徐美玲，張 瑜，桑 明，王普清

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，2.湖北省帕金森病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖北襄陽 441000）

人體腸道中定植了大量細菌，其基因總數(shù)約為人體基因數(shù)的150 倍，稱為人體“第二腦”。近些年，多項研究顯示諸多疾病的發(fā)生可能與菌群結(jié)構(gòu)紊亂有關(guān)。因此有研究人員嘗試用糞菌移植的方法治療復(fù)發(fā)性艱難梭菌感染、肥胖、代謝綜合征和自閉癥等疾?。?-4］，且已取得一定效果。在糞菌移植研究中，小鼠是極好的模型，但因無特定病原體級（specific pathogen free，SPF）小鼠及野生型小鼠存在定植抗性，即原始的腸道菌群對外源細菌定植存在抵抗。所以無菌小鼠成為了研究者們的首要選擇。但是，無菌動物存在價格昂貴、獲取困難、飼養(yǎng)要求高的缺點及限制［5］。綜上考慮，多個研究機構(gòu)選擇先用抗生素處理降低常規(guī)小鼠或SPF 小鼠的定植抗性，然后再進行腸道菌群移植研究［6-8］。但對于抗生素的使用方法及糞菌移植的時間尚無統(tǒng)一意見，且構(gòu)建人源化小鼠方法的可行性，尚無系統(tǒng)報道。

因此，在既往研究基礎(chǔ)上［3，8-10］，本實驗選擇了一種目前常用且未曾被驗證過的方法，通過對小鼠一般情況、腸道菌群的消耗情況以及移植糞菌定植效果3 個方面研究，對該構(gòu)建人源化小鼠方法的可行性進行新驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6 周齡SPF 級雄性野生型C57BL/6 小鼠，來自中國湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院中心實驗室［SYXK（鄂）2017-0093］。飼養(yǎng)期間各組小鼠可自由獲得食物和水。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度控制在40%～60%，溫度控制在（24.0±2.0）℃。本研究方案經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽第一人民醫(yī)院倫理委員會批準（2019DW0 08），并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實驗試劑 氨芐青霉素（A6265，Macklin），硫酸新霉素（N6063，Macklin），甲硝唑（M813526，Macklin），萬古霉素（V6062，Macklin），革蘭氏染色試劑（G1060，Solarbio），QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（51604，Qiagen），PCR MIX（D7251，Beyotime），DNA ladder（D0107，Beyotime），普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP209，TIANGEN），GoTaq Qpcr Master Mix（A60001，Promega）

1.1.3 實驗儀器 生物安全柜（Hfsmfe-1500LC，上海力申科學(xué)（力康），中國），電子天平（STX1202 ZH，OHAUS，中國），麻醉機（R580，瑞沃德，中國），分光光度計，Veriti?96-Well Thermal Cycler儀，電泳儀，7500 Fast Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計 為明確抗生素處理對腸道微生物的消耗情況及小鼠腸道的影響，小鼠被隨機分為2 組，抗生素組（n=10）：用氨芐青霉素1 g/L、硫酸新霉素1 g/L、甲硝唑1 g/L、萬古霉素0.5 g/L 混入滅菌飲用水中連續(xù)3 周［6，11］。對照組（n=10）：用滅菌飲用水喂養(yǎng)小鼠3 周。在實驗期間每3～4 d 記錄動物體重、飲用水消耗量及飼料消耗情況。

為評價抗生素處理后對后續(xù)移植糞菌定植效果的影響，小鼠被隨機分為2 組：移植1 號人糞菌組（n=7）：給予抗生素處理后小鼠移植1 號人的糞菌1周；移植2 號人糞菌組（n=7）：給予抗生素處理后小鼠移植2 號人的糞菌1 周。

1.2.2 革蘭氏染色 收集小鼠新鮮糞便于無菌EP管中，每10 mg 糞便加入無菌生理鹽水100 μL，靜置15 min 后勻漿直至完全溶解，1 000 r/min，4 ℃下離心5 min，收集上清液，混勻后抽取10 μL，滴于載玻片上，按革蘭氏染色試劑說明書制作糞菌涂片并染色觀察。

1.2.3 糞便細菌DNA 提取 按QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 說明書提取糞便細菌DNA。用分光光度計在260 nm 處測量DNA 濃度，并通過測量A260/A280 來評估純度。保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR 引物特異性驗證 本文所用引物序列由金開瑞生物工程有限公司（武漢）商業(yè)化合成。對上述提取的糞菌DNA 行普通PCR 驗證引物特異性。20 μL 反應(yīng)體系包括2×master mix 12.5 μL，引物（Bacteroidetes：forward primer，5'-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3'；reverse primer，5'-AGCTGACGA-CAACCATGCAG-3'；Firmicutes：forward primer，5'GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGC-A-3'；reverse primer，5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3'）［12，13］（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板5 μL，無核酶水5.5 μL。采用Veriti?96-Well Thermal Cycler 儀進行擴增。反應(yīng)程序為：95 ℃變性5 min 后，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s 共35 個循環(huán)，最后以72 ℃10 min 延伸后結(jié)束。用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 標準曲線的制作及RT-PCR 條件 對上述電泳后凝膠，按照普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒說明書，進行切膠，純化回收DNA 處理。隨后使用分光光度計測濃度及純度后，保存在-20 ℃。并按公式計算細菌拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=［6.02×1023×濃度（ng/μL）×10-9］/（DNA 長度×660）計算出每毫升PCR 所含的拷貝數(shù)，然后做10 倍系列稀釋，使其形成105～1010拷貝/mL，進行熒光定量PCR。PCR條件為：20 μL 反應(yīng)體系包括2×master mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA 模板25 ng，用無核酶水補足至20 μL。擴增程序為50 ℃循環(huán)1 次，持續(xù)2 min；95 ℃循環(huán)1 次，持續(xù)10 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40 次。以模板的不同l g（拷貝數(shù)）為縱坐標，以PCR 反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（CT）為橫坐標繪制標準曲線。后續(xù)RT-PCR 均按上述條件執(zhí)行。

1.2.6 糞菌制備及移植 移植糞菌的制備：收集新鮮糞便于無菌離心管中，用無菌PBS（5 mL/g）浸泡，4 ℃下放置約15 min 或渦旋直至混勻，以1 000 r/m 離心，4 ℃離心5 min。留取上清液。上清液與等體積的50%無菌甘油的混合至終濃度25% ，然后儲存在-80 ℃直到移植。糞菌移植：每只小鼠每天灌胃200 μL 糞菌懸液，共持續(xù)7 d。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計結(jié)果用均值±標準誤差（Mean ±SEM）表示。所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0 軟件處理，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗生素混合處理對小鼠一般情況的影響

根據(jù)既往研究文獻［14］，在小鼠飲用水中添加氨芐青霉素、萬古霉素、新霉素和甲硝唑4 種抗生素來消耗其原本的腸道微生物群。然后對抗生素處理期間小鼠體重變化及食水的消耗量進行記錄并分析。結(jié)果顯示：相比于正常對照組，抗生素處理組小鼠飲用水消耗明顯減少（P=0.000 3，t=4.232，F(xiàn)=1.940，圖1A）；飼料消耗也減少（P=0.001 2，t=3.716，F(xiàn)=1.759，圖1B）。體重變化方面，正常飲用水組與抗生素處理組小鼠體重在實驗開始前沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.217 8，t=1.277，F(xiàn)=3.019，圖1C），而在給予小鼠廣譜抗生素處理第1 周，小鼠體重下降明顯，尤其是前3 天（P＜0.000 1，t=5.869，F(xiàn)=6.943，圖1E），隨后兩組小鼠體重均呈增加趨勢，最后在抗生素處理3 周結(jié)束時，兩組小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.747 6，t=0.326 8，F(xiàn)=7.959，圖1D）。對于小鼠糞便性質(zhì)觀察，在整個抗生素處理過程中，部分小鼠體重出現(xiàn)稀便、大便不成型癥狀，但期間無便血，未予以處理，觀察1 d 后可自行緩解。且整個抗生素處理階段，兩組小鼠均無死亡現(xiàn)象。

圖1 抗生素組與對照組飲水量消耗（A）、飼料消耗（B）及體重變化情況（C-E）Fig 1 Water intake，food intake and weight changes of the mice in the antibiotic and control groups

2.2 抗生素處理消耗原有腸道微生物，降低定植抗性

在抗生素處理3 周后分別對兩組小鼠的新鮮糞便行糞便涂片及革蘭氏染色。結(jié)果顯示，抗生素處理后小鼠糞便微生物數(shù)量明顯下降，但抗生素處理不能完全清除腸道微生物（圖2A、2B）。抗生素處理結(jié)束后，解剖小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠腸道存在盲腸擴張（圖2C、2D），符合無菌小鼠相關(guān)表現(xiàn)［14-16］。

同時，對小鼠腸道長度進行測量分析，結(jié)果顯示抗生素處理后小鼠腸道長度未有明顯異常（P=0.823 1，t=0.238 7，F(xiàn)=1.590，圖2D、2E）。

圖2 抗生素干預(yù)后小鼠糞便革蘭氏染色（A、B）、腸道外觀（C、D）及腸道長度情況（D、E）Fig 2 Gram staining of mice feces、intestinal appearance and the gut length of mice after antibiotic intervention

2.3 糞菌移植后小鼠腸道菌群的定植情況

首先，普通PCR 顯示擬桿菌及厚壁菌的引物特異性良好（圖3A）。隨后標準曲線制作，得到厚壁菌的標準曲線（圖3B）為：Y=-0.292 3×X+13.05（R2=0.980 4）；擬桿菌的標準曲線（圖3C）為Y=-0.275 8×X+10.63（R2=0.999 7）。最后通過RTPCR 分別對糞菌移植的供體及受體糞便微生物進行檢測（圖3D～F），結(jié)果顯示，1 號人糞菌比2 號人糞便中的擬桿菌高（P=0.001 0，t=5.930，F(xiàn)=13.63）、厚壁菌低（P=0.001 5，t=5.545，F(xiàn)=1.522）及厚壁菌/擬桿菌濃度低（P=0.001 2，t=5.726，F(xiàn)=1.578），比例分別為104.0%、33.7% 和32.0%。在糞菌移植后7 d，1 號小鼠比2 號小鼠擬桿菌濃度高（P=0.014 5，t=3.402，F(xiàn)=1.683），厚壁菌濃度低（P=0.000 1，t=8.809，F(xiàn)=6.992），厚壁菌/擬桿菌濃度低（P=0.000 2，t=8.031，F(xiàn)=8.430），比例分別為112.0%、15.4%和13.7%。

圖3 糞菌移植后供體人糞菌與受體小鼠糞菌比較Fig 3 Comparison of donor human feces and recipient mouse feces after transplantation

3 討論

本研究對一種比較常用的使SPF 小鼠人源化方法的可行性進行新驗證。其中不同于Schuijt 等［6］僅對抗生素處理后小鼠腸道進行評價及Le Roy等［17］和Emal 等［18］僅側(cè)重于糞菌移植后糞菌的定植效果，本研究選擇通過對抗生素處理后小鼠一般情況、抗生素處理后糞便微生物消耗情況、糞菌移植的定植效果3 個方面的聯(lián)合研究驗證。

其中，為明確多種抗生素聯(lián)合處理的安全性，首先評估了抗生素處理對小鼠一般情況的影響。發(fā)現(xiàn)抗生素處理減少小鼠飲用水消耗，結(jié)果同之前研究存在一致性［14］，考慮原因可能為飲用水含有較苦的甲硝唑所致。有部分研究為改善抗生素飲用水味道，給予飲用水中添加甜味劑［11］或葡萄糖［18］，但是本實驗為防止以上物質(zhì)影響小鼠代謝，繼而使實驗結(jié)果產(chǎn)生偏差，所以未添加。而小鼠飼料消耗降低，考慮原因為廣譜抗生素致腸道菌群消耗，從而進一步影響消化功能及食欲。體重方面，正常組體重呈穩(wěn)步上升的趨勢，而抗生素組體重趨勢為先下降，在1 周左右達到最低，而后上升，最后與正常組持平。與Reikvam 等［14］的報道一致，在引入抗生素治療后第4～5 天，小鼠經(jīng)歷了短暫的體重減輕，但在1 周內(nèi)，接受抗生素治療的小鼠與未治療的小鼠相比恢復(fù)了體重，并且看起來很健康。其中Reikvam 等［14］認為是氨芐青霉素的原因，而本研究經(jīng)觀察后認為抗生素組前期體重降低原因為小鼠飲用水及飼料攝入少所致，隨后體重增加，考慮抗生素處理后小鼠盲腸擴張，腸內(nèi)容物多而導(dǎo)致小鼠體重增加的假象?？傮w上而言，抗生素處理期間，未出現(xiàn)死亡等嚴重不良事件，表明抗生素處理小鼠腸菌是安全可行的。

鑒于抗生素組飲用水消耗明顯減少，小鼠攝入抗生素劑量是否可以達到消耗原有腸道微生物降低定植抗性的目的，用革蘭氏染色對抗生素處理后小鼠腸道微生物做了定性檢測，提示抗生素處理后小鼠腸道微生物消耗明顯，而且盲腸擴張情況符合無菌小鼠表現(xiàn)。本研究雖然缺少抗生素處理前后糞便微生物的絕對定量分析，但定性結(jié)果同其他既往實驗結(jié)果一致［8，9］。眾所周知，長期抗生素處理可能導(dǎo)致抗生素相關(guān)性腸炎［19］，而小鼠腸炎多數(shù)表現(xiàn)為腸道長度異常。本研究顯示抗生素處理后小鼠腸道長度無明顯異常。提示抗生素處理可消耗腸道微生物構(gòu)建相對無菌動物。

如前所述，糞菌移植是將供體糞便微生物移植到受體胃腸道內(nèi)，重建新的腸道菌群，實現(xiàn)腸道及腸道外疾病的治療。為了建立人源化動物模型，且明確該方法是否使人源腸道微生物定植于小鼠腸道內(nèi)。課題組給予腸道微生物消耗小鼠連續(xù)1 周移植人冷凍糞便微生物懸液，隨后分別對糞菌移植供體及受體的糞便微生物進行RT-PCR 定量。結(jié)果顯示，抗生素處理后再給予糞菌移植不僅可以使微生物定植于消化道，而且接受1 號人與2 號人糞菌的小鼠之間腸道菌群的差異和1 號人與2 號人原本糞便微生物的差異趨勢存在一致性。該結(jié)果同Hintze 等［8］推薦使用抗生素聯(lián)合糞菌移植處理建立人源化動物模型存在一致性，但是二者選擇抗生素種類不同，灌胃周期也不同。而且兩種方法均存在的弊端是不會導(dǎo)致供體糞便微生物與受體糞便微生物的完全一致性。對于本研究而言，1 號人糞菌與1 號小鼠二者厚壁菌濃度、擬桿菌濃度及厚壁菌與擬桿菌濃度比例均存在差異；2 號人糞菌與2 號小鼠在厚壁菌濃度及擬桿菌濃度存在差異，而厚壁菌與擬桿菌濃度比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異。分析其原因可能為人與小鼠種屬及飲食結(jié)構(gòu)不同，腸道微生物存在差異性；或者是糞菌移植本身只能定植一部分的腸道微生物［3，20］。

在本研究中，課題組通過對抗生素處理后一般情況、抗生素處理后糞便微生物消耗情況、抗生素處理后糞菌移植的定植效果3 個方面的研究結(jié)果表明，通過抗生素處理及糞菌移植可以使SPF 級小鼠人源化，而且是安全可行的。但是糞菌移植仍有個體化差異存在，應(yīng)該在設(shè)計未來的糞菌移植實驗方案時需考慮進去。

作者貢獻度說明

徐美玲：實驗操作、數(shù)據(jù)分析、文章撰寫。張瑜：文章修改。桑明：實驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析。王普清：實驗設(shè)計、文章修改。