程春生，楊德志，李 宏，李秋蘭，楊亞玲,

（1.昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650032）

茶是我國重要經(jīng)濟(jì)作物及健康飲料，茶葉中富含茶多酚、多糖、咖啡因等多種活性物質(zhì)[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用[1-2]。茶葉的重金屬污染問題嚴(yán)重影響了茶葉的品質(zhì)，同時(shí)也影響了茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。由于重金屬能使人體中的蛋白質(zhì)變性，以鉛為代表的重金屬，超過一定濃度會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定危害[4]。隨著人們環(huán)保觀念的提升，對(duì)茶葉等作物中鉛含量的測(cè)定也越來越受到重視[5]，如GB 2762—2017《食品中污染物限量》[6]中規(guī)定茶葉中鉛含量不大于5 mg/kg，DB 440300/T 22—2002《無公害茶葉》也規(guī)定茶葉鉛含量不大于2 mg/kg[7]。目前，鉛的測(cè)定方法主要包括原子吸收法[8]、原子熒光法[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜[10]、電化學(xué)法及比色探針法[11-12]。其中比色探針法由于操作簡(jiǎn)單、快速、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備而備受關(guān)注[13]。為了實(shí)現(xiàn)Pb(II)的超靈敏度測(cè)定，研究通常需要信號(hào)放大才能獲得良好的靈敏度和低的檢測(cè)限。

天然酶屬于一類兼有專一性和高效性的生物催化劑，具有很大的擴(kuò)展分析潛力，但天然過氧化物酶容易受到傳感條件的影響，在較寬的溫度和pH值范圍內(nèi)不能保持較高的催化活性[14]。納米酶作為一類新型的模擬酶，它具有許多其他傳統(tǒng)模擬酶所無法企及的優(yōu)點(diǎn)[15]，人們可以根據(jù)納米材料模擬酶的特性，進(jìn)行研究并加以利用，使納米酶具有更大的應(yīng)用前景。碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）是一種尺寸小于10 nm的新型碳納米材料，其表面可以修飾不同的官能團(tuán)[16]。已報(bào)道其在過氧化物模擬酶研究中具有很好的前景，特別是金屬摻雜CDs[17]。基于金屬的可變價(jià)態(tài)，金屬摻雜CDs表現(xiàn)出更優(yōu)異的過氧化物模擬酶活性。

本研究報(bào)道一種通過Pb(II)調(diào)節(jié)銅、碘摻雜CDs（Cu, I-CDs）過氧化物模擬酶活性，增強(qiáng)比色探針信號(hào)測(cè)定茶葉中Pb(II)的新方法，如圖1所示。由于Cu, I-CDs在酸性條件下催化H2O2產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)一步氧化底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）生成藍(lán)色氧化型TMB（oxidized TMB，oxTMB），Pb(II)存在增強(qiáng)了TMB的氧化，由此建立茶葉中痕量Pb(II)的比色探針檢測(cè)方法。該方法具有較強(qiáng)的抗干擾能力，共存的其他金屬離子及陰離子沒有干擾，可用于茶葉中Pb(II)的測(cè)定。

圖1 基于促進(jìn)Cu, I-CDs催化活性的Pb(II)檢測(cè)比色傳感器示意圖Fig.1 Schematic illustration of the colorimetric sensor for Pb(II)detection based on its ability to promote the catalytic activity of Cu, I-CDs

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化銅（純度98%）、3-碘-L-酪氨酸（純度99%）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TMB（純度98%） 美國Sigma-Aldrich公司；H2O2溶液（30%） 衡陽市凱信化工試劑有限公司；Pb元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Tecnai G2 TF30場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡 荷蘭FEI公司；X射線衍射儀、TENsoR27型傅里葉紅外光譜分析儀德國Bruker公司；XW-800快速混勻器 上海汗諾儀器有限公司；AA2800石墨爐原子吸收光譜儀 美國安捷倫科技有限公司；HC-3018R型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；120 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜 上海-凱實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pHS-3B精密酸度計(jì)德國賽多利司公司；AB204-S電子分析天平 美國梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu, I-CDs的合成

分別準(zhǔn)確稱取1.6 g CuCl2、0.4 g 3-碘-L-酪氨酸溶于20 mL超純水中，超聲10 min使其混合均勻，將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜中，于180 ℃恒溫加熱8 h，反應(yīng)完成后自然冷卻至室溫，得棕色溶液。將所得溶液過0.22 μm濾膜以除去大顆粒雜質(zhì)，再經(jīng)10 000 r/min高速離心15 min，得到Cu, I-CDs，并于4 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 比色探針測(cè)定Pb(II)

在EP管中依次加入65 μL Cu, I-CDs、50 μL 10 mmol/L H2O2溶液和25 μL 150 mmol/L TMB溶液，一定質(zhì)量濃度的Pb(II)標(biāo)準(zhǔn)溶液，2 mL pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分混勻，室溫孵育30 min后吸收光譜掃描，以波長654 nm的吸光度進(jìn)行定量。設(shè)定ΔA=A－A0，A為加入Pb(II)后溶液的吸光度；A0為未加入Pb(II)空白時(shí)溶液的吸光度。

1.3.3 Cu, I-CDs的催化機(jī)制分析

為了揭示Cu, I-CDs作為過氧化物模擬酶與底物的催化過程，在65 μL Cu, I-CDs（35 μg/mL）和2 mL pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入不同濃度的H2O2。充分混勻，室溫孵育30 min后在波長654 nm的位置進(jìn)行吸光度測(cè)定。典型的米氏方程模型：1/V=（Km/Vmax）（1/[S]）＋1/Km。V為反應(yīng)速率/（mol/（L·s））；Km為米氏常數(shù)/（mmol/L）；Vmax為最大反應(yīng)速率/（mol/（L·s））；[S]為底物H2O2濃度/（mmol/L）。

為明晰Pb(II)的增敏機(jī)制，以65 μL不同濃度的Cu, I-CDs加到50 μL 10 mmol/L H2O2和25 μL 150 mmol/L TMB溶液中，然后加入不同濃度的Pb(II)，充分混勻，測(cè)定吸光度。

1.3.4 樣品的消解及Pb(II)的測(cè)定

稱取茶葉樣品0.500 0 g，置于100 mL錐形瓶中，加硝酸10 mL、高氯酸0.5 mL，置于電熱板上加熱消解。若消化液呈棕褐色，再加少量硝酸，消化至冒白煙，消化液呈無色透明或略帶黃色。冷卻后，用水將試樣溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻待測(cè)。按照同一方法做空白實(shí)驗(yàn)。Pb(II)測(cè)定按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行，同時(shí)通過GB 5009.12—2017《食品中鉛的測(cè)定》方法測(cè)定以驗(yàn)證研究方法的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu, I-CDs模擬酶的表征

從圖2A可以看出，所制備的Cu, I-CDs呈現(xiàn)類球形，分散性較好，且尺寸大約為3～5 nm。如圖2B所示，3 445 cm－1位置的峰歸屬于O—H和N—H的伸縮振動(dòng)，1 632、l 466 cm－1處的峰為C＝O和C—N的振動(dòng)特征峰，1 175、1 058 cm－1處的峰分別歸屬于C—N、C—O的伸縮振動(dòng)[18-20]。此外，在529 cm－1位置看到C—I的拉伸振動(dòng)峰[21]。C—I鍵進(jìn)一步證明了所制備的CDs中含有碘元素。從以上分析可以得出，Cu, I-CDs表面存在氨基、羧基和其他親水官能團(tuán)，導(dǎo)致Cu, I-CDs的水溶性及穩(wěn)定性較強(qiáng)。從圖2C可以看出，在2θ為25.2°處出現(xiàn)一個(gè)較為明顯的衍射峰，對(duì)應(yīng)于石墨的（002）層面，說明Cu, I-CDs包含類石墨烯結(jié)構(gòu)[22-23]。從圖2D可以看到，6 個(gè)不同的特征峰，分別為C1s、N1s、O1s、Cu LMM、I3d5和Cu2p[24]，表明該材料存在C、N、O、Cu和I元素，這與圖2B的檢測(cè)結(jié)果一致。上述表征結(jié)果說明，通過水熱法制備的Cu, I-CDs材料較為成功。

圖2 Cu, I-CDs的表征分析Fig.2 Characterization of Cu, I-CDs

2.2 比色探針測(cè)定Pb(II)的原理

如圖3A所示，Cu, I-CDs對(duì)TMB的氧化能力稍弱，再加入Pb(II)后其氧化能力顯著提高。此外，單獨(dú)Pb(II)或加入H2O2對(duì)TMB幾乎沒有氧化效果。上述結(jié)果表明Cu, I-CDs對(duì)H2O2介導(dǎo)的TMB氧化反應(yīng)具有一定催化作用；當(dāng)Cu, I-CDs與Pb(II)同時(shí)加入H2O2-TMB溶液時(shí)，體系的吸光度進(jìn)一步升高，且隨著Pb(II)濃度的增加而逐漸上升。在波長654 nm處，溶液的吸光度及溶液顏色加深程度隨Pb(II)濃度增加而增加，且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系（圖3B）。因此，可以用此吸光度變化的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb(II)的檢測(cè)。

圖3 Pb(II)測(cè)定的機(jī)理Fig.3 Mechanism of Pb(II) determination

羥自由基可以與苯甲酸反應(yīng)生成羥基苯甲酸，其在激發(fā)波長為330 nm時(shí)會(huì)產(chǎn)生熒光[25]。為了驗(yàn)證研究體系中羥自由基的產(chǎn)生，分別使用苯甲酸捕捉Pb(II)＋H2O2、Cu, I-CDs＋H2O2和Cu, I-CDs＋Pb(II)＋H2O2體系中產(chǎn)生的羥自由基。結(jié)果如圖3C所示，Pb(II)＋H2O2體系中幾乎無羥自由基產(chǎn)生，而Cu, I-CDs＋H2O2和Cu, I-CDs＋Pb(II)＋H2O2體系中則產(chǎn)生了一定量的羥自由基，因此單獨(dú)使用Pb(II)無法催化氧化TMB。此外，在加入Pb(II)到體系中后，羥自由基含量明顯增加。有研究表明，Pb(II)和Hg(II)等重金屬，在一定程度上可吸附在模擬酶表面，從而改變模擬酶表面的性質(zhì)，從而提升模擬酶的穩(wěn)定性和催化效果[26]。上述研究結(jié)果表明，在Cu, I-CDs＋H2O2體系中加入Pb(II)可有效促進(jìn)藍(lán)色oxTMB的生成。

2.3 比色探針測(cè)定Pb(II)的條件優(yōu)化

2.3.1 溶液pH值對(duì)體系的影響

一般天然納米酶在酸性環(huán)境下會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化活性。為了獲得比色探針高靈敏測(cè)定Pb(II)的最優(yōu)pH值，實(shí)驗(yàn)選用0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作為緩沖體系，考察緩沖溶液pH值的影響。如圖4所示，緩沖溶液pH值在4.0～5.0范圍內(nèi)，Pb(II)對(duì)Cu, I-CDs過氧化物模擬酶活性有明顯增強(qiáng)作用，在pH 4.0時(shí)催化氧化TMB效果最佳。因此，研究選用pH 4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

圖4 溶液pH值對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.4 Effect of pH on the reaction system

2.3.2 底物含量對(duì)體系的影響

H2O2在Cu, I-CDs過氧化物模擬酶的催化作用下，能產(chǎn)生羥自由基，其又能進(jìn)一步氧化TMB產(chǎn)生藍(lán)色oxTMB，因此底物的加入量對(duì)Cu, I-CDs過氧化物模擬酶活性有很大影響。如圖5A所示，H2O2用量在10～70 μmol/L時(shí)，吸光度迅速增加，說明足量的H2O2能促使體系氧化反應(yīng)更完全；H2O2用量在50～70 μmol/L時(shí)，吸光度反而下降，可能是因?yàn)檫^量H2O2使生成的產(chǎn)物進(jìn)一步氧化，導(dǎo)致吸光度下降。如圖5B所示，TMB用量在10～30 μmol/L時(shí)，吸光度增加幅度較大；TMB用量在30～50 μmol/L時(shí)，吸光度基本平緩但有逐漸下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)樵谝欢縃2O2存在下，過量的TMB不能被H2O2完全氧化，背景值卻逐漸增高，因而，體系的吸光度逐漸降低。因此，本實(shí)驗(yàn)分別將H2O2和TMB用量定為50 μmol/L和30 μmol/L。

圖5 H2O2濃度（A）和TMB濃度（B）對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.5 Effects of H2O2 concentration (A) and TMB concentration (B)on the reaction system

2.3.3 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響

如圖6所示，在室溫（25 ℃）下，反應(yīng)10 min，吸光度即基本保持穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇室溫（25 ℃）下反應(yīng)10 min。

圖6 反應(yīng)溫度與時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.6 Effects of reaction temperature and time on the reaction system

2.4 Cu, I-CDs過氧化物酶活性的動(dòng)力學(xué)分析

為了揭示Cu, I-CDs作為過氧化物模擬酶與底物的催化過程，研究進(jìn)行了Cu, I-CDs的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。由圖7A可知，在適宜條件下，Cu, I-CDs催化底物H2O2-TMB反應(yīng)與典型的米氏動(dòng)力學(xué)方程相符合，催化反應(yīng)隨H2O2底物濃度的增加明顯增加[27-28]。表明Cu, I-CDs可能先與底物H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)一步氧化底物TMB生成藍(lán)色oxTMB。并用雙倒數(shù)法[29-30]計(jì)算獲得米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax（圖7B），見表1。結(jié)果表明：Cu, I-CDs對(duì)H2O2，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km及Vmax都比辣根過氧化物酶高，展示了更高的酶活性。并且Cu, I-CDs＋Pb(II)展現(xiàn)出更好的催化活性。

圖7 Cu, I-CDs過氧化物酶活性的動(dòng)力學(xué)分析Fig.7 Kinetic analysis of peroxidase-like activity of Cu, I-CDs

表1 以H2O2為底物的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）的比較Table 1 Comparison of Michaelis-Menten constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) with H2O2 as the substrate

2.5 線性范圍、檢出限和精密度

在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，按1.3.2節(jié)方法，加入不同濃度Pb(II)標(biāo)準(zhǔn)液。隨著Pb(II)質(zhì)量濃度增加，溶液顏色逐漸加深（圖3B，插圖），在波長654 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Pb(II)質(zhì)量濃度在0.27～27.02 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.989 6，檢出限為34.3 μg/L。

2.6 比色探針對(duì)Pb(II)測(cè)定的選擇性

考察茶葉樣品中可能存在的共存離子對(duì)比色探針體系的影響。如圖8所示，在Pb(II)質(zhì)量濃度為0.27 mg/L時(shí)，分別加入100 倍質(zhì)量濃度的K＋、Na＋、Cl－；50 倍的Mg2＋、Zn2＋、Ca2＋、Cd2＋、Al3＋、Cu2＋、Fe3＋、NO3－、SO42－、NH4＋；2 倍的Hg2＋、Ag＋。研究結(jié)果表明，其他共存離子幾乎不會(huì)對(duì)體系催化oxTMB產(chǎn)生影響，因而測(cè)定結(jié)果也不存在干擾。上述結(jié)果表明，該方法具有良好的選擇性和抗干擾效果，可選擇性用于Pb(II)的測(cè)定。

圖8 共存離子對(duì)比色探針體系的影響Fig.8 Effects of coexisting ions on the colorimetric probe system

2.7 茶葉樣品的測(cè)定

先按1.3.4節(jié)的濕法消解方法，分別處理并檢測(cè)了6 個(gè)茶葉樣品并根據(jù)茶葉標(biāo)準(zhǔn)樣品（GBW10016和GBW10052）中Pb(II)的濃度進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。在最優(yōu)條件下，樣品測(cè)定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，只有2 個(gè)茶葉樣品中檢出Pb(II)，其余樣品均未檢出，且樣品的加標(biāo)回收率在92.41%～101.85%范圍內(nèi)。該研究結(jié)果符合GB 5009.12—2017《食品中鉛的測(cè)定》要求的精密度，本研究測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于4.47%，表明用本法測(cè)定茶葉中Pb(II)結(jié)果精密度高、穩(wěn)定性好。此外，為了驗(yàn)證所建立方法的可靠性，同時(shí)用GB 5009.12—2017中石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行Pb含量測(cè)定，2種方法檢測(cè)表明，二者檢測(cè)結(jié)果較為一致，說明所建立方法的準(zhǔn)確度高。

表2 茶葉樣品中Pb(II)含量的測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 Recoveries and precision of Pb(II) in actual tea samples (n = 6)

3 結(jié) 論

本研究建立了一種基于CDs的過氧化物模擬酶的比色探針測(cè)定Pb(II)的方法。先以水熱法制備Cu, I-CDs模擬酶材料，其可以催化H2O2產(chǎn)生羥自由基，因而可以進(jìn)一步氧化TMB生成藍(lán)色oxTMB。Pb(II)的存在，可以促進(jìn)Cu，I-CDs模擬酶催化氧化TMB，產(chǎn)生顏色更深的oxTMB。結(jié)果表明，該反應(yīng)體系對(duì)Pb(II)有非常好的選擇性，抗干擾性強(qiáng)。在最優(yōu)條件下，Pb(II)檢出限可以達(dá)到34.3 μg/L。實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果也表明，該研究方法的回收率較高（92.41%～101.85%），準(zhǔn)確性好，抗干擾能力強(qiáng)，可用于茶葉中Pb(II)含量的測(cè)定。此外，該研究也進(jìn)一步證明Pb(II)有利于提升模擬酶的催化效果，但其提升模擬酶催化性能的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。