鄧宇晨 方文捷 鄧淑文 陳顯振 張亞茹 馮真益 凌麗燕 潘煒華 廖萬清

(1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院皮膚科,上海 200003；2. 浙江省平湖市第二人民醫(yī)院檢驗科,平湖 314201)

曲霉(Aspergillus)是導(dǎo)致侵襲性真菌病最重要的病原真菌之一，以煙曲霉(Aspergillusfumigatus)為主要致病菌種，常引起過敏反應(yīng)、慢性和侵入性支氣管肺病等嚴(yán)重疾病[1]。煙曲霉既可侵犯免疫功能低下人群，也能在免疫正常人群中致病，其發(fā)病率和死亡率均較高，應(yīng)引起臨床醫(yī)生關(guān)注。近幾十年來，醫(yī)療技術(shù)快速發(fā)展，曲霉病的診治水平有了很大的提高。但是，近年來臨床上難治性曲霉感染病例有增加趨勢[2]，很大一部分原因是由于煙曲霉耐藥菌株的增多[3]。

對于侵襲性曲霉病，早期正確的診斷及抗真菌治療是成功治療的關(guān)鍵。體外藥敏試驗是真菌耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，方法成熟可靠，但其最大的弱點是費時，傳統(tǒng)培養(yǎng)時間是2～3周，體外藥敏試驗至少需要培養(yǎng)3 d后觀察結(jié)果，難以滿足臨床對于耐藥真菌診斷與治療的需求[4]。因此尋找特異性好、靈敏度高并且簡單易行的實驗室檢測指標(biāo)與方法是耐藥真菌研究中需要解決的問題。對于煙曲霉，cyp51A基因編碼產(chǎn)物是唑類藥物作用的靶標(biāo)，特定點突變能導(dǎo)致唑類藥物與 Cyp51A 蛋白的親和力下降[5]，是發(fā)生唑類耐藥的重要原因，也是通過分子診斷方法精確反應(yīng)耐藥結(jié)果的依據(jù)[6]。TR34/L98H 是煙曲霉菌種常見的耐藥突變類型，能夠解釋90%以上的耐藥現(xiàn)象[7]。對于上述位點的檢測，可以判斷菌株的耐藥情況[8-9]。因此本研究擬建立等位基因特異性PCR檢測曲霉耐藥突變的體系，檢測TR34/L98H耐藥基因以快速初篩煙曲霉對抗真菌藥物的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 菌株的收集

煙曲霉唑類耐藥基因突變菌株：STJ0048，STJ0049，STJ0107，STJ0140，XJ138。這些菌株是從臨床標(biāo)本分離得到，分別來自福州(STJ0048，STJ0049)、上海(STJ0107)、南京(STJ0140)和烏魯木齊(XJ138)，前期已通過藥敏試驗和對cyp51A基因的測序鑒定其對唑類藥物耐藥并且存在TR34/L98H位點突變[10]。隨機(jī)選擇前期藥敏試驗鑒定的10株未突變煙曲霉作為陰性菌株[11-12]。黃曲霉、灰綠曲霉、構(gòu)巢曲霉、寄生曲霉、土曲霉、雜色曲霉、紅色毛癬菌、毛霉菌和青霉菌從上海長征醫(yī)院真菌研究所菌種保藏庫隨機(jī)各選1株，人類DNA提取自HeLa細(xì)胞(TechStar Co.Ltd, Jiangsu, China)。

1.2 DNA的提取

使用ZR Fungal/Bacterial DNA Kits(Zymo)試劑盒提取真菌DNA。

1.3 引物設(shè)計

相關(guān)序列來自項目組測序及NCBI 檢索官網(wǎng)下載 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，裝載于 Geneious?10.1.2 軟件進(jìn)行比對以及分析，及手工設(shè)計引物，待定引物通過 IDT 核酸分析工具進(jìn)行特性分析(https://eu.idtdna.com/calc/analyzer)。引物設(shè)計遵循如下原則：①引物不能同常見臨床、環(huán)境真菌和人類 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)；②應(yīng)用 IDT OligoAnalyzer 3.1 軟件(https://eu.idtdna.com/calc/analyzer)預(yù)測引物的 Tm值以及二聚體?？刂芓m值、引物二聚體和 PCR產(chǎn)物長度，使得二重引物可以共存于一個體系。

項目組針對L98H點突變以及TR34重復(fù)插入片段突變設(shè)計了兩對特異性引物：第1組引物L(fēng)98H-F：CGCATGAGCAGCATCTCGCTTC L98H-R：

GGAACGAGTTTATTCTCAACGGCAAAGA檢測位點L98H點突變(T>A突變)，擴(kuò)增產(chǎn)物446 bp，Tm=86.19℃(Tm值由http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html計算得到)；第二組引物TR34-F：TGTGCTGAGCCGAATGAATCACGC、TR34-R：GATAAGAG-GGATTATTTCATATACTGGAT-TCC引物一側(cè)位于兩次重復(fù)片段中間位置，即前1個重復(fù)片段的偏后區(qū)域以及后1個重復(fù)片段的偏前區(qū)域，突變菌株存在該序列，可以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，野生菌株無插入突變，故不存在兩次突變重復(fù)序列，無法進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物257 bp，Tm=81.50℃。

1.4 等位基因特異性PCR擴(kuò)增

每一管同時進(jìn)行2對引物的PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL、L98H-F 0.5 μL、L98H-R 0.5 μL、TR34-F 0.5 μL、TR34-R 0.5 μL、Template 1 μL、ddH2O 9.5 μL，共25 μL。PCR擴(kuò)增的條件如下：95℃ 30s-(95℃ 30s-57℃ 30s-72℃ 30s)共30個循環(huán)-65℃ 5s-95℃。本實驗通過RT-PCR的擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增是否成功以及溶解曲線呈現(xiàn)雙峰判斷兩種突變是否共存。

1.5 特異性試驗

將新型的單重檢測方法，同步檢測L98H/TR34耐藥突變煙曲霉和非突變煙曲霉對照菌株，證明新方法僅在煙曲霉耐藥基因突變菌株中產(chǎn)生陽性反應(yīng)；同時將黃曲霉、灰綠曲霉、構(gòu)巢曲霉、寄生曲霉、土曲霉、雜色曲霉、紅色毛癬菌、毛霉、青霉和人Hela細(xì)胞的DNA作為對照，證明該檢測體系與這些物種不存在交叉反應(yīng)。

1.6 敏感性試驗

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，曲霉基因組大小為29.4 Mb。建立拷貝數(shù)計算公式：Copy number = (amount ng·6.022·1023)/(2.94·107·1·109·650) 得到106個曲霉的DNA重量為31.7 ng。故將上述試劑盒抽取的DNA濃度稀釋為31.7 ng/μL，在以10為倍數(shù)，建立濃度梯度，用于敏感性試驗(106/mL，105/mL，104/mL，103/mL，102/mL，101/mL)。新方法依次對上述濃度的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增試驗，查看陽性反應(yīng)的最低濃度，即為敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 特異性結(jié)果

所有煙曲霉耐藥基因陽性突變菌株RT-PCR溶解曲線均呈現(xiàn)雙峰，顯示兩種突變共存；所有陰性突變株，非耐藥煙曲霉菌株均未檢測到突變位點(見圖1～3)。以黃曲霉、灰綠曲霉、構(gòu)巢曲霉、寄生曲霉、土曲霉、雜色曲霉、紅色毛癬菌、毛霉、青霉、HeLa細(xì)胞的DNA作為對照未見擴(kuò)增，即不存在交叉反應(yīng)。

圖1 單株煙曲霉耐藥基因陽性菌株等位基因特異性PCR的溶解曲線 圖2 耐藥基因陽性菌株與陰性菌株的擴(kuò)增曲線 圖3 耐藥基因陽性菌株與陰性菌株的溶解曲線Fig.1 Melt curve of allele-specific PCR forone resistance gene positive Aspergillus fumigatus Fig.2 Amplification curves of resistance gene positive and negative Aspergillus fumigatus Fig.3 Melt curves of resistance gene positive and negative Aspergillus fumigatus

2.2 敏感性結(jié)果

通過對不同濃度的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增實驗，陽性反應(yīng)的最低濃度為104/mL(見圖4)。

圖4 不同濃度DNA樣本的擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves for different concentrations of DNA samples

3 討 論

國際指南推薦的煙曲霉一線用藥為廣譜三唑類抗真菌藥物，如伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑等[13]。該類藥物不良反應(yīng)小，臨床效果好，已經(jīng)廣泛用于曲霉感染高危人群經(jīng)驗性預(yù)防、急慢性感染控制。但由于全球范圍內(nèi)含唑類農(nóng)藥大規(guī)模應(yīng)用，以及臨床上唑類抗真菌藥物的長療程使用，煙曲霉對伏立康唑等抗真菌劑的耐藥性呈現(xiàn)逐年上升趨勢[14]。據(jù)文獻(xiàn)顯示，臨床菌種耐藥率在美國約為3.6%，中國為 4%，日本為 11%[15]。以往耐藥檢測是基于培養(yǎng)等傳統(tǒng)技術(shù)，陽性率低，本研究成功建立一套雙管等位基因特異性PCR體系，可以在相同的反應(yīng)條件下，同步檢測TR34/L98H這兩個唑類耐藥曲霉的突變位點，所有唑類敏感菌株均未檢測到這兩個突變位點，驗證了該體系的特異性，有效提高了檢測的敏感性。

檢測煙曲霉唑類耐藥的傳統(tǒng)方法，是以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的微量肉湯稀釋法藥敏檢測法等，該方法較可靠，無需特殊儀器，但最大弱點是費時，傳統(tǒng)培養(yǎng)時間為2～3周，藥敏試驗至少需要培養(yǎng)3 d后觀察結(jié)果。運(yùn)用血清學(xué)檢測(G試驗，GM試驗)可以在數(shù)小時內(nèi)得到菌種信息，但是藥敏結(jié)果仍然需要通過傳統(tǒng)方法3周時間才能獲知。這些檢測技術(shù)不能在患者治療的初期及時提供精確的用藥指導(dǎo)信息，使得目前的抗真菌方案不能科學(xué)地遵守個體化原則，既耽誤了患者的治療，也造成了財力的浪費[4]，而本文建立的基于等位基因特異性PCR的分子診斷方法可以有效解決上述問題，將耐藥檢測時間由傳統(tǒng)方法的2～3周縮短為2～3 h，可以精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床早期、有效的抗真菌治療，對于改善患者預(yù)后起到了重要的作用。

本研究提供一種用于煙曲霉唑類耐藥突變檢測的核酸診斷策略。針對煙曲霉的耐藥突變TR34/L98H，設(shè)計了一套價格低廉、操作簡單、不需要高價儀器的曲霉耐藥檢測方法，而且特異性和敏感性均較高，能夠同血清學(xué)檢測形成良好的互補(bǔ)，適合臨床快速檢測，進(jìn)而提高曲霉菌的診治水平。該方法仍具有一定的局限性，不能完全取代傳統(tǒng)藥敏方法，因此等位基因特異性PCR法具有一定的臨床應(yīng)用價值，是對傳統(tǒng)真菌藥敏方法的有益補(bǔ)充。