夏 萍 唐發(fā)輝 趙元莙

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

車輪蟲是一類危害性外寄生纖毛蟲, 常寄生于海、淡水魚類、部分貝類及極少數(shù)的腔腸動物; 當感染強度較大時, 可能引發(fā)宿主鰓呼吸功能障礙等,極其嚴重時可導致宿主死亡[1—3]。目前車輪蟲主要的研究工作大多數(shù)仍聚焦于形態(tài)分類學方面[4,5]。根據(jù)Lynn[6]纖毛蟲分類系統(tǒng), 車輪蟲科Trichodinidae包括車輪蟲屬Trichodina、三分蟲屬Tripartiella和小車輪蟲屬Trichodinella等10個屬, 其中小車輪蟲屬因其個體微小且同一物種的不同種群之間齒體差異較大而頗受爭議。

眉溪小車輪蟲Trichodinella myakkae(Mueller,1937) ?rámek-Hu?ek, 1953隸屬于小車輪蟲屬, 由Mueller于1937年在美國佛羅里達州的大口黑鱸Aplites salmoides上首次檢獲并描述[7—9], 后在小口牛胭脂魚Ictiobus bubalus和草魚Ctenopharyngodonidellus等宿主上均有發(fā)現(xiàn)[10,11], 但迄今均未見任何可供參考的附著盤銀染資料 (車輪蟲形態(tài)學物種鑒定的重要依據(jù)); 由于常與其他車輪蟲混合感染宿主魚, 且形態(tài)量度也難以與小車輪蟲屬其他物種相區(qū)分, 故難以對其進行種類鑒定。眉溪小車輪蟲與周叢小車輪蟲Trichodinella epizootica(Raabe, 1950)?rámek-Hu?ek, 1953和纖細小車輪蟲Trichodinella subtili(Lom, 1959) Lom & Haldar, 1977形態(tài)相似,有研究認為眉溪小車輪蟲是周叢小車輪蟲或纖細小車輪蟲的同物異名[11—13]。隨著分子技術在車輪蟲領域的應用, 車輪蟲的研究得到進一步發(fā)展。2006年Gong等[14]提交了眉溪小車輪蟲的18S rDNA序列 (AY102176), 但由于未提供分子數(shù)據(jù)對應的原始銀染標本, 該序列的有效性仍有待進一步核實[15,16]。為此, 本文基于新獲得的寄生于多種宿主的小車輪蟲形態(tài)學和分子數(shù)據(jù), 描述了眉溪小車輪蟲的形態(tài)和分子特征, 并進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 材料與方法

1.1 采集與鑒定

宿主魚鰱Hypophthalmichthys molitrix和鳙Aristichthys nobilis于2019年6月采自重慶江津區(qū)同一養(yǎng)殖漁場 (29°18′N, 106°16′E), 宿主魚麥穗魚Pseudorasbora parva于2019年8月采自重慶沙坪壩區(qū)(29°52′N, 106°44′E), 且上述宿主魚均處于幼魚期(體長約8—13 cm)?；铙w宿主魚帶回實驗室解剖后, 使用體視顯微鏡 (NIKON SMZ1500) 進行車輪蟲的活體觀察, 并進行鰓涂片, 待自然空干后采用修訂版干銀法對鰓組織涂片進行附著盤的形態(tài)學染色[17]。利用全自動光學顯微鏡 (LEICA DM6000B)進行車輪蟲附著盤的顯微照片拍攝。采用“統(tǒng)一特定方法”對所獲車輪蟲樣本進行形態(tài)學數(shù)據(jù)的測量與統(tǒng)計[18]。齒體定位線條圖利用軟件CorelDRAW X8繪圖完成。根據(jù)Van As和Basson提出, 唐發(fā)輝等[19,20]完善的方法進行齒體特征的描述。

1.2 主成分分析

使用PAST 3軟件對眉溪小車輪蟲各株系蟲體直徑、附著盤直徑、緣膜寬、齒環(huán)直徑、齒體縱長、齒長、齒鉤長、齒錐寬、齒棘長、輻線數(shù)及齒體數(shù)11項形態(tài)學特征進行主成分分析 (PCA), 利用變異協(xié)方差矩陣生成置信度為95.0%的散點圖。

1.3 DNA提取、擴增與測序

在光學顯微鏡下使用玻璃微吸管吸取單只車輪蟲, 無菌水洗滌純化后采用試劑盒提取DNA(REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit), -20℃凍存。PCR體系: 2×TaqPCR預混液 (2×TaqMaster Mix, Novoprotein, E005-02B) 6.25 μL, 引物各0.5 μL,模板DNA 2 μL, 超純水補足至25 μL體系。PCR反應程序為94℃預變性1min 30s; 94℃變性20s, 56℃退火20s, 72℃延伸2min, 35個循環(huán); 72℃再延伸5min。18S rDNA的擴增引物為: 82F (5′-GAAACTG GGAATGGCTC-3′) 和LSUR (5′-GTTAGTTTCTT TTCCTCCGC-3′)[21]; ITS-5.8S rDNA的擴增引物為:ERIB10-V (5′-CCGTAGGTGAACCTGCGGAAG-3′) 和28S1R (5′-GTGTTTCAAGACGGGTCG-3′)[22]。擴增產(chǎn)物直接送至英濰捷基生物科技有限公司進行測序。

1.4 分子特征分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列的同源性比對;應用DAMBE7.2.136軟件分析堿基替代飽和性; 采用MEGA6.0進行遺傳距離 (K-2-P模型)的計算及序列變異位點的分析; 使用BioEdit7.0.5.3進行18S rDNA的GC含量計算; 18S rRNA二級結構的預測基于RNA structure5.2完成, 所有參數(shù)均設置為默認,選取自由能最低的模型并利用RNAViz2.0參照European Ribosomal RNA Database手動調(diào)整完成[23]。

1.5 系統(tǒng)進化分析

共選取63條序列使用BI (Bayesian Inference)及ML (Maximum Likelihood) 構建18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹, 序列包括眉溪小車輪蟲三株系共5條18S rDNA序列, 及在GenBank數(shù)據(jù)庫中選取的同源性較高的分子序列, 其余序列參照文獻[24]進行選取,外群選取大腎形蟲Colpoda magna(EU039896)與毛板殼蟲Coleps hirtus(AM292311)。采用GTR+I+G模型在MrBayes3.1.2軟件中構建BI樹, 運行300萬代, 每200代抽樣1次, 舍棄前25.0%樣本。通過在線工具The CIPRES Science Gateway V.3.3 (http://www.phylo.org/), 在RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.12) 下構建ML樹[25,26], 使用GTR+G模型進行1000次自舉(Bootstrap) 重復檢測。利用FigTree v1.4.2顯示系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構, 使用Photoshop CS3美化樹圖。同理, 在GenBank數(shù)據(jù)庫中選取鰱、鳙、草魚及麥穗魚線粒體16S rDNA序列各2條, 以奇額墨頭魚Garra mirofrontis(GU168764) 為外群構建宿主魚的BI樹。

2 結果

2.1 形態(tài)學描述

株系1: 眉溪小車輪蟲Trichodinella myakkae(HM; 圖 1A和表 1)

圖1 眉溪小車輪蟲附著盤的銀染顯微結構圖及齒體定位圖 (本研究)Fig. 1 Photomicrographs of silver impregnated specimen and denticle diagrammatic drawings of T. myakkae

采集地: 重慶江津區(qū)

采集時間: 2019年6月

宿主及寄生部位: 鰱; 鰓表

感染率: 100% (15/15)

感染強度: 中度 (車輪蟲感染強度的劃分標準:光學顯微鏡下放大10×10倍后1個視野內(nèi)平均蟲體數(shù)為0—5為輕度; 蟲體數(shù)5—10為中度; 蟲體數(shù)＞10為重度, 后同)。

形態(tài)學描述 (n=13): 該種蟲體小型, 蟲體直徑(19.8±1.1) μm (17.2—21.9 μm), 附著盤直徑(16.5±1.2) μm (14.5—18.1 μm), 齒環(huán)直徑(8.1±0.6) μm(7.3—9.9 μm), 緣膜寬(1.8±0.5) μm (1.2—2.9 μm)。染色后附著盤齒體形態(tài)清晰, 無明顯的中央顆粒;齒鉤部分發(fā)達, 略成長方形, 齒鉤長(3.4±0.3) μm(2.9—3.9 μm); 齒鉤前緣超過Y+1軸, 前后緣稍彎曲, 多數(shù)齒鉤外切緣略高于鈍圓的骨突, 存在鉤突且鉤突較為發(fā)達, 無明顯后突起, 齒鉤連接纖細; 齒錐較發(fā)達, 齒錐寬(0.8±0.2) μm (0.4—1.1 μm), 齒錐頂點鈍圓略超Y軸; 齒棘短且纖細, 齒棘長(1.0±0.3) μm(0.7—1.5 μm), 齒棘后傾斜不及Y軸與Y-1軸距離的一半, 無明顯棘突; 口圍繞度190°—210°。

株系2: 眉溪小車輪蟲Trichodinella myakkae(AN; 圖 1B和表 1)

表1 眉溪小車輪蟲三株系、纖細小車輪蟲及周叢小車輪蟲形態(tài)學特征統(tǒng)計 (測量單位: μm)Tab. 1 Morphological characteristics of three strains of T. myakkae, T. subtilis and T. epizootica (measurement unit: μm)

采集地: 重慶江津區(qū)

采集時間: 2019年6月

宿主及寄生部位: 鳙; 鰓表

感染率: 100% (18/18)

感染強度: 中度

形態(tài)學描述 (n=15): 小型淡水車輪蟲, 齒體形態(tài)與T. myakkae(HM) 株系相比, 本株系齒鉤外切緣不圓滑, 這可能與染色時間相關, 但多數(shù)仍高于骨突; 齒鉤前后緣平滑, 鉤突顯著且略為尖銳, 無明顯后突起, 鉤突與上個齒體形成的凹口嵌合較為緊密。形態(tài)學測量數(shù)據(jù)詳見表 1。

株系3: 眉溪小車輪蟲Trichodinella myakkae(PP; 圖 1C和表 1)

采集地: 重慶沙坪壩區(qū)

采集時間: 2019年8月

宿主及寄生部位: 麥穗魚; 鰓表

感染率: 38.4% (4/11)

感染強度: 輕度

形態(tài)學描述 (n=15): 蟲體小型與其他株系相比, 本株系齒鉤更為發(fā)達, 整個齒鉤幾近填滿Y軸與Y+1軸間的空間; 該種具有較為光滑的齒鉤前后緣,且其齒鉤外切緣向上凸, 高于鈍圓骨突; 齒鉤連接較其他株系更為纖細, 鉤突更為發(fā)達, 鉤突向前與上個齒體形成的凹口嵌合疏松, 齒棘短但并不尖銳。形態(tài)學測量數(shù)據(jù)詳見表 1。

2.2 眉溪小車輪蟲三株系的主成分分析

主成分分析結果顯示本研究獲得的眉溪小車輪蟲3個株系的形態(tài)學特征 (蟲體直徑、附著盤直徑、緣膜寬、齒環(huán)直徑、齒體縱長、齒長、齒鉤長、齒錐寬、齒棘長、輻線數(shù)及齒體數(shù)) 構建的散點圖高度重疊 (圖 2)。

圖2 眉溪小車輪蟲三株系形態(tài)特征主成分分析Fig. 2 Principal component analysis of morphometric data of three strains of T. myakkae

2.3 18S rDNA與ITS-5.8S rDNA分子特征

本研究已測定并提交于GenBank的眉溪小車輪蟲相關DNA序列信息詳見表 2。眉溪小車輪蟲3個株系均與T. myakkae(AY102176) 最相似 (相似度≥99.0%)。18S rDNA序列相似度及遺傳距離顯示, 3個株系間的序列相似度為99.2%—100%, 遺傳距離為0.000—0.003。其中,T. myakkae(HM)與T.myakkae(AY102176) 之間序列相似度為99.6%, 遺傳距離為0.003;T. myakkae (AN)與T. myakkae(AY102176) 之間序列相似度為99.6%, 遺傳距離為0.003;T. myakkae(PP)與T. myakkae(AY102176) 之間序列相似度為99.6%, 遺傳距離為0.004。眉溪小車輪蟲各序列與T. epizootica(GU906246)的序列相似度為96.7%—97.7%, 遺傳距離為0.017—0.021。GC含量顯示本研究所獲3株系及T. myakkae(AY 102176) 為50.8%—51.2%。

表2 眉溪小車輪蟲三株系18S rDNA和ITS-5.8S rDNA序列登錄號Tab. 2 Accession numbers of 18S rDNA and ITS-5.8S rDNA sequences of three strains of T. myakkae

18S rDNA與ITS-5.8S rDNA變異位點顯示: 以T. myakkae(AY102176) 為參考序列,T. myakkae(HM)與T. myakkae(AN) 株系18S rDNA的相同變異位點共有7個, 且T. myakkae(HM) 在第34位也存在變異位點;T. myakkae(PP) 有7個變異位點。ITS-5.8S rDNA序列變異位點顯示, 以T. myakkae(HM)為參考序列,T. myakkae(AN) 無變異位點, 而T.myakkae(PP) 存在18個變異位點 (圖 3)。本研究所獲眉溪小車輪蟲3株系及T. myakkae(AY102176)的18S rDNA堿基組成頻數(shù)顯示平均轉換頻數(shù)為3, 顛換為1, 轉換高于顛換, 轉換率與顛換率之比R=2.28(＞2.0); 密碼子第1、2、3位點轉換及顛換頻數(shù)如表 3所示, 其中第2位點最為保守, 無堿基替換，故R值不可計算。18S rDNA基因堿基替換飽和曲線如圖 4所示, 轉換遺傳距離(S)大于顛換遺傳距離(V), 且其增加速度也大于后者; 轉換遺傳距離(S)整體呈線性上升趨勢, 而顛換遺傳距離(V)則趨于穩(wěn)定。各堿基替換飽和度情況顯示, 替換飽和指數(shù)ISS(Index of Substitution Saturation) 小于替換飽和指數(shù)臨界值ISS.c (the critical ISS value), 且P=0.0000 (差異極顯著)。

圖4 眉溪小車輪蟲18S rRNA堿基替換飽和曲線Fig. 4 Base substitution saturation curve of 18S rRNA sequence of T. myakkae

表3 眉溪小車輪蟲各株系18S rDNA堿基對數(shù)組成頻數(shù)Tab. 3 Base pairs composition frequency of T. myakkae based on 18S rDNA

圖3 眉溪小車輪蟲三株系ITS-5.8S rDNA序列變異位點比較Fig. 3 Comparison of variation sites among three strains of T. myakkae based on ITS-5.8S rDNA sequences

所獲眉溪小車輪蟲3株系及T. myakkae(AY102176)的4個高變區(qū) (V3、V4、V5和V7) 二級結構預測結果顯示: 4個株系在4個高變區(qū)二級結構構型相同,僅在V3、V4和V5區(qū)一級結構存在堿基差異;T.myakkae(HM)與T. epizootica(GU906246)的二級結構顯示: 眉溪小車輪蟲與周叢小車輪蟲在螺旋H17(V3區(qū)) 存在構型差異, 前者在螺旋H17僅有一個側凸和大發(fā)卡環(huán), 而周叢小車輪蟲具有兩個側凸和小發(fā)卡環(huán) (圖 5)。

圖5 眉溪小車輪蟲 (HM)與周叢小車輪蟲 (GU906246) 18S rRNA二級結構 H17區(qū)比較Fig. 5 Comparison of H17 regions for T. myakkae (HM) and T.epizootica (GU906246) based on 18S rRNA secondary structure

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于18S rDNA構建的ML和BI樹呈現(xiàn)出一致的拓撲結構 (本文只呈現(xiàn)BI樹, 圖 6A)。本研究的3個株系與T. myakkae(AY102176) 聚為一枝 (Clade A), 且位于系統(tǒng)發(fā)育樹的頂部, 具有高支持率。Clade A中, 宿主為鰱的T. myakkae(HM1) 和T.myakkae(HM2) 及宿主為鳙的T. myakkae(AN1) 和T. myakkae(AN2) 分別聚枝后再形成姐妹枝, 后與宿主為草魚的T. myakkae(AY102176) 聚枝后再與宿主為麥穗魚的T. myakkae(PP) 聚枝。Clade A與小車輪蟲未定種Trichodinellasp. (JQ663869) 聚為一枝后再與由周叢小車輪蟲構成的支系Clade B互為姐妹枝, 并具有高支持率?；诰€粒體16S rDNA構建的具有高支持率的魚類系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, 鰱枝、鳙枝先聚為一小枝后再與草魚枝互為姐妹枝,最后再與麥穗魚枝聚枝(圖 6B)。

圖6 基于BI法與ML法構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Molecular phylogenetic tree constructed by BI and ML method

3 討論

3.1 眉溪小車輪蟲的種類鑒定及與近緣種的比較

口圍繞度為車輪蟲口面區(qū)口圍帶盤繞程度, 是車輪蟲科中屬間分類的重要依據(jù), 本研究所獲蟲種口圍繞度落入了小車輪蟲屬180°—270°的范圍[27—29];附著盤銀染標本顯示該種具有小車輪蟲屬較直的齒鉤、纖細的齒錐和短小的齒棘等典型特征[28,30];遺傳距離和序列相似度顯示: 本物種與周叢小車輪蟲屬于種間水平; GC含量均超過50.0%, 符合Tang和Zhao[31]所總結的小車輪蟲屬GC含量區(qū)間; 基于18S rDNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹同樣顯示: 本研究所獲物種與周叢小車輪蟲及小車輪蟲未定種聚為小車輪蟲枝系。綜合上述形態(tài)學、分子特征及系統(tǒng)發(fā)育分析表明本研究所獲物種應隸屬于小車輪蟲屬。Mueller[32]在1937年報道眉溪小車輪蟲時, 國際無統(tǒng)一的形態(tài)學描述方法, 因此原始株系描述并不完善且缺乏附著盤銀染圖, 但基于已有的原始形態(tài)學特征描述顯示: 本研究所獲物種除具有齒棘外,其輻線數(shù)、齒體數(shù)目和蟲體大小等鑒別性特征均與眉溪小車輪蟲原始株系一致, 且本研究物種齒鉤較直, 有明顯的突起等特征也與之相符[5]。綜上, 本研究所獲物種應為眉溪小車輪蟲, 并且本研究中的宿主魚——麥穗魚為眉溪小車輪蟲的宿主新記錄。

本研究所涉眉溪小車輪蟲,與近緣種周叢小車輪蟲、纖細小車輪蟲形態(tài)比較相似, 但眉溪小車輪蟲的蟲體直徑、附著盤直徑、齒環(huán)直徑、齒長和齒錐寬等形態(tài)特征均小于周叢小車輪蟲及纖細小車輪蟲, 且齒體數(shù)區(qū)間并不重合。結合齒體定位圖分析, 眉溪小車輪蟲纖細較直的齒棘與周叢小車輪蟲彎鉤狀齒棘不同; 眉溪小車輪蟲僅具有1個前突起, 區(qū)別于纖細小車輪蟲具向前的2個突起 (鉤突與齒錐前突起) 這一鑒別性特征[33]; 同時, 眉溪小車輪蟲的口圍繞度 (190°—210°) 也大于纖細小車輪蟲(170°—190°) 及周叢小車輪蟲 (180°—190°)的口圍繞度[10,11,33,34], 故基于形態(tài)學分析表明: 眉溪小車輪蟲與周叢小車輪蟲及纖細小車輪蟲應為不同物種。18S rDNA構建的系統(tǒng)樹顯示, 眉溪小車輪蟲與周叢小車輪蟲單獨聚枝, 且兩者二級結構在螺旋H17存在明顯的構型差異 (眉溪小車輪蟲僅有一個側凸并有大的發(fā)卡環(huán), 圖 5), 表明本研究所獲物種與周叢小車輪蟲具有種間水平的差異。

3.2 眉溪小車輪蟲的種內(nèi)分化及其與宿主的協(xié)同進化

形態(tài)學研究表明, 本研究中的眉溪小車輪蟲3個株系形態(tài)特征相似 (表 1), 附著盤齒體形態(tài)無明顯差異 (圖 1), 且主成分分析顯示3個株系形態(tài)學測量數(shù)據(jù)所形成的散點圖高度重疊 (圖 2), 綜合形態(tài)學與主成分分析結果表明眉溪小車輪蟲各株系均屬同種, 且無明顯表型分化。眉溪小車輪蟲各株系18S rDNA序列相似度為99.2%—100%, 遺傳距離為0.000—0.004。以往的研究表明, 18S rDNA不同分類群遺傳距離閾值種內(nèi)水平為0.000—0.005[31], 表明3株系在分子層面產(chǎn)生分化, 但屬于種內(nèi)水平。T. myakkae(HM)與T. myakkae(AN) 18S rDNA和ITS rDNA序列變異位點幾乎一致, 而T. myakkae(PP) 則產(chǎn)生了分子分化 (圖 3)。有研究認為DNA的堿基替換記載著物種進化的信息, 且轉換更易于飽和[35]。本研究顯示眉溪小車輪蟲各序列差異度與遺傳距離呈線性關系, 轉換大于顛換 (圖 4), 表明眉溪小車輪蟲各株系種間的進化潛能較大, 且受進化噪音的影響較小, 其轉換和顛換均具系統(tǒng)發(fā)育研究意義。結合DNA序列堿基組成及相關資料分析(表 3), 堿基發(fā)生轉換的可能易于顛換; 密碼子第2位點較為保守, 且不同位點的堿基替換率不同, 但多表現(xiàn)為同義突變, 推測這些同義突變受到的自然選擇壓力較小, 突變后容易固定[36—38]。眉溪小車輪蟲不同株系18S rRNA的二級結構構型一致, 進一步表明本研究所獲3株系均屬同種。

18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖 6): 宿主為鰱的T. myakkae(HM) 枝與宿主為鳙的T. myakkae(AN) 枝互為姐妹枝, 再依次與宿主為草魚的T.myakkae(AY102176) 及宿主為麥穗魚的T. myakkae(PP) 聚枝, 再次支持其為同種。各株系的宿主均屬鯉科魚類, 其中鰱和鳙隸屬于鰱亞科Hypophthalmichthyinae, 草魚隸屬于雅羅魚亞科Leuciscinae, 麥穗魚隸屬于亞科Gobioninae, 且基于線粒體16S rDNA構建的宿主魚系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖 6B): 鰱亞科的鰱和鳙與雅羅魚亞科的草魚有較近的親緣關系,亞科的麥穗魚則與鰱亞科和雅羅魚亞科較遠,與已有研究結果一致[39,40]。本研究所揭示的眉溪小車輪蟲的系統(tǒng)發(fā)育關系顯示其與宿主魚具有相同的進化趨勢, 表明二者之間可能存在共物種形成的協(xié)同進化關系, 故在一定程度上宿主也可能成為影響眉溪小車輪蟲演化的重要因素。但受限于本研究眉溪小車輪蟲樣本量較少, 且涉及宿主魚多樣性較為局限, 因此來自更多宿主的相關數(shù)據(jù)的獲取可能更有利于厘清其中的自然關系。

基于上述分析結果,T. myakkae(HM、AN)與T. myakkae(AY102176) 株系差異較小, 而T. myakkae(PP)與其他株系已經(jīng)出現(xiàn)差異, 但綜合形態(tài)學特征、DNA序列分子特征 (序列相似度、遺傳距離、變異位點及二級結構) 和分子系統(tǒng)發(fā)育分析的結果, 此類分化應屬于種內(nèi)水平, 推測部分眉溪小車輪蟲在適應其不同宿主內(nèi)的寄生生活過程中, 可能由于基因交流的減少而產(chǎn)生了種內(nèi)多樣性。系統(tǒng)發(fā)育分析還顯示了眉溪小車輪蟲與其宿主可能存在協(xié)同進化關系。