劉曉雪，李瑞杰，彭婉芊，白忠彬，田洋*，宋爽*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）；2. 國(guó)家辣木加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心（昆明 650201）；3. 云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（昆明 650201）

地涌金蓮，拉丁學(xué)名Musella lasiocarpa（Franch.）C.Y. Wu ex H. W. Li，原產(chǎn)于中國(guó)云南省，是中國(guó)特產(chǎn)花卉[1]。其可用于藥用[2]、食用、飼料[3-4]、觀賞、造紙、紡織、水土保持及生態(tài)修復(fù)等[5-9]。由于人工合成的抗氧化劑對(duì)生物體有潛在的致癌、致畸變[10]，而天然性功能食品不僅具有良好的抗氧化和清除自由基能力，而且對(duì)機(jī)體沒(méi)有任何毒副作用，使之成為抗氧化活性物質(zhì)領(lǐng)域研究的新方向。

酵素（enzyme）是一類(lèi)風(fēng)靡我國(guó)的植物保健食品[11]，其主要功能包含幫助體內(nèi)廢物排出、消炎作用、抗菌作用、凈化血液、促進(jìn)細(xì)胞新生等[12-15]。作為一類(lèi)保健產(chǎn)品以其天然、無(wú)副作用的特點(diǎn)廣受追捧，相關(guān)研究證明酵素有增加消化酶及降脂的效果[16-18]。也有研究表明酵素具有增強(qiáng)抗氧化能力及提高免疫力作用等[19-21]。我國(guó)對(duì)酵素的研究還比較匱乏，并未對(duì)其進(jìn)行充分的開(kāi)發(fā)和利用[22]。因此，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)地涌金蓮發(fā)酵后的細(xì)胞抗氧化及對(duì)細(xì)胞受損模型的保護(hù)作用進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)地涌金蓮酵素的保健功效，以體現(xiàn)地涌金蓮開(kāi)發(fā)保健食品價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地涌金蓮（云南晉寧縣地區(qū)）；植物乳桿菌（廣東省微生物菌種保藏中心）；人肝癌株細(xì)胞（Hep-G2，上海名勁生物科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Hyclon公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司）；磷酸緩沖溶液（PBS）、四甲基偶氮唑鹽（MTT），均為美國(guó)Amresco公司；二甲基亞砜（DMSO）、雙抗，均為美國(guó)Amresco公司；無(wú)水乙醇、四氯化碳（均為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；沒(méi)食子酸（上海索萊寶生物科技有限公司）。

二氧化碳培養(yǎng)箱[美國(guó)熱力（Thermo）公司]；多功能酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；80-2低速離心機(jī)（常州澳華儀器有限公司）；UBT3000生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 地涌金蓮原汁液發(fā)酵工藝的研究

1.2.1.1 地涌金蓮原汁液發(fā)酵工藝流程

原料選擇與處理→成分配比→混勻→接種前滅菌→接種乳酸菌→發(fā)酵→發(fā)酵液→離心→過(guò)濾→成品

1.2.1.2 操作要點(diǎn)

1.2.1.2.1 原料選擇與處理

選用云南省晉寧縣優(yōu)質(zhì)地涌金蓮，將地涌金蓮榨成的汁液與純凈水按照一定的體積比例混合，并攪拌均勻，成為原料液待用。

1.2.1.2.2 滅菌

將置于大錐形瓶中并用封口膜密封好的發(fā)酵原料液于121 ℃滅菌30 min，用冰水以水浴的方法將發(fā)酵原料液快速冷卻到4～5 ℃，置于潔凈工作臺(tái)。

1.2.1.2.3 發(fā)酵

將活化選育的乳酸菌按2%菌種量接種到滅菌后的發(fā)酵原料液中，用封口膜密封好搖勻，于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵[23]。

1.2.2 地涌金蓮酵素發(fā)酵工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在植物乳桿菌添加量2%的條件下，對(duì)料液比（1∶9，2∶8和3∶7 g/mL）、發(fā)酵時(shí)間（2，3和4 d）、發(fā)酵溫度（30，33和35 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，確定最適工藝參數(shù)。

1.2.2.2 工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從單因素發(fā)酵試驗(yàn)過(guò)程中初步確定3個(gè)因素的最優(yōu)工藝范圍，為提高產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，確定發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)參數(shù)的最優(yōu)工藝條件。以感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（如表1）并進(jìn)行分析，得到發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 L9(33)地涌金蓮酵素發(fā)酵正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 感官評(píng)定測(cè)定

感官評(píng)價(jià)邀請(qǐng)從事食品產(chǎn)品開(kāi)發(fā)相關(guān)人員及其他實(shí)驗(yàn)室非食品專(zhuān)業(yè)同學(xué)共計(jì)20人，對(duì)地涌金蓮酵素的風(fēng)味、口感、色澤、澄清度4個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)分，參加感官評(píng)價(jià)的人員在評(píng)價(jià)前6 h內(nèi)未曾食用具有辛辣刺激的飲食，評(píng)分具有可信性。

表2 地涌金蓮酵素感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 抗氧化活性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行，略加改進(jìn)。取ABTS（7 mmoL/L）與過(guò)硫酸鉀（2.45 moL/L）按1∶1比例充分混合均勻后，室溫避光放置12～16 h，得到ABTS+·自由基儲(chǔ)備液，備用，使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋40～50倍得到工作液（吸光度在0.68～0.72之間），該工作液在30 ℃，734 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.70±0.02（乙醇調(diào)零）。用移液槍吸取100 μL多酚粗提物，加入3.8 mL ABTS+工作液，室溫下放置6 min，用甲醇作為空白，在紫外可見(jiàn)分光光度630 nm下測(cè)定樣品的吸光度[27]，據(jù)式（1）計(jì)算清除率，并計(jì)算出EC50（半數(shù)抑制率）。

1.2.4.2 DPPH自由基清除活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行，略加改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取0.8 mg DPPH，用乙醇溶解，定容至燒杯（200 mL）中，配成濃度1 mmol/L的DPPH母液。測(cè)定時(shí)用乙醇稀釋10倍配成0.1 mol/L的DPPH反應(yīng)液。用移液槍吸取1 mL多酚粗提液，添加4 mL濃度0.1 mol/L DPPH反應(yīng)液，充分搖勻后，暗處放置30 min，用甲醇作為空白，在520 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度[27]，據(jù)式（1）計(jì)算清除率，并計(jì)算EC50值。

1.2.4.3 MTT法建立CH3CH2OH和CCl4氧化損傷模型

將人肝癌Hep-G2細(xì)胞按2.0×104cells/孔的濃度接種到2個(gè)96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去上清液，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、不同濃度的CH3CH2OH模型組1和不同濃度的CCl4模型組2，正常對(duì)照組加入100% DMEM（含1%雙抗）培養(yǎng)液，模型組1分別加入含CH3CH2OH不同濃度的培養(yǎng)基，模型組2加入含CCl4不同濃度的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。建模結(jié)束后，加入質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT溶液，每孔20 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，加入DMSO，每孔200 μL，振蕩10 min，492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。選取細(xì)胞相對(duì)存活率在50%左右的CH3CH2OH和CCl4致?lián)p濃度，作為后續(xù)試驗(yàn)對(duì)肝細(xì)胞的損傷濃度。

1.2.4.4 地涌金蓮對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

接細(xì)胞見(jiàn)1.2.4.3小節(jié)。分別加入含不同濃度樣品的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL，設(shè)置對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組，對(duì)照組用100% DMEM培養(yǎng)液，損傷組和保護(hù)組都分別加入4%濃度的CH3CH2OH培養(yǎng)液和5 mmol/L濃度的CCl4培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；12 h后，保護(hù)組加入不同濃度的地涌金蓮酵素，加樣品后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加入MTT溶液（5 mg/mL），每孔20 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后加入DMSO，每孔200 μL，振蕩10 min，選擇492 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度（OD值），10 min內(nèi)測(cè)定完成后計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2007軟件進(jìn)行分析，帶入Graphpad prism5軟件進(jìn)行繪制柱形圖和分析顯著性差異。

礦區(qū)內(nèi)以往工作求得333+334類(lèi)多金屬礦石量為120.337萬(wàn)噸，金屬量為45 289 t，其中銅為13 094 t、鉛為16 747 t、鋅為15 448 t、硫?yàn)?44 901 t，可達(dá)小型規(guī)模。目前江西省地勘基金和中央地勘基金在礦區(qū)內(nèi)聯(lián)合開(kāi)展工作，找礦工作已取得一定的進(jìn)展，在15線、20線、36線、40線均發(fā)現(xiàn)多層銅礦體，其厚度為1～18.36 m，銅品位為0.27%～13.3%，往深部礦體有變厚變富的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 地涌金蓮酵素的工藝條件優(yōu)化單因素結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)地涌金蓮酵素發(fā)酵的影響

在植物乳桿菌添加量2%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間4 d的條件下，調(diào)節(jié)料液比，設(shè)置3個(gè)不同料液比的組分，分別為1∶9，2∶8和3∶7 g/mL，每個(gè)組分設(shè)置3個(gè)平行，進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果得出不同料液比對(duì)地涌金蓮感官評(píng)分有明顯影響，且料液比3∶7 g/mL時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖1 料液比對(duì)地涌金蓮發(fā)酵的影響

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)地涌金蓮發(fā)酵的影響

在料液比3∶7 g/mL、植物乳桿菌添加量2%、發(fā)酵溫度35 ℃的條件下，調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)間，設(shè)置3個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間的組分，分別為2，3和4 d，每個(gè)組分設(shè)置3個(gè)平行，進(jìn)行發(fā)酵，以多感官評(píng)價(jià)為考察指標(biāo)，得出發(fā)酵時(shí)間4 d的感官評(píng)分最高。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)地涌金蓮發(fā)酵的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)地涌金蓮酵素的影響

在料液比3∶7 g/mL、植物乳桿菌添加量2%、發(fā)酵時(shí)間4 d的條件下，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度，設(shè)置3個(gè)不同發(fā)酵溫度的組分，分別為30，33和35 ℃，每個(gè)組分設(shè)置3個(gè)平行，以感官評(píng)價(jià)為考察指標(biāo)進(jìn)行分析，得出發(fā)酵溫度33 ℃時(shí)感官評(píng)分最高。

2.2 地涌金蓮酵素的工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法，以地涌金蓮發(fā)酵飲料的感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，對(duì)其料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察，根據(jù)正交試驗(yàn)表L9(33)進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出最佳提取工藝條件。

由表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，三因素對(duì)地涌金蓮發(fā)酵效率的影響的主次關(guān)系依次是RB＞RA＞RC，即地涌金蓮發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間＞料液比＞發(fā)酵溫度。比較各ki值可知，發(fā)酵的最佳工藝組合為B3A3C2，即發(fā)酵時(shí)間4 d、料液比3∶7 g/mL、發(fā)酵溫度33 ℃，該組合在試驗(yàn)組中，得到的感官評(píng)價(jià)平均分?jǐn)?shù)為83分。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)地涌金蓮發(fā)酵的影響

表3 地涌金蓮酵素正交試驗(yàn)表

2.3 地涌金蓮酵素的抗氧化活性

由表4可知，地涌金蓮酵素隨著質(zhì)量濃度的增加（25～200 μg/mL），ABTS自由基清除率逐漸上升，沒(méi)食子酸當(dāng)量濃度也隨之上升。經(jīng)計(jì)算，地涌金蓮酵素EC50約57 μg/mL，沒(méi)食子酸約101 μg/mL，證明地涌金蓮酵素對(duì)ABTS自由基具有一定清除能力，且清除效果強(qiáng)于沒(méi)食子酸。

表4 地涌金蓮酵素對(duì)ABTS自由基的清除作用（±s）

表4 地涌金蓮酵素對(duì)ABTS自由基的清除作用（±s）

濃度/(μg·mL-1) 清除率/% 沒(méi)食子酸當(dāng)量質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)25 23.06±6.45 40.89±3.62 50 48.25±5.37 78.47±5.41 100 79.06±8.53 143.16±10.89 200 93.21±9.82 208.36±12.78地涌金蓮酵素質(zhì)量

由表5可知，地涌金蓮酵素清除DPPH自由基的清除也隨著濃度的增加而升高，相對(duì)沒(méi)食子酸當(dāng)量濃度也增加，與ABTS的試驗(yàn)結(jié)果相似。酵素和沒(méi)食子酸的EC50分別約33和87 μg/mL，證明地涌金蓮酵素對(duì)DPPH自由基也具有一定清除能力，且清除效果明顯強(qiáng)于沒(méi)食子酸。

表5 地涌金蓮酵素對(duì)DPPH自由基的清除作用（±s）

表5 地涌金蓮酵素對(duì)DPPH自由基的清除作用（±s）

濃度/(μg·mL-1) 清除率/% 沒(méi)食子酸當(dāng)量質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)25 30.82±4.82 33.45±7.87 50 62.74±3.58 74.36±10.66 100 93.21±8.28 150.61±8.49 200 120.36±7.64 215.94±8.65地涌金蓮酵素質(zhì)量

2.4 Hep-G2細(xì)胞CH3CH2OH和CCl4氧化損傷模型建立

由不同濃度CH3CH2OH和CCl4培養(yǎng)12 h后的Hep-G2細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果（圖4）可知，隨著CH3CH2OH和CCl4濃度增加，細(xì)胞相對(duì)存活率逐漸下降，濃度8%和8 mmol/L時(shí)，存活率僅有12.98%和34.14%，大部分死亡，說(shuō)明Hep-G2細(xì)胞對(duì)CH3CH2OH和CCl4較為敏感，用CH3CH2OH和CCl4建立Hep-G2細(xì)胞的氧化損傷模型是可行的。CH3CH2OH和CCl4濃度為4%和5 mmol/L時(shí)，兩細(xì)胞的存活率與正常對(duì)照組差異顯著，分別為55.20%和52.96%，接近50%～60%，因此選取該濃度作為建立后續(xù)Hep-G2細(xì)胞的氧化損傷模型。

圖4 不同濃度CH3CH2OH和CCl4對(duì)Hep-G2細(xì)胞活力影響

2.5 地涌金蓮酵素對(duì)CH3CH2OH和CCl4氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

通過(guò)圖5可知，在相同CH3CH2OH濃度（4%）和CCl4濃度（5 mmol/L）致?lián)p下，模型組的Hep-G2細(xì)胞存活率分別只有56.49%±9.23%和51.66%±14.43%，但是加入不同濃度的地涌金蓮酵素與其共同作用后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率均高于模型組值，即地涌金蓮酵素可有效降低CH3CH2OH和CCl4誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞的氧化損傷作用。但是地涌金蓮酵素并不是隨著濃度的升高，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)，這說(shuō)明不同濃度地涌金蓮酵素與氧化損傷劑之間可能存在對(duì)抗作用，而地涌金蓮酵素卻能起到很好的抗氧化作用。

圖5 不同濃度地涌金蓮酵素對(duì)Hep-G2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用

3 結(jié)論

地涌金蓮原料液發(fā)酵的最佳工藝條件是料液比1∶3 g/mL（25%）、植物乳桿菌添加量2%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間4 d，最優(yōu)條件下得到的感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)是83分。地涌金蓮酵素風(fēng)味獨(dú)特，清爽無(wú)異味，口感柔滑，酸度適宜，回味較醇厚，色澤呈淡黃色，色澤較為誘人，較澄清透明，無(wú)沉淀，綜合得分83分。地涌金蓮發(fā)酵液對(duì)ABTS和DPPH自由基均有一定清除能力，CH3CH2OH和CCl4建立的氧化損傷體外模型在統(tǒng)一處理12 h后，Hep-G2細(xì)胞存活率達(dá)到50%左右的濃度分別為4%和5 mmol/L。不同濃度地涌金蓮酵素對(duì)經(jīng)CH3CH2OH和CCl4氧化損傷的Hep-G2細(xì)胞保護(hù)作用最好的濃度分別為10%和15%。