李根，李吉東

（1 西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 咸陽 712082；2 四川大學(xué)納米生物材料研究中心，四川 成都 610064）

大段骨缺損由于因人而異的不規(guī)則特性，仍是臨床治療面臨的一大挑戰(zhàn)[1-3]。近年來，可注射骨修復(fù)材料因具有任意塑型、原位固化、微創(chuàng)等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[4-6]。以硫酸鈣[7]、磷酸鈣[8]、羥基磷灰石[9]等無機(jī)類及殼聚糖[10]、聚甲基丙烯酸甲酯[11]等高分子類為代表的可注射骨修復(fù)材料已取得了較好的進(jìn)展，但在不同程度上存在孔隙率低、固化時(shí)間過長或力學(xué)性能較差等缺點(diǎn)，仍難以滿足臨床對高性能可注射骨修復(fù)材料的需求。

聚氨酯因具有良好的生物相容性、可降解性和結(jié)構(gòu)可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，作為新型可注射材料的代表之一，已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注[12-14]。但其存在固化時(shí)間較長影響組織愈合、孔隙率較低阻礙細(xì)胞進(jìn)入生長、生物活性較低等問題，臨床應(yīng)用受限。

納米羥基磷灰石（nHA）因與骨礦物質(zhì)組成相似、具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域[15]。近年來已有研究報(bào)道成功制備了快速固化的可注射聚氨酯/羥基磷灰石根管充填材料，但缺少適宜成骨的孔隙結(jié)構(gòu)[16]。聚氨酯預(yù)聚物中存在的異氰酸根（NCO）可與水反應(yīng)生成CO2可使聚氨酯體系發(fā)泡成孔[17]，本研究將水作為發(fā)泡劑加入聚氨酯反應(yīng)體系，優(yōu)化雙組分設(shè)計(jì)[16,18]，構(gòu)建可注射nHA/PU 復(fù)合多孔骨修復(fù)支架，以期賦予材料利于細(xì)胞黏附、增殖和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)亩嗫捉Y(jié)構(gòu)，并對其結(jié)構(gòu)及性能進(jìn)行表征，探討其作為可注射多孔骨修復(fù)支架的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

聚四氫呋喃醚二醇（PTMEG），分子量2000；異佛爾酮二異氰酸酯（IPDI）；三乙醇胺；聚乙二醇（PEG），分子量600；1,4-丁二醇（BDO）；2,2-雙羥甲基丙酸（DMPA）；二月桂酸二丁基錫；鋅酸亞錫。以上試劑購自上海阿拉丁試劑公司，均為分析純。納米羥基磷灰石（nHA）參照文獻(xiàn)方法由本實(shí)驗(yàn)室自制[19]。

1.2 可注射聚氨酯多孔支架制備

組分A1：取PTMEG 和IPDI（NCO∶OH 摩爾比為2∶1）加入到三頸瓶中，70℃油浴反應(yīng)5h后，加入適量的擴(kuò)鏈劑BDO（質(zhì)量為PTMEG的2.22%）反應(yīng)2h，制得NCO 封端的聚氨酯預(yù)聚體。整個(gè)反應(yīng)過程使用氮?dú)獗Ｗo(hù)。

組分A2：取PTMEG 和IPDI（NCO∶OH 摩爾比為2∶1）加入到三頸瓶中，70℃油浴反應(yīng)5h后，加入適量的擴(kuò)鏈劑DMPA （質(zhì)量為PTMEG 的1.25%）反應(yīng)2h，制得NCO 封端的聚氨酯預(yù)聚體。整個(gè)反應(yīng)過程使用氮?dú)獗Ｗo(hù)。

組分B1（固化劑1）：在室溫下由二月桂酸二丁基錫、三乙醇胺、聚乙二醇600、水以質(zhì)量比1∶15∶6∶20均勻混合而成。

組分B2（固化劑2）：在室溫下由鋅酸亞錫、三乙醇胺、聚乙二醇600、水以質(zhì)量比3∶17∶45∶60均勻混合而成。

組分A 和組分B 分別按體積比50∶1 混合，充分?jǐn)嚢?0s后形成可注射聚氨酯基多孔材料，分別記為PU-1、PU-2、PU-3、PU-4，如表1所示。

表1 可注射PU復(fù)合多孔支架的編號及成分

1.3 可注射納米羥基磷灰石/聚氨酯復(fù)合多孔支架制備

在PU-3 的基礎(chǔ)上制備nHA/PU 復(fù)合支架，在組分A2 的制備中加入適量的擴(kuò)鏈劑DMPA 反應(yīng)2h后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、10%和20%的nHA粉末繼續(xù)攪拌2h，制得NCO 封端的聚氨酯預(yù)聚體，分別記為Pre-PU0、Pre-PU10 和Pre-PU20。整個(gè)反應(yīng)過程使用氮?dú)獗Ｗo(hù)。含nHA 0、10%和20%的可注射nHA/PU 基復(fù)合多孔支架分別記為PU0、PU10和PU20。

1.4 測試與表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM，JSM-6500LV，日本電子公司）觀察多孔支架的形貌；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，Nicolet-6700，美國Thermo 公司）用于樣品的官能團(tuán)和化學(xué)鍵表征；采用X射線衍射儀（XRD，DX-2500，中國丹東方圓公司）分析多孔支架的物相組成和晶體結(jié)構(gòu)；電子萬能試驗(yàn)機(jī)（AGIC50，日本島津公司）測定力學(xué)性能（測定方法參照GB/T 1041—92，試驗(yàn)壓頭速度為0.5mm/min）；同步熱分析儀（STA，449F3，德國耐馳公司）用于熱力學(xué)分析；采用水浸漬法[20]測定PU系列骨修復(fù)支架的孔隙率；用Image J分析軟件統(tǒng)計(jì)支架的孔徑分布；采用Gillmore雙針法測定可注射PU 系列骨修復(fù)材料的初凝時(shí)間與終凝時(shí)間（測定方法參照GB/T 1346—2011）。

2 結(jié)果與討論

2.1 可注射PU多孔支架的性能表征

圖1(a)、(b)、(e)、(f)分別為PU-1、PU-2、PU-3和PU-4 的多孔支架形貌圖。從圖1 可以看出，PU-1、PU-3多孔支架富含貫穿孔，且孔徑主要分布在100～700μm[圖1(c)、(g)]。PU-3較PU-1孔徑分布更加均勻。PU-2、PU-4 孔徑分布相對均勻，但存在較多閉合孔，不利于細(xì)胞和組織長入。

圖1 不同A、B組分混合制備的可注射PU復(fù)合多孔支架的SEM照片和孔徑分布

圖2為可注射PU系列骨修復(fù)材料的終凝時(shí)間。從圖中可以看出，PU-2的終凝時(shí)間最短為(1±0.1)h，其次是PU-3，終凝時(shí)間為(5±0.4)h。兩者的終凝時(shí)間顯著低于PU-1、PU-4，表明以DMPA 為擴(kuò)鏈劑可以加速聚氨酯預(yù)聚物與固化劑反應(yīng)，縮短固化時(shí)間。此外，PU-2 與PU-3 的固化時(shí)間均明顯低于FDA 批準(zhǔn)的新型PU 基生物材料（KryptoniteTM）24h 的固化時(shí)間[14]，可以更好地滿足臨床應(yīng)用要求。其中PU-3 固化時(shí)間較PU-2 略長，但能獲得較理想的孔隙結(jié)構(gòu)，故優(yōu)選PU-3支架進(jìn)一步研究。

圖2 可注射PU的終凝時(shí)間

2.2 可注射nHA/PU復(fù)合多孔支架的性能表征

nHA 作為人骨主要的無機(jī)成分，具有良好的生物活性，是一種理想的骨修復(fù)材料[21]。在PU-3的基礎(chǔ)上復(fù)合nHA制備出nHA/PU仿生復(fù)合多孔支架。從圖3 可以看出，PU0、PU10、PU20 支架富含貫穿孔，孔形為球形或橢球形，孔徑均勻分布在100～700μm，適合細(xì)胞的遷入和增殖[22]。添加nHA 的復(fù)合多孔支架貫通性較好。隨著nHA 含量的增加，支架貫通性得到提高，有利于組織的長入及營養(yǎng)物的運(yùn)輸[23]?？紫堵蕼y試結(jié)果（表2）顯示，未添加nHA 的支架孔隙率高于添加nHA 組15%以上，且隨著nHA添加量的增加，制備的PU20復(fù)合支架孔隙率降低至57.8%±2.9%，依然可以滿足細(xì)胞及組織的長入[19]。

表2 不同nHA比例的PU復(fù)合支架的孔隙率和力學(xué)性能

圖3 不同nHA比例制備的可注射PU復(fù)合多孔支架的SEM照片和孔徑分布

圖4 為PU0、PU10、PU20 支架的固化時(shí)間。從圖4 可以看出，PU0 初凝時(shí)間和終凝時(shí)間最短，分別為(3±0.2)h 和(5±0.4)h。PU20 初凝時(shí)間和終凝時(shí)間最長，分別為(4.5±0.2)h和(8±0.4)h。PU的固化時(shí)間隨nHA 含量的增高而增加，主要是nHA 的加入在一定程度上阻礙了聚合物鏈間的相互作用，從而減緩了聚合過程，加入nHA 越多，對聚合反應(yīng)的影響越顯著。

圖4 不同nHA比例PU的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間

圖5 為3 種可注射PU 基多孔支架和nHA 的XRD 圖，PU 是一種半結(jié)晶聚合物，其衍射峰主要出現(xiàn)在衍射角為20°附近[24]，nHA的添加降低了PU的結(jié)晶度，可能是由于高比表面積nHA 納米顆粒均勻地分散在聚氨酯基體中，于無機(jī)-有機(jī)界面處形成大量氫鍵使得聚氨酯交聯(lián)過程中氫鍵化程度下降，限制了分子鏈段的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致PU結(jié)晶度下降。此外，支架中nHA（對應(yīng)PDF 標(biāo)準(zhǔn)卡片#090432）峰強(qiáng)度隨著nHA 含量的增加而逐漸增強(qiáng)，主要在2θ=31.77°處最為顯著。PU20支架的XRD譜圖中出現(xiàn)較明顯的nHA衍射峰，而PU10圖譜中只觀察到較弱的nHA 衍射峰，主要是無機(jī)粒子被PU 包覆，使其衍射峰強(qiáng)度減弱。

圖5 nHA和PU復(fù)合支架的XRD圖

圖6是添加不同比例nHA的PU預(yù)聚物和PU復(fù)合支架的紅外光譜圖。圖6(a)顯示隨著nHA的摻入量增多，2256cm-1附近—NCO的伸縮振動(dòng)峰明顯減弱，驗(yàn)證了聚合反應(yīng)受nHA 影響較大。因此，在PU10 與PU20 制備過程中增加25% IPDI，以減弱nHA 對聚合反應(yīng)的影響。圖6(b)顯示，3330cm-1處的寬峰為硬段N—H 的伸縮振動(dòng)峰，2854cm-1處的吸收峰則是亞甲基的對稱伸縮振動(dòng)峰，1717cm-1附近的吸收峰為氫鍵化的酰胺碳基伸縮振動(dòng)峰，1540cm-1左右的峰屬于C—N伸縮振動(dòng)峰和N—H彎曲振動(dòng)峰的疊加，1238cm-1附近的吸收峰則是酰胺Ⅲ的振動(dòng)吸收峰，1103cm-1左右的峰可能是C—O伸縮振動(dòng)峰或者C—N 伸縮振動(dòng)峰。這些吸收峰的出現(xiàn)表明生成了氨基甲酸酯交聯(lián)鍵。且PU 在2854cm-1、2797cm-1、1717cm-1、1238cm-1、1103cm-1等處的吸收峰隨著nHA 的增加而減弱，表明PU的聚合程度隨著nHA 的增多而降低。2256cm-1處—NCO 的吸收峰隨著nHA 的摻入量增多而減弱至消失，表明添加nHA 要消耗反應(yīng)體系中部分—NCO，在摻加nHA 的體系中適量增加IPDI 能有效提高聚氨酯的聚合程度。

圖6 不同nHA比例的Pre-PU和PU復(fù)合支架的紅外光譜圖

PU10和PU20支架的力學(xué)強(qiáng)度顯著高于PU0支架（表2），如PU20的壓縮強(qiáng)度約為PU0的3.9倍。摻加nHA 顯著增強(qiáng)支架的力學(xué)性能，這主要是由于nHA 的高比表面積與表面活性，促進(jìn)了無機(jī)/有機(jī)兩相的界面結(jié)合。同時(shí)，nHA 納米顆粒的均勻分布，分散了負(fù)荷，推動(dòng)應(yīng)力從聚氨酯大分子轉(zhuǎn)移到無機(jī)納米粒子，延緩了斷裂，從而增大了壓縮強(qiáng)度。因此nHA 在一定程度上摻入越多，支架的強(qiáng)度增加越顯著。

圖7顯示了3種支架的TG曲線均出現(xiàn)了兩個(gè)明顯的失重階段，第一失重階段為PU 硬段降解，第二階段對應(yīng)PU軟段降解[25]。根據(jù)TG曲線，以失重5%對應(yīng)溫度為支架的初始分解溫度來考察支架的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如表3 所示。與PU0 支架相比，PU10、PU20 復(fù)合支架的初始分解溫度分別高出4.2℃、4.9℃，表明摻加一定量的nHA 提高了復(fù)合支架的熱穩(wěn)定性。主要是均勻分散的nHA與PU機(jī)體中的氨基甲酸酯基團(tuán)形成較多的氫鍵，增強(qiáng)了材料中硬段微區(qū)的凝聚力，進(jìn)而提高了支架中PU 的交聯(lián)程度。三者殘余質(zhì)量分別為0.15%、9.8%、19.8%，與無機(jī)添加物的比例基本保持一致。

圖7 不同nHA含量PU復(fù)合支架的TG曲線

表3 PU多孔復(fù)合支架的熱分析結(jié)果

3 結(jié)論

采用雙組分設(shè)計(jì)以水為發(fā)泡劑成功制備了可注射nHA/PU復(fù)合多孔支架。支架具有較高的孔隙率和貫通性，孔徑均勻分布在100～700μm，適宜細(xì)胞生長，可在8h 固化。添加nHA 顯著提高了支架的力學(xué)強(qiáng)度，但在一定程度上降低了支架的孔隙率。研制的可注射原位任意塑形固化的nHA/PU復(fù)合多孔支架在不規(guī)則骨缺損修復(fù)領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。