王昱歡，丁奕岑，蔡瑤雨，康亞妮

1.上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200240；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡女性最常見的一種內(nèi)分泌失調(diào)性疾病，以慢性無排卵（排卵功能紊亂或喪失）和高雄激素血癥為特征，主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕、多毛和痤瘡。幾乎半數(shù)以上的肥胖女性患有PCOS，不僅導(dǎo)致近期和遠期的生活質(zhì)量下降，還會增加癌癥、心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險。50%～70% PCOS 患者的生殖功能障礙且內(nèi)分泌代謝紊亂［1］。

微RNA（microRNAs，miRNAs）是長度為18～25 nt的非編碼小RNA，通過與靶mRNA 的3′UTR 區(qū)互補序列結(jié)合，抑制其翻譯或誘導(dǎo)其降解，從而抑制基因表達，參與多種疾病的調(diào)節(jié)，如糖尿病、胰島素抵抗、炎癥疾病和癌癥等。研究［2］表明，miRNA 可能通過在PCOS 患者的血液、卵泡液及顆粒細胞中異常表達，來調(diào)節(jié)生殖、激素分泌和代謝、細胞增殖和凋亡、卵巢卵泡發(fā)育相關(guān)基因，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與PCOS疾病的發(fā)生發(fā)展機制。國內(nèi)外相關(guān)研究［3］證明miR-21 及miR-93 在PCOS 患者中表達水平異常，這可能與PCOS 高雄激素表型的發(fā)病機制相關(guān)，這表明miRNA 的表達水平與PCOS的發(fā)病有密切的關(guān)聯(lián)性，是調(diào)節(jié)PCOS及其相關(guān)疾病的潛在生物標(biāo)志物。

隨著對PCOS檢測技術(shù)和相關(guān)分子機制研究的不斷深入，基于高通量測序技術(shù)篩選PCOS相關(guān)易感基因及診斷標(biāo)志物的研究也在深入展開［4］。本研究基于高通量測序的miRNA-seq技術(shù)，從全基因組范圍篩選出可作為PCOS生物標(biāo)志物的miRNA，為闡明PCOS 的發(fā)病機制、探求診斷新靶點提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院2019年1月—10月收治的5例PCOS患者作為觀察組，入選標(biāo)準(zhǔn)：符合PCOS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)B超、生化檢驗及臨床癥狀確診。另選取5例體檢健康的女性作為對照組。樣本收集和臨床信息采集均符合醫(yī)院倫理委員會要求。2 組對象的性別、年齡、病程等基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

1.2 檢測方法

采集2組對象的顆粒細胞，用TRIzol法分離顆粒細胞中的總RNA。使用Nanodrop One 超微量分光光度計對分離得到的總RNA 進行定量，之后用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，保證提取得到的總RNA 質(zhì)量較好；質(zhì)檢合格后按照TruSeq Small RNA Library Prep 試劑盒（Illumina 公司，美國）說明書步驟進行miRNA-seq 文庫構(gòu)建，利用Qubit 定量和2100 生物分析儀（Agilent 公司，美國） 進行文庫質(zhì)量鑒定；文庫質(zhì)檢合格后用NextSeq500（Illumina 公司，美國）進行高通量測序；獲得測序結(jié)果的原始數(shù)據(jù)后對其進行數(shù)據(jù)分析。采用RTqPCR 實驗檢測轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，同時檢驗候選miRNA標(biāo)志物是否確實存在差異表達。

1.3 數(shù)據(jù)分析

miRNA-seq 測序后獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads），經(jīng)過過濾去接頭，去污染、比對參考基因組，得到干凈數(shù)據(jù)（clean reads）進行后續(xù)的信息分析，包括以下步驟。

（1）使用Cutadapt（version 3.4）程序去掉原始下機數(shù)據(jù)中的接頭序列。

（2）使用Trimmomatic（version 0.39）程序去掉低質(zhì)量序列，得到clean reads。

（3） 使用FastQC （version 0.11.9） 程序統(tǒng)計clean reads的數(shù)據(jù)量，保留15～35 nt的片段進行后續(xù)分析。

（4）使用bowti2（version 2.1.）程序?qū)lean reads 比對到參考基因組上，用miRDeep2（version 2.0.1.2）工具進行novel miRNA的預(yù)測。

（5）使用bowti2（version 2.1.）程序?qū)lean reads比對到miRBase（version 22.1）中的known miRNA數(shù)據(jù)庫上。

（6）使用edgeR、DESeq2和limma 3種方法進行基因表達差異性分析，并對差異表達miRNA 進行靶基因預(yù)測。

（7）使用clusterProfiler（release 3.13）進行基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.4 RT-qPCR驗證

設(shè)計合成miRNA 的引物（表1），使用PrimeScript?RT 試劑Kit（RR037，TAKARA）進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄后利用合成的引物進行qPCR，實驗重復(fù)3次，再利用Excel對實驗所獲得的Ct值進行計算，得出每個miRNA 的2-ΔΔCT，利用Graph Pad Prism 7 進行作圖及差異分析，進一步明確可用于PCOS診斷的生物標(biāo)志物。

表1 miRNA引物序列（5′→3′）Tab 1 miRNA primer sequence（5′→3′）

2 結(jié)果

2.1 基因表達差異分析及靶基因預(yù)測

本研究對5 對樣本的測序數(shù)據(jù)進行初步的質(zhì)量評估后，對測序結(jié)果進行過濾、分類，并計算了miRNA 的表達量，得到了5對樣本中1 191條miRNA 的表達量。我們進一步分別使用edgeR 包、DESeq2 包和limma 包，對1 191 條miRNA 進行基因表達差異性分析，對三大R 包的差異分析結(jié)果取交集，最終得到了20 條表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNA（圖1A），其中包括hsa-miR-188-3p等11條表達上調(diào)miRNA 和hsa-miR-2355-5p等9條表達下調(diào)miRNA（圖1B）。隨后，我們對差異表達的miRNA 進行了層次聚類分析，分析了PCOS患者與正常女性的顆粒細胞中miRNA 表達的模式差異與相似性，便于推測未知基因的功能或已知基因的新功能（圖1C）。

2.2 靶基因預(yù)測及功能富集分析

通過對20 條差異表達miRNA 進一步篩選，選取P＜0.02 的13 條miRNA 和表達量差異倍數(shù)超過8 倍的11 條miRNA，取兩者交集，獲得了9 條miRNA 作為候選生物標(biāo)志物，其中hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-1299、hsa-miR-4440、hsa-miR-451a、hsa-miR-196a-5p 和hsa-miR-188-3p為表達上調(diào)基因，hsa-miR-2355-5p、hsa-miR-6509-5p 和hsa-miR-877-5p為表達下調(diào)基因。

為了探究差異表達miRNA 在PCOS 顆粒細胞中的調(diào)控作用，分別使用數(shù)據(jù)庫mirDB 和TargetScan 對這9 條候選生物標(biāo)志物miRNA 進行靶基因預(yù)測，并將2 個數(shù)據(jù)庫的靶基因預(yù)測結(jié)果取交集，得到最終的靶基因預(yù)測結(jié)果。隨后，使用ClusterProfiler 包對靶基因進行了GO 富集分析和KEGG 富集分析，進一步探究顯著差異表達miRNA在PCOS 發(fā)病機制中的生物學(xué)意義。根據(jù)GO 富集分析結(jié)果表明，候選生物標(biāo)志物miRNA 的靶基因集合富集于上皮細胞增殖及其調(diào)節(jié)、細胞黏附的正調(diào)控、腺發(fā)育等，其中主要集中于上皮細胞增殖的調(diào)節(jié)（圖2A）。KEGG富集分析結(jié)果表明，差異表達miRNA 的靶基因主要富集于T細胞受體信號通路、類固醇激素生物合成、調(diào)節(jié)多功能干細胞信號通路、泌乳素信號通路和視黃醇代謝等通路（圖2B）。

圖2 靶基因的功能富集分析結(jié)果Fig 2 Results of functional enrichment analysis of target genes

2.3 RT-qPCR實驗驗證

基于miRNA-Seq數(shù)據(jù)處理后得到的基因表達信息，在顯著性差異表達的miRNA中隨機挑選5個基因（3個上調(diào)，2 個下調(diào)，即miR-196a-5p、miR-877-5p、miR-2355-5p、miR-10a-5p和miR-451a）設(shè)計引物，然后利用qRT-PCR實驗對PCOS組與對照組臨床樣本進行了檢測驗證。結(jié)果如圖3所示，5個miRNA的qRT-PCR結(jié)果與測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果高度一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。同時，miR-196a-5p（P=0.005）、miR-10a-5p（P=0.009）、miR-877-5p（P=0.002）、 miR-2355-5p （P=0.008）、 miR-451a （P=0.041），5條miRNA的表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明這5條miRNA具有作為PCOS生物標(biāo)志物的潛能。

圖3 利用RT-qPCR實驗驗證5個miRNA候選生物標(biāo)志物的基因表達結(jié)果Fig 3 RT-qPCR validation of 5 miRNA candidate markers

3 討論

PCOS 是育齡婦女常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，是引起不孕不育的主要原因。臨床上針對PCOS的診斷依然依賴于其診斷標(biāo)準(zhǔn)，與PCOS相關(guān)的易感基因及診斷生物標(biāo)志物仍有待研究。研究［3，5-7］表明，多種miRNA 參與了PCOS疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。miRNA 的異常表達被認為可能參與PCOS的基本病理生理過程，包括細胞增殖、胰島素抵抗、雌激素分泌、雄激素生成和細胞凋亡等［2］。本研究利用基于高通量測序的miRNA（miRNA-seq）技術(shù)，通過生物信息學(xué)方法篩選分析了與PCOS 有關(guān)的miRNA作為生物標(biāo)志物。經(jīng)分析證明顆粒細胞中miR-196a-5p、miR-877-5p、miR-2355-5p、miR-10a-5p 和miR-451a 表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，RT-qPCR 實驗結(jié)果表明篩選出的miRNA具有作為PCOS生物標(biāo)志物的潛能。

miR-196a-5p 是一種新報道的與多種腫瘤相關(guān)的miRNA［8-10］。Zhao 等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a-5p 會被長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）GAS5直接靶向調(diào)控，從而抑制卵巢癌的發(fā)展。PCOS是一種復(fù)雜的內(nèi)分泌疾病，患有PCOS的女性新陳代謝和激素環(huán)境改變可能會增加其罹患某些類型癌癥的風(fēng)險。而一些研究與統(tǒng)計調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在某些患有PCOS的女性中，卵巢癌的發(fā)病率也可能上升［12-13］，PCOS患者與卵巢癌患者之間也存在一些相同的癥狀，如月經(jīng)不調(diào)、少經(jīng)等。但PCOS與卵巢癌之間的關(guān)聯(lián)非常復(fù)雜，目前尚不清楚［14-15］。

關(guān)于miR-877-5p 的研究目前主要集中在腫瘤領(lǐng)域，而其與PCOS 疾病的相關(guān)性還有待研究。Yan 等［16］發(fā)現(xiàn)，miR-877-5p通過靶向CDK14抑制細胞生長、遷移和侵襲，在肝細胞癌細胞中起到抑癌作用。正常情況下，女性每個月卵巢有1～2 個卵泡發(fā)育成熟、排卵，之后形成黃體，卵泡閉鎖，而PCOS患者的卵泡不能發(fā)育成熟，卵巢內(nèi)聚積多個小的卵泡，所以卵巢呈現(xiàn)多囊改變。Yan 等［16］的研究發(fā)現(xiàn)miR-877-5p 可以通過靶向CDK14抑制細胞生長，但CDK14是否會影響卵巢中卵泡的發(fā)育還有待研究。

目前關(guān)于miR-2355-5p 的研究較少。現(xiàn)有的一些研究表明，miR-2355-5p 不僅與癌癥的發(fā)展相關(guān)［17-18］，還與慢性疾病的發(fā)生相關(guān)。Iacomino 等［19］發(fā)現(xiàn)了3 條循環(huán)miRNA 有作為肥胖和相關(guān)代謝紊亂的新型生物標(biāo)志物的可能性，miR-2355-5p 便是其中1 條；而肥胖和相關(guān)代謝紊亂也是PCOS 患者可能出現(xiàn)的癥狀，這預(yù)示著miR-2355-5p也具有作為PCOS診斷生物標(biāo)志物的潛能。

Wang 等［20］發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p 在卵巢癌患者的血漿中顯著過表達，可以作為卵巢癌非侵入性診斷生物標(biāo)志物；而Guo等［21］發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p的基因組擴增和低表達促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲。這些研究表明miR-10a-5p 與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，預(yù)示了miR-10a-5p與PCOS之間可能存在聯(lián)系。此外，有研究［22］表明，miR-10a-5p 的mRNA 基因靶標(biāo)與結(jié)締組織增殖顯著相關(guān)，豬卵泡中的miR-10a-5p 可以調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）［23］，而CTGF 在PCOS 的卵泡發(fā)育障礙及排卵障礙過程中發(fā)揮重要作用，可能和胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）協(xié)同作用促使PCOS 發(fā)生［24］。這些證據(jù)表明，miR-10a-5p可能參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展。

miR-451a 被認為在多種腫瘤中發(fā)揮作用。在宮頸癌中，有研究［25］表明miR-451a 在宮頸癌樣本中下調(diào)，并可能通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路和EREG參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但一些研究［12］表明PCOS 與宮頸癌之間并不存在明顯關(guān)聯(lián)。此外，Díaz等［26］針對患有PCOS 的31例青春期女孩展開了PCOS診斷生物標(biāo)志物的研究，他們發(fā)現(xiàn)miR-451a 對于診斷PCOS 具有100%的敏感度和特異度，可以作為青春期PCOS診斷和治療的生物標(biāo)志物。

總結(jié)以上討論內(nèi)容，我們發(fā)現(xiàn)miR-196a-5p 和miR-10a-5p 均與卵巢癌的發(fā)病相關(guān)，且miR-10a-5p 可通過調(diào)控CTGF促使PCOS 發(fā)生，miR-2355-5p 和miR-451a 都具有作為PCOS 及其相關(guān)復(fù)雜疾病的診斷生物標(biāo)志物的潛能，而miR-877-5p 也可能與PCOS 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。GO和KEGG 富集分析結(jié)果表明，miR-196a-5p、miR-877-5p、miR-10a-5p和miR-451a與細胞的生長、增殖和凋亡有關(guān)，miR-2355-5p 則與激素分泌與代謝紊亂相關(guān)，miR-196a-5p、miR-877-5p、miR-2355-5p、miR-10a-5p 和miR-451a均可能通過影響相關(guān)基因的表達，參與信號通路的調(diào)控，從而影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。

研究表明，過量的雄激素會引起PCOS 的發(fā)生［27］，而視黃醇會引起氧化應(yīng)激（oxi-dation stress，OS）水平的失衡，從而產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基，并最終導(dǎo)致胰島素抵抗［28-31］。胰島素會增強人體內(nèi)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）對雄激素分泌過程的刺激作用［32-33］，促使雄激素水平升高并產(chǎn)生一系列PCOS表型。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-2355-5p 的靶基因DHRS4和DHRS4L2通過視黃醇代謝通路引起OS 失衡，間接導(dǎo)致雄激素水平增加與PCOS的發(fā)生；我們還發(fā)現(xiàn)miR-188-3p/MAPK13、miR-196a-5p/NRAS和miR-4440/GSK3B均通過催乳素信號通路促進胰島素分泌，導(dǎo)致體內(nèi)LH水平上升并最終產(chǎn)生PCOS表型。我們對本研究所發(fā)現(xiàn)的PCOS疾病發(fā)生發(fā)展的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了總結(jié)，見圖4。

圖4 PCOS疾病發(fā)生發(fā)展的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制Fig 4 Transcriptional regulatory mechanism of PCOS occurrence and development

本研究利用基于高通量測序的miRNA-seq 技術(shù)，從全基因組范圍進行了顆粒細胞miRNA 作為PCOS 疾病生物標(biāo)志物的研究，建立了PCOS 疾病miRNA 表達譜，并通過計算預(yù)測與實驗驗證分析了特異性差異表達的miRNA 及其靶基因，證明了顆粒細胞中miR-196a-5p、miR-877-5p、miR-2355-5p、miR-10a-5p 和miR-451a 具有作為PCOS 生物標(biāo)志物的潛能。通過對差異表達miRNA的靶基因進行功能富集分析，在全基因組水平初步探索了PCOS 疾病的發(fā)生機制，探究了miRNA 在PCOS 發(fā)病機制中的生物學(xué)意義，總結(jié)出了PCOS疾病發(fā)生發(fā)展的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為闡明PCOS的發(fā)病機制、探求診斷新靶點提供了研究思路和理論依據(jù)。