究采用Full Scan/dd－MS2（TopN）質(zhì)譜掃描模式采集數(shù)據(jù)。一級(jí)采用全掃描，二級(jí)采用數(shù)據(jù)依賴離子碎裂模式，所有化合物的碰撞能設(shè)置為梯度NCE，最終得到的二級(jí)質(zhì)譜圖是梯度能量下碰撞得到的質(zhì)譜疊加圖。有效地避免了由于不同實(shí)驗(yàn)室中軌道飛行儀器的單次碰撞能量差異而導(dǎo)致的低重現(xiàn)性，簡(jiǎn)化了碰撞能優(yōu)化和質(zhì)譜方法。

2.2 定性篩查與確證

2.2.1 保留時(shí)間的校正本研究引用保留時(shí)間（RT）校準(zhǔn)方法來校正不同LC－MS 條件下產(chǎn)生的RT，并在原有商品化高分辨數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，結(jié)合各國對(duì)農(nóng)產(chǎn)品不同農(nóng)藥限量的實(shí)際情況，建立了包含651 種農(nóng)藥的高分辨二級(jí)碎片內(nèi)部數(shù)據(jù)庫。保留時(shí)間校正法可克服不同儀器方法、不同采集序列的RT漂移，使不同實(shí)驗(yàn)室間的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫得到廣泛應(yīng)用。選用11種相對(duì)穩(wěn)定，保留時(shí)間在整個(gè)分析時(shí)段分布相對(duì)均勻的農(nóng)藥作為保留時(shí)間校正劑（RTcal），對(duì)不同洗脫梯度的RT 數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。RTcal混合物的提取離子流圖分布如圖2A所示，其在0～11 min時(shí)間跨度內(nèi)均有分布。圖2B展示了保留時(shí)間校準(zhǔn)方法的原理示意圖，該方法利用RT校正劑將整個(gè)色譜圖劃分為12個(gè)時(shí)間間隔，除了第一個(gè)和最后一個(gè)，其他10個(gè)時(shí)間間隔均包含兩個(gè)RTcal。參照文獻(xiàn)中保留時(shí)間校正公式［17］：

圖2 保留時(shí)間的校正Fig.2 Correction of retention time

2.2.2 農(nóng)藥殘留的非靶向篩查本文建立的包含651 種農(nóng)藥高分辨二級(jí)碎片內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)由保留時(shí)間校正方法和農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定獲得。其中，一部分參數(shù)（包括農(nóng)藥名稱、準(zhǔn)確分子質(zhì)量以及碎片離子信息）來源于商業(yè)化數(shù)據(jù)庫，利用保留時(shí)間校正方法得到其在本文建立的分析條件下對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，從而形成一套完整的數(shù)據(jù)庫信息；另一部分參數(shù)來源于購買的標(biāo)樣在本文建立的分析條件下得到的保留時(shí)間、準(zhǔn)確分子量以及碎片信息。將這兩部分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Tricefinder 數(shù)據(jù)分析軟件從而建立包含651 種農(nóng)藥的數(shù)據(jù)庫。在鑒定目標(biāo)化合物時(shí)，未知物的篩查基于保留時(shí)間、前驅(qū)離子的質(zhì)量準(zhǔn)確度以及碎片離子和同位素峰豐度比匹配度等參數(shù)。依據(jù)歐盟標(biāo)準(zhǔn)2002/657/EC，高分辨定性方法只需母離子和1 個(gè)子離子匹配即可定性。TraceFinder 軟件具有內(nèi)置同位素模式評(píng)分系統(tǒng)和數(shù)據(jù)庫搜索功能，并且評(píng)分過程絕對(duì)自動(dòng)化和智能化，可提供大量化合物的快速常規(guī)篩查和鑒定。本文設(shè)定了以下定性參數(shù)：保留時(shí)間誤差范圍為± 0.5 min，質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差范圍為± 5 ppm，同位素比匹配分?jǐn)?shù)75 分以上，碎片離子匹配個(gè)數(shù)為1 個(gè)以上。本方法所建立的蔬果中農(nóng)殘非靶向定性篩查技術(shù)可滿足方法學(xué)要求。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 靈敏度與線性范圍在優(yōu)化條件下，采用本方法對(duì)質(zhì)量濃度分別5、25、50、100、250、500μg/L 的108種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)全掃描離子色譜峰面積（Y）與分析物的質(zhì)量濃度（X，μg/L）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，所有化合物的相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99，表明質(zhì)量濃度在5～500μg/L范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系（見表2）。參考?xì)W盟SANTE/12682/2019規(guī)定，檢出限（LOD）為3倍信噪比（S/N）的濃度，定量下限（LOQ）為具有可接受回收率（70.0%～120%）且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<20%的最低添加濃度，測(cè)得本方法的LOD為0.002～1.5μg/kg，LOQ為5μg/kg（詳見表2）。

表2 108種農(nóng)藥的檢出限、定量下限、相關(guān)系數(shù)（r2）、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 LODs，LOQs，correlation coefficients（r2），recoveries and RSDs of 108 pesticides

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為評(píng)估分析方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，將不同質(zhì)量濃度的108種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白豇豆和柑橘樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)影響的研究，加標(biāo)水平分別為5、25、100μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)5個(gè)樣品，以溶劑空白和樣品空白作為對(duì)照。結(jié)果表明，除了滅蠅胺和矮壯素以外，蔬菜和水果中106種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率分別為61.2%～117%和61.3%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.1%～9.9%和0.1%～9.9%。表明該方法的準(zhǔn)確性和精密度滿足農(nóng)藥殘留的分析要求。

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.4 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對(duì)58批次豇豆樣品和12批次柑橘樣品進(jìn)行快速篩查和定量分析。豇豆樣品篩查出的農(nóng)藥主要為滅蠅胺（檢出率48.3%）、苯醚甲環(huán)唑（檢出率22.4%）、吡唑醚菌酯（檢出率22.4%）、啶蟲脒（19.0%）等，其中滅蠅胺未在豇豆上登記使用，超范圍使用易導(dǎo)致產(chǎn)品不合格。柑橘樣品中篩查出殺蟲劑吡蟲啉和保鮮殺菌劑咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇等，含量均低于國家規(guī)定的最大殘留限量值，安全風(fēng)險(xiǎn)較低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法適用于蔬菜水果中農(nóng)藥殘留的篩查分析。

3 結(jié) 論

本文利用UHPLC－HRMS 建立了果蔬中農(nóng)藥殘留快速篩查和定量分析的方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的篩查。引入的保留時(shí)間校正法可有效地利用不同實(shí)驗(yàn)條件下獲得的數(shù)據(jù)庫，拓寬液相色譜－高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的適用范圍，提高定性篩查的準(zhǔn)確性。本方法簡(jiǎn)單、可靠，應(yīng)用于大量樣品的快速篩查和定量，表現(xiàn)出良好的性能，滿足農(nóng)產(chǎn)品中非定向農(nóng)藥的快速篩查與定量分析，為保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了技術(shù)支撐。