隋夕然，王 妍，2，*，劉云根，2，張雅潔，吳麗芳

(1.西南林業(yè)大學 生態(tài)與環(huán)境學院，云南 昆明 650224；2.云南省山地農(nóng)村生態(tài)環(huán)境演變與污染治理重點實驗室，云南 昆明650224)

喀斯特生態(tài)系統(tǒng)是一個環(huán)境容量低、生態(tài)系統(tǒng)變異敏感度高、災害承受閾值低的具有生態(tài)脆弱性特征的特殊生態(tài)系統(tǒng)?？λ固氐貐^(qū)的生態(tài)環(huán)境非常脆弱，土層淺薄，貯水能力差，加之人為破壞和不合理利用，石漠化問題非常突出[1]。相較于其他喀斯特地貌類型區(qū)，我國西南石漠化區(qū)的治理工作在基礎(chǔ)理論研究方面相對薄弱[2]，治理技術(shù)模式單一[3]，效果不理想，亟需相關(guān)科學研究提供理論依據(jù)和有效技術(shù)支撐。

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著養(yǎng)分驅(qū)動者的角色，與土壤養(yǎng)分的遷移和轉(zhuǎn)化息息相關(guān)[4]。在土壤微生物中，細菌分布最廣泛，數(shù)量、類群最多，參與土壤的養(yǎng)分循環(huán)利用，維持生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)[5]。尹娜[6]研究顯示，在歐亞草原帶上，土壤碳、氮、磷等營養(yǎng)元素的含量對土壤細菌多樣性有顯著影響；戴雅婷等[7]發(fā)現(xiàn)，庫布齊沙地自然恢復的油蒿群落根際土壤的細菌群落豐度，與土壤含水量，及氮、磷、鉀等養(yǎng)分含量密切相關(guān)；韓亞飛等[8]研究顯示，在門分類水平上，變形菌門為連作楊樹人工林土壤中豐度最高的優(yōu)勢菌群；柳春林等[9]認為，土壤全氮與變形菌群具有正向的相互促進作用。目前，針對典型喀斯特區(qū)域土壤養(yǎng)分、細菌群落組成、多樣性對不同海拔梯度響應(yīng)的研究工作在本文檢索范圍內(nèi)還鮮見報道，關(guān)于不同海拔對典型喀斯特區(qū)域松林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，及微生物與環(huán)境因子的關(guān)系等問題，尚無明確結(jié)論。

云南省建水縣是我國西南喀斯特區(qū)域的典型代表，當?shù)氐貏菸髂细摺|北低，海拔高差大，碳酸鹽分布廣泛，土地石漠化現(xiàn)象嚴重[10]。本研究深入探索該區(qū)域不同海拔對云南松林土壤理化性質(zhì)的影響，以及不同海拔梯度下云南松林土壤微生物的群落組成和多樣性特征，并基于高通量測序技術(shù)，揭示微生物群落組成和多樣性對喀斯特地區(qū)海拔梯度的響應(yīng)關(guān)系，以期為我國西南典型喀斯特區(qū)域的石漠化治理、植被恢復提供理論支撐，為當?shù)氐耐寥牢⑸锒鄻有匝芯亢捅Ｗo提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于云南省建水縣境內(nèi)，地理坐標為102°49′～103°9′E、23°18′N～23°40′N，海拔在1 300～2 100 m。該區(qū)屬南亞熱帶季風氣候，年均氣溫19.8 ℃，年均地溫20.8 ℃，年均相對濕度72%，年均日照時數(shù)2 322 h，全年無霜期307 d[11]。該區(qū)碳酸鹽巖溶地貌分布廣泛，土壤巖性以石灰?guī)r為主，基巖裸露率在30%～70%。受土壤母質(zhì)影響，當?shù)氐闹饕寥李愋蜑槭彝粒诸愋蜑閬啛釒С＞G落葉闊葉混交林[12]。

1.2 試驗設(shè)計與樣品采集

2019年9月，在研究區(qū)海拔1 300～2 100 m范圍內(nèi)，以高程200～300 m作為一個梯度(具體地，分別對應(yīng)于海拔1 300、1 600、1 900、2 100 m，各海拔梯度上研究區(qū)的基本情況詳見表1)，在每個海拔梯度上選取3個云南松林代表性區(qū)域設(shè)置樣地，共布設(shè)12個樣地，每個樣地的大小均為20 m×20 m。同時，在每個樣地的4個角和對角線交點處再設(shè)置5個2 m×2 m的樣方，在每個樣方中心采集500 g土壤進行混合，從混合均勻的土壤中取出500 g(以下將其稱為土樣1)帶回實驗室用于理化性質(zhì)測定。同時，為了避免微生物樣品污染，嚴格按照相關(guān)要求采集10 g土樣(以下將其稱為土樣2)，剔除大的石塊和雜質(zhì)，而后放入無菌離心管中密封，在干冰保護環(huán)境下帶回實驗室，用于土壤微生物檢測。

表1 不同海拔梯度的研究區(qū)概況

土樣1在室溫下風干，研磨，分別過2、0.25 mm篩，測定土壤理化性質(zhì)。土樣2在超凈臺中剔除更小的石塊和雜質(zhì)，從剩下的混合均勻的無雜質(zhì)樣本中取出5 g放入無菌離心管，加干冰低溫保存，送往上海凌恩生物科技有限公司進行DNA提取和微生物測序。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

本研究測定的土壤理化性質(zhì)指標包括全碳(TC)、全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)、速效氮(AN)、速效磷(AP)、速效鉀(AK)、pH[13]。其中：TC采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定，TN采用凱氏定氮法測定，TP采用NaOH堿熔-鉬銻抗比色法測定，TK采用NaOH熔融-火焰光度法測定，AN采用堿解擴散法測定，AP采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定，AK采用NH4OAc浸提-火焰光度法測定，pH采用酸度計法測定。

測定上述指標時用到的主要儀器包括：HWS-26型電熱恒溫油浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；KDN-1000型全自動凱氏定氮儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司；T6新世紀型紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；AB204-S型火焰光度計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；BL-WM100型擴散皿，北京艾維科電科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010程序進行數(shù)據(jù)錄入、整理和初步分析；采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，檢驗不同海拔云南松林的土壤養(yǎng)分差異(顯著性水平選定為α=0.05)；利用Canoco 5軟件進行冗余分析(RDA)，探討云南松林土壤養(yǎng)分指標和細菌群落之間的相關(guān)性。

使用QIIME 1.9.1軟件對獲得的高質(zhì)量微生物序列按97%的序列相似度進行歸并，劃分運算分類單元(OTU)，基于Silva參考數(shù)據(jù)庫進行比對，得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息；基于OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲得每個樣本在各分類水平的群落組成；計算測序豐富度指數(shù)(Chao1)、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))。

利用Origin 2019軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔云南松林的土壤養(yǎng)分含量變化

研究區(qū)不同海拔云南松林地土壤理化性質(zhì)變化明顯(圖1)。隨海拔升高：土壤pH先減小后增大，海拔1 300 m處土壤pH最高(7.72)，海拔1 900 m處土壤pH最低(6.34)，且不同海拔間差異顯著；TC、TN、TP含量先增加后降低，且不同海拔間差異顯著，三者的含量范圍分別為11.60～48.26、1.32～3.09、0.54～0.97 g·kg-1；AN含量先顯著增加，后顯著降低，但海拔1 300 m與2 100 m處差異不顯著，含量范圍在65.27～144.52 mg·kg-1；TK含量在各海拔處差異顯著，以海拔1 900 m處最高(0.66 g·kg-1)、海拔1 600 m處最低(0.38 g·kg-1)；AP含量同樣在各海拔處差異顯著，但以海拔1 600 m處最高(2.64 mg·kg-1)、海拔1 900 m處最低(1.44 mg·kg-1)；AK含量以海拔1 900 m處最高(95.25 mg·kg-1)、海拔1 600 m處最低(60.40 mg·kg-1)，兩者差異顯著，且均顯著高于其他海拔處，但海拔1 300 m與海拔2 100 m處的土壤AK含量無顯著差異。

TC，全碳；TN，全氮；TP，全磷；TK，全鉀；AN，速效氮；AP，速效磷；AK，速效鉀。下同。

2.2 不同海拔云南松林的土壤細菌群落豐度與多樣性

測序結(jié)果顯示，各樣品文庫的覆蓋率(coverage)在98.11%～99.01%(表2)，說明測序結(jié)果能夠代表土壤中細菌群落的真實情況。從Chao1指數(shù)和OTU數(shù)來看，研究區(qū)內(nèi)各海拔的細菌群落豐度從高到低依次為1 900 m>1 600 m>2 100 m>1 300 m。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)都是用來估算樣本中微生物多樣性的指標，在生態(tài)學中常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性。Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。在本研究中，Shannon指數(shù)值在海拔1 900 m最大，Simpson指數(shù)值在海拔1 900 m最小，說明云南松林土壤細菌的群落多樣性在該海拔處最高。這一結(jié)果表明，不同海拔梯度對土壤細菌多樣性的影響是不同的。

表2 不同海拔云南松林土壤的細菌豐度與多樣性

2.3 不同海拔云南松林的土壤細菌分類

在門分類水平上(圖2)，相對豐度較大的有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)，分別占總測序序列的33.37%、24.40%、19.82%、12.06%，且在4個海拔梯度上均有；疣微菌門(Verrucomicrobia)和棒狀桿菌門(Rokubacteria)分別占總測序序列的3.57%和1.22%，僅在海拔1 300、1 900、2 100 m上共有；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)占總測序序列的2.06%，在海拔1 300、1 600、1 900 m上共有；Patescibacteria占總測序序列的1.07%，在海拔1 900、2 100 m上共有；其他相對豐度不足1.5%的細菌合計占總測序序列的3.69%。在4個海拔共有的細菌中，變形菌門、酸桿菌門的相對豐度在海拔1 900 m處最大，綠彎菌門的相對豐度在海拔2 100 m處最大，放線菌門的相對豐度在海拔1 600 m處最大。除上述優(yōu)勢菌群外，其他相對豐度較低的細菌群落在不同海拔下相對豐度變化不大。

Proteobacteria，變形菌門；Acidobacteria，酸桿菌門；Chloroflexi，綠彎菌門；Actinobacteria，放線菌門；Verrucomicrobia，疣微菌門；Gemmatimonadetes，芽單胞菌門；Rokubacteria，棒狀桿菌門；Bacteroidetes，擬桿菌門；Latescibacteria，匿桿菌門。Blastocatellia(Subgroup 4)，母鏈菌綱；Bacteroidia，擬桿菌綱；Actinobacteria，放線菌綱；Deltaproteobacteria，δ-變形菌綱；Rubrobacteria，紅桿菌綱；Acidimicrobiia，酸微菌綱；Chloroflexia，綠彎菌綱；Gemmatimonadetes，芽單胞菌綱；Thermoleophilia，嗜熱油菌綱；Verrucomicrobiae，疣微菌綱；Gammaproteobacteria，γ-變形菌綱；Ktedonobacteria，纖線桿菌綱；Alphaproteobacteria，α-變形菌綱；Acidobacteriia，酸桿菌綱。

在綱分類水平上，相對豐度較大的集中于酸桿菌綱(Acidobacteriia)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)，合計占總測序序列的44.18%。其中，酸桿菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱在4個海拔梯度上共有，而δ-變形菌綱在海拔1 300、1 900、2 100 m上共有。α-變形菌綱、γ-變形菌綱的相對豐度在海拔1 900 m處最大，而酸桿菌綱的相對豐度在海拔1 900 m處最低，δ-變形菌綱的相對豐度在不同海拔間無顯著差異。在綱分類水平上，其他細菌群落在不同海拔的相對豐度變化不大。

2.4 不同海拔云南松林土壤養(yǎng)分與土壤細菌群落組成和多樣性的相關(guān)性

對不同海拔土壤細菌豐度、多樣性與土壤理化因子的相關(guān)關(guān)系進行分析(表3)，結(jié)果顯示：土壤pH值與Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)呈極顯著(P<0.01)負相關(guān)，與Simpson指數(shù)呈顯著(P<0.05)正相關(guān)；土壤TC、TN、TP、AN、AP分別與Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，土壤TC、TP、AP與Simpson指數(shù)呈極顯著(P<0.01)負相關(guān)；土壤TN、AN與Simpson指數(shù)呈顯著(P<0.05)負相關(guān)。

表3 土壤理化性質(zhì)與細菌豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)的相關(guān)性

對細菌群落組成與土壤養(yǎng)分指標進行冗余分析，結(jié)果顯示：pH、TC、TN和AN對細菌群落組成的影響程度較強。土壤pH與綠彎菌門、疣微菌門、棒狀桿菌門、Patescibacteria、芽單胞菌門的相對豐度正相關(guān)，與變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、匿桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度負相關(guān)；TC、TN和TP與放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、變形菌門、匿桿菌門的相對豐度正相關(guān)，與綠彎菌門、疣微菌門、棒狀桿菌門、Patescibacteria、芽單胞菌門的相對豐度負相關(guān)；AP和AN與放線菌門和芽單胞菌門的相對豐度正相關(guān)，與綠彎菌門、疣微菌門、棒狀桿菌門的相對豐度負相關(guān)；TK、AK與變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、匿桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、棒狀桿菌門、Patescibacteria的相對豐度正相關(guān)，與放線菌門、芽單胞菌門的相對豐度負相關(guān)。綜上所述，土壤pH、TC、TN、AN和TP是細菌群落組成變化的主要驅(qū)動因子，對變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、匿桿菌門等幾種優(yōu)勢菌門的影響最大。

Proteobacteria，變形菌門；Acidobacteria，酸桿菌門；Chloroflexi，綠彎菌門；Actinobacteria，放線菌門；Verrucomicrobia，疣微菌門；Gemmatimonadetes，芽單胞菌門；Rokubacteria，棒狀桿菌門；Bacteroidetes，擬桿菌門；Latescibacteria，匿桿菌門。圖3 細菌門分類群落與養(yǎng)分指標的冗余分析

3 討論

3.1 不同海拔對云南松林土壤養(yǎng)分含量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，典型喀斯特區(qū)不同海拔云南松林的土壤pH值，及全量養(yǎng)分和速效養(yǎng)分含量存在顯著差異。土壤pH值對土壤養(yǎng)分的理化性質(zhì)和有效性、微生物群落結(jié)構(gòu)，以及植物生長發(fā)育都有很大的影響[14]。在本研究中，隨著土壤pH值升高，土壤養(yǎng)分的有效性降低，這與王艷艷等[15]的研究結(jié)果相似。土壤碳、氮含量是反映土壤肥力的重要指標[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤TC、TN、AN含量隨海拔升高呈先上升后下降的趨勢，這與吳玥等[17]在戴云山研究的結(jié)果一致。原因可能是，本研究海拔梯度間跨度較大，溫度差異影響了土壤養(yǎng)分含量的積累[18]。在一定范圍內(nèi)，隨海拔升高，氣溫降低，動植物殘體的分解速率減慢，造成土壤有機碳、氮礦化速率降低[19]，相應(yīng)地，土壤中的碳、氮積累量增加，因此土壤養(yǎng)分含量先相應(yīng)升高。馬維偉等[20]認為，土壤養(yǎng)分含量的變化與溫度、水分的相關(guān)性很高，土壤養(yǎng)分的積累需要相對適宜的溫度，溫度過高或者過低都會產(chǎn)生負效應(yīng)。當海拔高度超過1 900 m后，溫濕度等因素共同作用下的環(huán)境已經(jīng)超出了喀斯特區(qū)云南松林土壤養(yǎng)分積累的閾值，因而土壤TC、TN、AN含量隨海拔升高反而呈現(xiàn)下降的趨勢。本研究中，土壤磷素含量在低海拔處較低。這可能是因為，低海拔區(qū)的溫度相對較高，磷素在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化能力較強[21]，更易流失，因而積累量較低。本研究中，土壤全鉀和速效鉀含量在不同海拔間無明顯規(guī)律，這可能與土壤的空間異質(zhì)性和人為因素有關(guān)[22]。

3.2 云南松林土壤細菌群落組成特點及其對海拔梯度的響應(yīng)

前人研究表明，海拔對土壤細菌組成和多樣性的影響不盡相同。Fierer等[23]發(fā)現(xiàn)，細菌多樣性沒有顯著的海拔梯度差異；Bryant等[24]發(fā)現(xiàn)，微生物多樣性隨海拔梯度上升而增加。本研究中，隨海拔升高，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)整體趨勢為先增大后減小，而Simpson指數(shù)的整體趨勢為先減小而后增大，且細菌多樣性與土壤pH值，及全碳、全氮、全磷和相應(yīng)的速效養(yǎng)分含量有顯著相關(guān)性。林耀奔等[25]發(fā)現(xiàn)，有機質(zhì)含量高、pH值低的環(huán)境更適于微生物的生存和繁殖；楊立賓等[26]發(fā)現(xiàn)，有機碳、氮、磷含量高的土壤中微生物數(shù)量最多，原因是細菌分解主要發(fā)生在有機質(zhì)含量高的土壤中。本研究中，在1 300～1 900 m，土壤有機碳、氮、磷含量逐漸升高，細菌的數(shù)量與多樣性也隨之增加。

本研究在土壤中檢測出變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門等優(yōu)勢細菌類群，其中，變形菌門的相對豐度最大，這與趙愛花等[27]在落葉闊葉林土壤上的研究結(jié)果一致。李艷春等[28]發(fā)現(xiàn)，在福建茶園土壤中，變形菌門是最主要的細菌類群，其代謝活動是土壤中最主要的細菌活動，隨著土壤氮素含量增加，變形菌門的豐度增加。這與本研究中土壤全氮含量與變形菌門細菌相對豐度正相關(guān)的結(jié)果一致。Jangid等[29]發(fā)現(xiàn)，在熱帶森林和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，變形菌、酸桿菌占比很大；Fierer等[30]發(fā)現(xiàn)，在溫帶森林土壤中豐度最大的細菌為酸桿菌；Yuan等[31]在青藏高原草地土壤、Liu等[32]在東北黑土中也發(fā)現(xiàn)，含量最豐富的細菌類群是酸桿菌。但在本研究中，酸桿菌門、放線菌門的相對豐度低于變形菌門。這說明，不同類型土壤中微生物的優(yōu)勢類群不盡相同，不同環(huán)境的微生物既具有豐富多樣性的特點，又具有類群相似性的特點[33]。

土壤細菌群落組成對土壤理化性質(zhì)的變化較為敏感，尤其是土壤碳庫和pH值對細菌群落組成的影響最為明顯[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH值與酸桿菌門細菌的相對豐度負相關(guān)，而土壤全碳、全氮、全磷含量與酸桿菌門正相關(guān)。這是因為，酸桿菌屬于嗜酸菌，更適宜在酸性環(huán)境中生存[35]。同時，酸桿菌門細菌具有編碼纖維素酶和淀粉水解酶的基因序列，可加速分解動植物殘體產(chǎn)生有機質(zhì)等養(yǎng)分[36]。綠彎菌門細菌需要消耗有機質(zhì)來供應(yīng)代謝活動所需要的能量[37]，因此綠彎菌門與土壤全碳、全氮、全磷含量負相關(guān)。本研究中，全碳、速效氮、全磷和速效磷與放線菌門正相關(guān)。這是因為，放線菌門具有促進土壤碳、氮、磷等養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和積累、提高土壤質(zhì)量的作用[38]。

綜上所述，典型喀斯特區(qū)云南松林土壤養(yǎng)分與細菌群落組成和多樣性對不同海拔的響應(yīng)顯著，土壤養(yǎng)分含量是影響土壤細菌群落組成與多樣性的主要因子，不同海拔土壤養(yǎng)分含量的變化會導致細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的規(guī)律性變化。