張喜奎,王巧花,王旭麗,李靈輝,朱為坤

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院,福建 福州350003;2.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州350122)

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CRF)指各慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末階段而出現(xiàn)的臨床綜合征[1]。中醫(yī)古籍中并無(wú)“慢性腎衰竭”這一病名,但根據(jù)其病機(jī)特點(diǎn)及臨床特征,可將其歸屬于“關(guān)格”“腎勞”“水腫”“癃閉”等范疇。CRF病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜,病性多為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜,常以脾腎虧虛為致病之本,濁毒瘀血內(nèi)阻、三焦不利為致病之標(biāo)。虛實(shí)互見(jiàn)、寒熱錯(cuò)雜是其重要病理特點(diǎn),瘀血濁毒內(nèi)阻貫穿病變過(guò)程的始終[2]。桃核承氣湯具有活血化瘀、通腑瀉濁的功效,臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)其為治療CRF的有效方劑[3-5]。

慢性腎衰竭的發(fā)生受到多種細(xì)胞因子和分子因素的調(diào)節(jié),病變機(jī)制復(fù)雜,其主要病理基礎(chǔ)是腎纖維化。研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活是腎纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(APC)和T細(xì)胞因子4(TCF4)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要因子,在腎纖維化過(guò)程中起著重要作用,已被證實(shí)與慢性腎衰竭的發(fā)生關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)用桃核承氣湯干預(yù)CRF模型大鼠,綜合大鼠一般情況、貧血指標(biāo)、腎功能、腎組織形態(tài)以及β-catenin、APC及TCF4的mRNA和蛋白表達(dá)情況,以期探討桃核承氣湯對(duì)慢性腎衰竭大鼠的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002)采購(gòu)125只7周齡雄性,體質(zhì)量約在200g左右的Wistar大鼠,飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

桃核承氣湯飲片:桃仁12g、生大黃12g(后入)、芒硝6g(沖服)、桂枝6g、炙甘草6 g,購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院,煎煮并濃縮成42 g/100 m L的中藥液,分裝至EP管,保存于4℃冰箱備用。內(nèi)蒙古康臣藥業(yè)無(wú)糖型尿毒清顆粒(國(guó)藥準(zhǔn)字:Z20073256)與加熱后的超純水配成25%的溶液。

注射用青霉素鈉(魯抗制藥,國(guó)藥準(zhǔn)字:H37020079);APC抗體(Abcam公司,英國(guó),批號(hào):ab40778);β-catenin抗體(三鷹生物技術(shù)有限公司,武漢,批號(hào):51067-2-AP);TCF-4抗體(Abcam公司,英國(guó),批號(hào):ab76151);β-actin抗體(三鷹生物技術(shù)有限公司,武漢,批號(hào):66009-1-Ig);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme生物科技有限公司,南京,批號(hào):R123-01);PCR試劑盒(Vazyme生物科技有限公司,南京,批號(hào):Q311-02);PBS磷酸鹽干粉(Solarbio科技有限公司,北京,批號(hào):AR0030)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó),型號(hào):5424R);血液分析儀(SYSMEX公司,日本,型號(hào):XT-2000iV);生化分析儀(Beckman公司,美國(guó),型號(hào):AU5800);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司,美國(guó),型號(hào):ABI7500);電泳儀(Bio-Rad公司,美國(guó),型號(hào):POWER PAC3000);光學(xué)顯微鏡(Zeiss公司,德國(guó),型號(hào):Axio Scope.A1);超薄切片機(jī)(Leica公司,德國(guó),型號(hào):UC-6型);透射電子顯微鏡(日立公司,日本,型號(hào):H-7650型);電鏡圖像采集分析系統(tǒng)(SIS公司,德國(guó),型號(hào):VELETA型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模方法

先將125只Wistar大鼠以隨機(jī)的方式各抽取25只大鼠作為空白組和假手術(shù)組,其中空白組不做手術(shù)干預(yù),假手術(shù)組僅行手術(shù)剝離雙腎被膜;余下的75只大鼠參照文獻(xiàn)[4]5/6腎切除方法建立CRF大鼠模型:即先切除左側(cè)2/3腎臟,1周后再結(jié)扎并剪除右側(cè)腎臟。術(shù)后第3周采血檢測(cè)Scr水平檢測(cè)造模是否成功,確認(rèn)造模成功后再隨機(jī)分成模型組、尿毒清組以及桃核承氣湯組各25只大鼠。

2.2 干預(yù)方法

術(shù)后第4周開(kāi)始對(duì)各組大鼠進(jìn)行藥物灌胃干預(yù)。參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)換算法,大鼠每公斤體重的用藥劑量參照標(biāo)準(zhǔn)成人每公斤體重用量的6倍[5],除桃核承氣湯組和尿毒清組分別予桃核承氣湯、尿毒清顆?；鞈乙?0 m L/(kg·d)灌胃外,余下3組大鼠則予等劑量生理鹽水灌胃,灌胃時(shí)間為56 d。

2.3 觀察指標(biāo)及方法

2.3.1 大鼠一般情況觀察 觀察并記錄大鼠體型體態(tài)、活動(dòng)情況、應(yīng)激反應(yīng)、飲食、二便及體質(zhì)量變化等一般情況。

2.3.2 腎組織病理形態(tài)觀察 灌胃56 d結(jié)束后,即予禁食不禁水24 h。各組隨機(jī)抽取3只大鼠,在未取血的情況下麻醉大鼠后,暴露左側(cè)腎臟,于皮質(zhì)部分取約1 mm×1 mm×1mm的組織3~4塊,迅速投入3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1MPBS和1%鋨酸的溶液中進(jìn)行雙重固定,經(jīng)乙醇-丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹(shù)脂包埋,半薄切片定位、超薄切片干燥,電子染色,最后于透射電鏡下觀察腎組織病理形態(tài)。

2.3.3 血常規(guī)、腎功能檢測(cè) 麻醉大鼠后迅速打開(kāi)腹腔,抽取腹主動(dòng)脈血液運(yùn)用血液分析儀和生化分析儀檢測(cè)RBC、HB、Scr、BUN含量。

2.3.4 qPCR法檢測(cè) 在采集大鼠血液標(biāo)本后,快速摘取左殘腎,將組織切分后裝入凍存管,放置于-80℃冰箱保存。取100 mg腎組織進(jìn)行RNA提取,測(cè)定濃度后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),分別取2μL PCR產(chǎn)物在實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀進(jìn)行qPCR反應(yīng)。用2-△△Ct表示APC、β-catenin及TCF4相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 腎組織β-catenin、APC、TCF4引物序列

2.3.5 Western blot法檢測(cè) 取100 mg腎組織進(jìn)行蛋白提取,用BCA法測(cè)定蛋白濃度;于待測(cè)樣本中加入上樣緩沖液,放置金屬浴5 min,待蛋白充分變性;根據(jù)蛋白分子量配制SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離;經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗、二抗進(jìn)行孵育;最后在PVDF膜上滴入顯影液,放入顯影儀中曝光成像,用Image Lab軟件分析腎組織中β-catenin、APC及TCF4的蛋白表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用(±s)表示。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

空白組與假手術(shù)組大鼠外形及精神狀態(tài)良好,體重平穩(wěn)增長(zhǎng);模型組大鼠體型較瘦,毛色枯槁,爪、尾色淡,反應(yīng)遲緩,不喜活動(dòng),進(jìn)食減少,大便質(zhì)稀,個(gè)別大鼠存在“腹水”情況,體重增長(zhǎng)緩慢;桃核承氣湯組大鼠體型偏瘦,毛色偏暗,活動(dòng)靈敏度一般,食量減少,糞質(zhì)較稀,體重增長(zhǎng)較慢;尿毒清組大鼠一般情況介于模型組與桃核承氣湯組之間。各組大鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)表2、圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)

表2 灌胃前后各組大鼠體質(zhì)量變化(n=17~25±s,g)

表2 灌胃前后各組大鼠體質(zhì)量變化(n=17~25±s,g)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與尿毒清組比較,▲P<0.05。

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3.2 腎組織病理形態(tài)觀察

如圖2所示,正常組及假手術(shù)組大鼠腎組織形態(tài)正常,細(xì)胞結(jié)構(gòu)鏡下清晰可見(jiàn),排列緊密規(guī)則。模型組大鼠細(xì)胞

圖2 電鏡下各組大鼠左腎組織形態(tài)(×10 000)

核固縮變形,部分溶解,細(xì)胞邊緣不光滑,可見(jiàn)線粒體空泡,線粒體嵴模糊;腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞增生水腫,基底膜明顯增厚,足突大面積融合;腎小管細(xì)胞形態(tài)排列紊亂,局部系膜基質(zhì)增生,可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn),絨毛脫落、消失。尿毒清組整體情況較模型組有所改善,可見(jiàn)脂質(zhì)空泡,基底膜稍有增厚,足突部分融合,部分線粒體完整,可見(jiàn)明顯的線粒體嵴。桃核承氣湯組大鼠細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,雙層細(xì)胞核膜明顯,細(xì)胞質(zhì)中多數(shù)線粒體結(jié)構(gòu)完整,可見(jiàn)線粒體脊;腎小球內(nèi)皮細(xì)胞排列較為整齊,基底膜局部可見(jiàn)增厚,足突部分融合;腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂,絨毛少量脫落。

3.3 貧血指標(biāo)、腎功能檢測(cè)結(jié)果

從各組大鼠RBC、Hb的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,空白組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);尿毒清組與桃核承氣湯組兩組結(jié)果均低于空白組,但均較模型組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);尿毒清組與桃核承氣湯組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、圖3、圖4。

表3 大鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

表3 大鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與尿毒清組比較,▲P>0.05。

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圖3 各組大鼠RBC含量

圖4 各組大鼠Hb含量

從各組大鼠Scr、BUN的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,空白組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);尿毒清組與桃核承氣湯組結(jié)果均高于空白組,但均較模型組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);桃核承氣湯組結(jié)果相對(duì)尿毒清組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖5、圖6。

表4 各組大鼠血肌酐、尿素氮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

表4 各組大鼠血肌酐、尿素氮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與尿毒清組比較,▲P<0.05。

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圖5 各組大鼠Scr含量

圖6 各組大鼠BUN含量

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

如圖7所示,空白組 與假 手術(shù)組APC、β-catenin和TCF4的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異;桃核承氣湯組APC的mRNA表達(dá)水平相對(duì)空白組降低(P<0.05),但較模型組和尿毒清組升高(P<0.05);桃核承氣湯組β-catenin、TCF4的mRNA表達(dá)水平相對(duì)空白組升高(P<0.05);但較模型組與尿毒清組降低(P<0.05)。

圖7 各組大鼠腎組織中APC、β-catenin、TCF4mRNA表達(dá)結(jié)果

3.5 Western Blot檢測(cè)結(jié)果

如圖8所示,空白組與假手術(shù)組APC、β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異;桃核承氣湯組APC的蛋白表達(dá)水平較空白組降低,但高于模型組和尿毒清組;桃核承氣湯組β-catenin、TCF4的蛋白表達(dá)水平較空白組升高,但低于模型組與尿毒清組。

圖8 各組大鼠腎組織中APC、β-catenin、TCF4蛋白表達(dá)結(jié)果

4 討論

慢性腎衰是多種慢性腎臟疾病的終末階段,以腎臟結(jié)構(gòu)被破壞、腎小球?yàn)V過(guò)率降低、腎功能?chē)?yán)重受損、體內(nèi)代謝產(chǎn)物潴留及酸堿平衡紊亂為主要病理表現(xiàn)。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,目前我國(guó)慢性腎臟病的發(fā)病率約為10.8%,其中每年約有數(shù)十萬(wàn)例進(jìn)展為CRF[6]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療CRF早中期主要針對(duì)原發(fā)病采取對(duì)癥治療,而到中后期則多是利用透析療法以維持生命,但這些治療方法存在著諸如費(fèi)用高昂、感染率高、副作用顯著等弊端。中醫(yī)在改善CRF相關(guān)臨床癥狀、預(yù)防和治療并發(fā)癥發(fā)面均突顯其優(yōu)勢(shì)。尋找有效抗腎纖維化的中藥及方劑,探討其具體作用機(jī)制,有助于預(yù)防和延緩CRF進(jìn)展。

慢性腎衰竭多是以瘀血濁毒貫穿病變過(guò)程的始終,因此CRF治療應(yīng)以逐瘀泄?jié)釣橹?通過(guò)祛除瘀血濁毒,給邪氣以出路,使邪卻則正復(fù)。桃核承氣湯出自張仲景《傷寒論》,該方原主邪熱與瘀血互結(jié)下焦所致之蓄血證,具有瀉下瘀血、祛除濁毒的功效,與CRF病機(jī)、臨床表現(xiàn)相吻合。尿毒清顆粒是臨床上治療CRF使用較為廣泛的中藥復(fù)合制劑,具有通腑降濁、健脾祛濕、活血化瘀的作用,臨床療效肯定,故將其作為本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),CRF模型組大鼠精神狀態(tài)較差,體型較瘦,毛色枯槁,爪、尾色淡,反應(yīng)遲緩,不喜活動(dòng),進(jìn)食減少,大便質(zhì)稀,個(gè)別大鼠存在“腹水”情況,體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢,甚至出現(xiàn)體質(zhì)量下降。且病理觀察發(fā)現(xiàn)腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞外基質(zhì)增多,腎間質(zhì)纖維化明顯,較為符合中醫(yī)慢性腎衰竭的生物學(xué)特征,提示成功建立CRF大鼠模型。

CRF病變機(jī)制復(fù)雜,其中腎纖維化是其主要病理基礎(chǔ),腎纖維化的發(fā)生和持續(xù)加重可能涉及到炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞因子和分子因素的表達(dá)異常,在此基礎(chǔ)上導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多及沉積過(guò)度是腎纖維化形成的重要分子基礎(chǔ)[7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活、傳導(dǎo)與腎纖維化的發(fā)生關(guān)系密切。腎損傷時(shí)會(huì)激活Wnt通路,引發(fā)下游多種腎纖維化相關(guān)靶基因的異常表達(dá),從而導(dǎo)致腎單位持續(xù)性、不可逆性損傷[8]。β-catenin表達(dá)升高是導(dǎo)致腎纖維化的重要因素,當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí),游離態(tài)的β-catenin會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核,與核內(nèi)的TCF/LEF的氨基末端結(jié)合,共同參與調(diào)控Wnt通路介導(dǎo)的腎纖維化轉(zhuǎn)錄[9]。APC作為降解β-catenin的多蛋白復(fù)合體的重要組分,通過(guò)磷酸化控制β-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移,是Wnt信號(hào)通路的重要抑制因子[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠腎組織中APC的mRNA和蛋白相對(duì)空白組和假手術(shù)組呈低表達(dá),而β-catenin、TCF4的mRNA和蛋白含量則呈高表達(dá),這與既往相關(guān)文獻(xiàn)[11]報(bào)道結(jié)果一致。經(jīng)灌胃干預(yù)后,桃核承氣湯組大鼠的一般情況、血常規(guī)和腎功能、腎臟病變組織修復(fù)方面均較模型組明顯改善,且該組APC的mRNA和蛋白表達(dá)含量升高,而β-catenin、TCF4表達(dá)均下降。因此認(rèn)為,桃核承氣湯可能是通過(guò)上調(diào)Wnt信號(hào)通路中APC的表達(dá)、下調(diào)β-catenin、TCF4的表達(dá)水平,減少細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成,抑制腎纖維化進(jìn)展,從而達(dá)到治療CRF的目的。

綜上所述,桃核承氣湯治療CRF的作用機(jī)制可能與上調(diào)APC表達(dá)、下調(diào)β-catenin及TCF4的表達(dá)以抑制Wnt/βcatenin通路活性,改善貧血狀態(tài)和腎功能,減輕和修復(fù)腎纖維化有關(guān),但其具體調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。