魯晏宏，郝金輝，詹發(fā)強(qiáng)，王 寧，侯新強(qiáng)，楊 蓉，包慧芳，龍宣杞

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2 .新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】庫(kù)爾勒香梨味甜爽滑、香氣濃郁、皮薄肉細(xì)等特點(diǎn)[1]。香梨貯藏過(guò)程中需要VC、糖分等來(lái)維持采后的生命活動(dòng)，導(dǎo)致其防御能力降低，在運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中容易發(fā)生腐爛現(xiàn)象，黑斑病即為香梨高發(fā)的采后病害之一。香梨受到黑斑病為享，導(dǎo)致香梨爛果、掉果[2]。香梨是新疆優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品，從香梨樹(shù)體中篩選對(duì)香梨黑斑病病原菌有拮抗作用的內(nèi)生菌，對(duì)庫(kù)爾勒香梨采后生物保鮮具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物內(nèi)生菌是指生活在植物組織內(nèi)部，不會(huì)對(duì)植物組織造成病癥的微生物[3, 4]。植物內(nèi)生菌多種多樣且普遍存在。植物內(nèi)生菌與植物是互惠的共生關(guān)系，內(nèi)生菌可利用宿主營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，反之，內(nèi)生菌可通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)或自身的代謝產(chǎn)物影響宿主的生長(zhǎng)發(fā)育等[5-8]。內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物具有抗氧化效果甚至可以影響果蔬防御酶的活性。隆麗林等[9]研究發(fā)現(xiàn)，虎杖內(nèi)生菌發(fā)酵液具有延長(zhǎng)草莓貯藏期的作用；金衛(wèi)華等[10]研究發(fā)現(xiàn)櫻樹(shù)內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物具有抗氧化的活性；徐良雄等[11]發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌PeziculaneosporulosaSC1337具有良好的水果防腐保鮮效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)香梨黑斑病病原菌分離及拮抗菌篩選鑒定文獻(xiàn)較少，需篩選對(duì)香梨黑斑病菌有拮抗作用的內(nèi)生菌，研究庫(kù)爾勒香梨采后生防保鮮技術(shù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究從香梨樹(shù)體中篩選出對(duì)采后黑斑病病原菌具有拮抗作用的內(nèi)生菌，并對(duì)其應(yīng)用效果進(jìn)行研究，獲得效果優(yōu)良的香梨黑斑病生物保鮮菌種，為香梨采后保鮮提供重要的理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 香梨樹(shù)組織

庫(kù)爾勒香梨葉片、庫(kù)爾勒香梨樹(shù)枝條，采摘于新疆庫(kù)爾勒梨園。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L。

馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯浸出粉6 g/L，葡萄糖20 g/L。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉 3 g/L,氯化鈉5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉 3 g/L,氯化鈉5 g/L調(diào)整pH值至7.2左右。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離、純化及鑒定

1.2.1.1 病原菌分離、純化

以常規(guī)組織分離法對(duì)感病香梨果實(shí)進(jìn)行病原菌分離純化[12-13]，挑選有黑斑病癥狀的香梨果實(shí)50個(gè)以上，75%酒精消毒30s，無(wú)菌水沖洗5次，用1%次氯酸鈉消毒1min，無(wú)菌水沖洗5次，切取病鍵交界處果肉置于PDA培養(yǎng)基于28℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d。挑取長(zhǎng)出的真菌菌絲邊緣接種至新PDA平板純化培養(yǎng)，多次轉(zhuǎn)接至菌絲狀態(tài)一致，將純化后的菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

采用美國(guó)Zymo Research 公司Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005試劑盒提取真菌基因組。以基因組DNA為模板，ITS基因ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)為引物[14-15]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Mix 25 μL，ITS1 (10 μM) 1 μL，ITS4(10 μM)1 μL，DNA模版 1 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)包括：變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 50 s；延伸72℃ 10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 拮抗菌分離、純化

采摘新鮮的梨樹(shù)葉片和梨樹(shù)枝條，75%酒精消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，1%次氯酸鈉消毒3 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，取最后1次沖洗無(wú)菌水涂板作為對(duì)照組。用無(wú)菌剪刀將消毒處理后的葉片/枝條剪碎，采用無(wú)菌研缽充分研磨，研磨過(guò)程中分批次共加入5 mL無(wú)菌水[10，16]。分別吸取200 μL研磨液分別涂布于NA上，置于28℃恒溫箱培養(yǎng)5～7 d。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至新平板純化培養(yǎng)，多次轉(zhuǎn)接至菌落形態(tài)一致，將純化后的菌落轉(zhuǎn)接至NA斜面，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 拮抗菌篩選

1.2.3.1 拮抗菌初篩

采用平板對(duì)峙法，每個(gè)培養(yǎng)皿傾倒25mL PDA培養(yǎng)基，備用。用無(wú)菌打孔器、鑷子將活化的病原菌菌餅置于PDA平板中央[17-18]，在菌餅周?chē)鶆蚪臃N4株拮抗菌，每株菌重復(fù)接種3塊平板，置于28℃恒溫箱培養(yǎng)3～5 d，觀察內(nèi)生菌對(duì)病原菌的抑制作用。

1.2.3.2 拮抗菌復(fù)篩

采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵液的抑菌性[17-18]，對(duì)拮抗菌的抑菌效果進(jìn)行復(fù)篩。每個(gè)培養(yǎng)皿傾倒25 mL PDA培養(yǎng)基，備用。挑取拮抗菌單菌落接入50 mL NB液體培養(yǎng)基，于28℃ 160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h后，調(diào)整發(fā)酵液至最低OD600值為0.473左右，取1 mL發(fā)酵液于離心機(jī)12 000 r/min 離心25 min，備用。挑取病原菌菌絲接種至PDB液體培養(yǎng)基，于28℃ 160 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)20 h后，備用。吸取200 μl病原菌菌液涂布于PDA平板上，在PDA平板上放置兩個(gè)牛津杯，吸取200 μL上清液添加于牛津杯中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察抑菌效果。

1.2.4 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

采用美國(guó)Zymo Research 公司Fungal/Bacterial DNA MiniprepTM D6005試劑盒提取提取拮抗菌基因組DNA。用細(xì)菌通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)，以PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Mix 25 μL,27F(10 μM) 1 μL,1 492R(10 μM) 1 μL,模版1 μL，ddH2O 22 μL[21-22]。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)包括：變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s；延伸72℃ 10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 拮抗菌抑菌效果測(cè)定

1.2.5.1 有損傷法接種拮抗菌

選取復(fù)篩抑菌效果較好的拮抗菌，挑取單菌落接種至100 mL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基，于28℃ 160r/min培養(yǎng)16 h備用。將香梨洗凈晾干后，用1%次氯酸鈉消毒1 min，晾干。在香梨上打3個(gè)直徑6 mm深5 mm孔，分別添加3 μL拮抗菌菌液(CK1)；3 μL病原菌菌液(CK2)；3 μL拮抗菌菌液+3 μL病原菌懸液(CL)[23]。觀察果實(shí)發(fā)病狀況，統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病后病斑直徑并根據(jù)如下公式計(jì)算抑菌率。

1.2.5.2 無(wú)損傷法接種拮抗菌

挑取拮抗菌單菌落接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基于28℃ 160 r/min培養(yǎng)14 h后備用。將香梨果實(shí)洗凈晾干后，用1%次氯酸鈉進(jìn)行30 s消毒處理，晾干后，浸沒(méi)于100 mL拮抗菌發(fā)酵液中3 min，取出室溫25℃放置24 h。將無(wú)菌牙簽浸沒(méi)于病原菌菌懸液10 s，在果實(shí)上采用針刺接種法接種病原菌，置于室溫放置。有發(fā)病癥狀開(kāi)始統(tǒng)計(jì)病斑直徑。

抑菌率(%)=

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA7.0軟件構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用office 2019 excel進(jìn)行圖表繪制，采用SPSS中one-way ANOVA中的Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

2.1.1 病原菌的分離純化

研究表明，從50個(gè)香梨果實(shí)上分到的病原菌從外部形態(tài)大致分3類(lèi)，一類(lèi)顏色為白色，結(jié)構(gòu)干燥蓬松，正面呈雪白色，分離率為6%，命名為XL1；一類(lèi)菌株正反面均為黑色，生長(zhǎng)后期菌株上出現(xiàn)白色菌絲，分離率為86%，命名為XL2；一類(lèi)菌株生長(zhǎng)初期為白色，后期菌落逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗌?，分離率為8%，命名為XL3。 圖1

注：(a)XL1病原菌菌株平板內(nèi)形態(tài)為(b)XL2病原菌菌株平板內(nèi)形態(tài)(c)XL2回接發(fā)病圖(d)XL2感染病原菌香梨縱切圖(e)XL3病原菌菌株平板內(nèi)形態(tài)為(f)XL3回接發(fā)病圖 (g)XL3感染病原菌香梨縱切圖

2.1.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

研究表明，XL1為鐮孢菌；XL2與鏈格孢AlternatiaalternataZTCA11基因同源性高達(dá)99%，XL2為香梨黑斑病病原菌與目前已有梨黑斑病報(bào)道病原菌菌株一致，因后續(xù)實(shí)驗(yàn)以XL2為靶標(biāo)菌株進(jìn)行拮抗菌篩選。XL3與擴(kuò)展青霉PenicilliumexpansumFP2基因同源性高達(dá)98%，XL3為擴(kuò)展青霉。 圖2，圖3

圖2 XL2基于rDNA-ITS基因序列的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of strain XL2 based on ITS gene sequences

注：分支上的數(shù)字為Bootstrap值，表示構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)計(jì)算1000次時(shí)形成該節(jié)點(diǎn)的百分比，只顯示大于50%的的值；括號(hào)內(nèi)數(shù)值為GenBank登錄號(hào)；標(biāo)尺0.1代表10%的16S r RNA基因序列的進(jìn)化差異。

2.2 拮抗菌的篩選

研究表明，篩選出具有拮抗香梨黑斑病的菌株8株，分別為NY1、NY2、NY5、NY7、NY9、NY10、NY11、NY15，其中NY2、NY7、NY15對(duì)病原菌有較好

的抑制效果，抑菌圈直徑均可達(dá)20 mm以上。其次抑菌效果較好的為NY5、NY11，抑菌圈直徑可達(dá)14 mm以上。表1，圖4

表1 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)鏈格孢抑菌效果Table1 Oxford cup AGAR diffusion inhibition results

圖4 拮抗菌對(duì)XL2抑菌作用Fig.4 Antagonistic activity of antagonist against XL2

2.3 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

研究表明，8株拮抗菌均為芽孢桿菌屬，BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。圖5，圖6

圖5 拮抗菌基于16s rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR amplification of antagonistic bacteria based on 16S rRNA gene sequences

注：分支上的數(shù)字為Bootstrap值，表示構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)時(shí)計(jì)算1000次時(shí)形成該節(jié)點(diǎn)的百分比，只顯示大于50%的的值；括號(hào)內(nèi)數(shù)值為GenBank登錄號(hào)；標(biāo)尺0.1代表10%的16S r RNA基因序列的進(jìn)化差異。

2.4 庫(kù)爾勒香梨黑斑病抑菌試驗(yàn)

2.4.1 損傷接種拮抗菌

研究表明，4 d時(shí)，離體果實(shí)開(kāi)始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，統(tǒng)計(jì)5 d時(shí)病斑直徑，并以此計(jì)算抑菌率。其中抑菌效果最好的為NY2、NY15可達(dá)30%以上，其次為NY11，抑菌率可達(dá)20%以上。僅接種拮抗菌發(fā)酵液CK1，表面未出現(xiàn)發(fā)病癥狀；CK2僅接種病原菌，病原菌病斑平均值可達(dá)20 mm以上。表2

表2 發(fā)酵液在庫(kù)爾勒香梨對(duì)病原菌抑制率Table 2 Inhibitory rate of pathogenic bacteria in Korla fragrant pear

2.4.2 無(wú)損傷接種拮抗菌

研究表明，NY2在4 d時(shí)抑菌效果最佳，抑菌率可達(dá)到80%以上，NY11在4 d時(shí)抑菌率低于NY2、NY15，但在接種5～7d時(shí)，抑菌效果最佳。6d時(shí)，NY11防效達(dá)到27%，優(yōu)于NY2和NY5的防效。 圖7

注：標(biāo)有*表示與其余組差異顯著(P<0.05)

3 討 論

研究?jī)H從梨樹(shù)中篩得16株內(nèi)生菌，且其中有拮抗效果的內(nèi)生菌均鑒定為芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)中分離得到的內(nèi)生菌不夠豐富，是由于盡管實(shí)驗(yàn)所使用的分離方法在分離具有一定功能的目標(biāo)微生物方面被廣泛應(yīng)用，但絕大部分菌株仍是較難培養(yǎng)的，被鑒定分離的菌株僅為其總數(shù)的1%～10%[24]。研究分離出的拮抗內(nèi)生菌經(jīng)過(guò)16S rRNA基因序列分析，均為芽孢桿菌屬，分別為BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。研究從新疆庫(kù)爾勒香梨梨樹(shù)中篩選獲得的NY2、NY15貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液能顯著抑制AlternatiaalternataXL2在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。NY2在離體果實(shí)抑菌實(shí)驗(yàn)中也有較佳效果，在離體果實(shí)實(shí)驗(yàn)無(wú)損傷接種中前期(4 d)時(shí)，能達(dá)到80%以上的抑菌率。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NY11在PDA培養(yǎng)基上抑菌效果并不突出，但在庫(kù)爾勒香梨抑菌效果實(shí)驗(yàn)中效果較優(yōu)，且抑菌效果較為穩(wěn)定。生防菌產(chǎn)生抑菌效果主要機(jī)制一為生態(tài)占位二為產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。分析NY2主要依靠分泌抑菌物質(zhì)拮抗病原菌，所以后期抑菌效果較差；NY11定殖能力較好且主要靠生理占位拮抗病原菌，所以后期抑菌效果優(yōu)于NY2。NY7在平板對(duì)峙中抑菌效果較好，但在香梨上抑菌表現(xiàn)明顯衰減，考慮NY7在香梨上定殖能力較差。無(wú)損傷接種拮抗菌由于梨果個(gè)體間存在差異，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到梨果個(gè)體抗菌差異的影響。對(duì)比NY2、NY11、NY15無(wú)損傷接種拮抗菌于有損傷接種拮抗菌5 d時(shí)抑菌率，推測(cè)NY2、NY11菌株對(duì)于果皮滲透性較好，而NY15滲透性可能較差。

但果實(shí)采后的生理變化及抗病特性使得生防菌在實(shí)際應(yīng)用中比篩選更為復(fù)雜，研究中拮抗菌在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)出較好的抑菌性，但庫(kù)爾勒香梨抑菌實(shí)驗(yàn)中，效果卻減弱。原因可能是：雖然拮抗菌能夠產(chǎn)生能抑制AlternatiaalternataXL2生長(zhǎng)的物質(zhì)，但庫(kù)爾勒香梨作為AlternatiaalternataXL2的親和寄主，果肉中的營(yíng)養(yǎng)可能更適合病原菌萌發(fā)生長(zhǎng)，使得發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用減弱。后續(xù)研究中對(duì)已經(jīng)篩得的拮抗菌進(jìn)行進(jìn)一步探索其適宜生長(zhǎng)條件及抑菌機(jī)理。

4 結(jié) 論

分離出1株香梨黑斑病病原菌AlternatiaalternataXL2及16株內(nèi)生菌，并篩選出8株對(duì)AlternatiaalternataXL2具有拮抗作用的梨樹(shù)內(nèi)生菌。研究分離出的8株拮抗內(nèi)生菌經(jīng)過(guò)16S rRNA基因序列分析鑒定均屬于芽孢桿菌，分別為BacillusparalicheniformisNY1、BacillusvelezensisNY2、NY5、NY7、NY9、NY15、BacillussiamensisNY11和BacillustequilensisNY10。其中NY2、NY7發(fā)酵液對(duì)AlternatiaalternataXL2在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)抑制較佳，其次為NY7。NY2、NY11、NY15抑菌效果較佳。NY2在離體果實(shí)實(shí)驗(yàn)無(wú)損傷接種中前期(4 d)時(shí)，能達(dá)到80%以上的抑菌率，但NY11在長(zhǎng)期抑菌防效中防效較佳。