楊百路 李紫艷 張艷薇 謝 勇 曹 玓 柏青楊▲

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)病理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤，肺癌居惡性腫瘤之首，嚴(yán)重影響人民的健康和生命。由于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，盡管近年來肺癌的治療效果不斷提高，但5年生存率仍徘徊在15%左右。目前，靶向治療為肺癌治療研究的熱點(diǎn)。越來越多分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與靶向藥物的研發(fā)使肺癌的治療取得了很大進(jìn)展[1-3]。精準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)模式是目前腫瘤治療的趨勢和方向，主要利用有效的分子生物標(biāo)志物，區(qū)分目標(biāo)人群，實(shí)行個體化治療。因此，探究肺癌的新有效分子生物學(xué)標(biāo)志物與潛在治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。隨著人類基因組計劃的完成，肺癌在基因?qū)用嫔嫌辛诵碌恼J(rèn)識?；蚍肿铀秸J(rèn)為肺鱗癌與肺腺癌是“兩種疾病”。有資料表明在肺腺癌可能更容易發(fā)現(xiàn)分子生物學(xué)標(biāo)志物[4]。

Claudins是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白，Claudins在多種腫瘤組織中表達(dá)水平明顯比周圍正常組織中高，并且腫瘤級別越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越容易發(fā)生，表達(dá)水平越高[5-6]。E-鈣黏附素（E-Cadherin，E-cad）是黏附分子中鈣離子依賴的細(xì)胞黏附素家族，有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，當(dāng)E-cad表達(dá)降低或不表達(dá)，細(xì)胞間相互黏附力下降，更容易造成細(xì)胞分散并向外周浸潤性生長[7]。近年來的研究結(jié)果顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因23（non-metastatic 23，nm23）可以通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。CyclinD1是一類蛋白家族，與細(xì)胞周期有關(guān)，其表達(dá)水平隨著細(xì)胞周期變化，參與干細(xì)胞自我更新，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，能與基因特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，并且還能促進(jìn)細(xì)胞增殖[9]。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)染色的方法研究緊密連接蛋白-1（以下簡稱“Claudin-1”）、E-cad、nm23、CyclinD1在肺腺癌中的表達(dá)情況及與分化程度的關(guān)系，可為腫瘤的進(jìn)展及潛在治療靶點(diǎn)的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月至2017年3月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心收治的60例肺腺癌手術(shù)患者的癌組織和癌旁正常組織切除標(biāo)本作為研究對象?；颊呤中g(shù)前均未接受放、化療及其他抗腫瘤藥物治療。病理學(xué)分級：高分化腺癌18例，其中男6例，女12例；中分化腺癌32例，其中男12例，女20例；低分化腺癌10例，其中男4例，女6例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，參與研究者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：①尚未接受治療的肺腺癌患者；②參與研究者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①檢測結(jié)果為陰性；②其他組織類型的肺癌患者。

1.2 材料

Claudin-1、E-cad、nm23、CyclinD1 抗體[基因科技（上海）股份有限公司]，UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒 （鼠/兔）（福州邁新生物科技開發(fā)有限公司），二甲苯、乙醇、PBS液、過氧化氫液、蘇木素、蒸餾水、樹膠封片劑等，不銹鋼高壓鍋、顯微鏡、全自動石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 石蠟切片制作 每例切片5～6張，厚度5 μm，撈片于防脫載玻片，置于37℃溫箱烘干。

1.3.2 HE染色 選取每例石蠟切片1張，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色采用ABC法進(jìn)行Claudin-1、E-cad、CyclinD1和 nm23染色。

1.4 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

Claudin-1在細(xì)胞膜和胞質(zhì)陽性表達(dá)，E-cad在胞膜陽性表達(dá)，nm23在胞質(zhì)陽性表達(dá)，CyclinD1在胞核陽性表達(dá)。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞的胞膜、胞質(zhì)或胞核呈黃色至棕褐色為陽性染色。高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定[10]。染色強(qiáng)度按切片中細(xì)胞著色的深淺評分：細(xì)胞無顯色為0分；黃色為1分；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細(xì)胞數(shù)量按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評分：0%～＜5%為0分；5%～＜25%為1分；25%～＜50%為2分；50%～＜75%為3分；75%以上為4分。上述兩項(xiàng)評分的乘積作為總積分：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（+）；5～8 分為中等程度陽性（2+）；≥9分為強(qiáng)陽性（3+）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)檢查結(jié)果

顯微鏡下觀察HE染色切片用于檢測病理診斷結(jié)果，根據(jù)鏡下腺癌形態(tài)判斷分化程度：貼壁型為高分化18例，腺泡型、乳頭型為中分化32例，微乳頭型、實(shí)性型為低分化10例。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組的E-cad、nm23的表達(dá)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組的 CyclinD1、Claudin-1的高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；高、中分化腺癌中E-cad、nm23的表達(dá)高于低分化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。高、中分化腺癌中CyclinD1、Claudin-1的表達(dá)低于低分化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表 1；圖 1，封三）。

圖 1 Claudin-1、E-cad、nm23、Cyclin D1 在肺腺癌中的表達(dá)（IHC 染色，200×）（見內(nèi)文第 39頁）

3 討論

細(xì)胞黏附既能維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，也能調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動和發(fā)揮功能，并對細(xì)胞增殖、分化有重要影響。黏附、降解和移動是腫瘤發(fā)生侵襲的三步曲，同時腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲和轉(zhuǎn)移必須穿過細(xì)胞外的基質(zhì)屏障、血管壁基底膜才能進(jìn)入宿主微循環(huán)。

細(xì)胞的黏附結(jié)構(gòu)以Claudins最重要，其改變可以影響緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。這種改變可以是Claudins數(shù)量上改變，也可以是基因突變。E-cad是介導(dǎo)鈣依賴性上皮細(xì)胞黏附的最主要分子，介導(dǎo)同種細(xì)胞間連接，使得腫瘤細(xì)胞保持密切聯(lián)系從而難以脫離原發(fā)灶。E-cad蛋白的功能或表達(dá)缺失時，腫瘤細(xì)胞間的黏附作用減弱從而獲得侵襲能力。目前腫瘤組織中Claudins的過表達(dá)機(jī)制正在研究中，研究結(jié)直腸癌組織Claudin-1的過表達(dá)機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，Claudin-1的過表達(dá)可以抑制E-cad表達(dá)，失去E-cad表達(dá)使E-cad/Tcf信號通路上調(diào)。Claudin-1在細(xì)胞膜上定位改變、E-cad表達(dá)減少、E-cad/Tcf信號通路上調(diào)共同作用促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)Claudin-1在人類原發(fā)性結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，抑制Claudin-1的表達(dá)后可增加E-cad的轉(zhuǎn)錄，從而提示Claudin-1可促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[11]。有研究發(fā)現(xiàn)Claudin-1在肺腺癌中的陽性表達(dá)與預(yù)后差有關(guān)[12-14]。本研究結(jié)果顯示，高、中分化腺癌中E-cad、nm23的表達(dá)高于低分化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。高、中分化腺癌中CyclinD1、Claudin-1的表達(dá)低于低分化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。E-cad在肺腺癌表達(dá)降低，在高中分化肺腺癌與低分化肺腺癌的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。nm23基因是腫瘤細(xì)胞重要轉(zhuǎn)移抑制基因，對癌細(xì)胞的運(yùn)動與轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，主要通過參與G蛋白調(diào)控跨膜信息傳遞，從而對細(xì)胞分化及癌基因轉(zhuǎn)化起作用，其表達(dá)高低與腫瘤病理學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[15]。CyclinD1在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[16]，可作為判斷腫瘤分化程度的指標(biāo)，可能在肺癌發(fā)生過程中較早發(fā)生，具有早期診斷價值[17]。在肺腺癌組織，Claudin-1、CyclinD1的表達(dá)增高，從高分化到低分化，其過表達(dá)率均呈上升趨勢，而E-cad、nm23的表達(dá)率均呈降低趨勢。Claudin-1、CyclinD1、E-cad與nm23可能參與了正常細(xì)胞的生長發(fā)育及肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Claudin-1、E-cad、nm23、CyclinD1 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中相互拮抗，從而影響腫瘤的演進(jìn)，可作為組織學(xué)分型、臨床分期和預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)?？尚行暂^高，值得在基層醫(yī)院推廣。