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低DCAD對(duì)經(jīng)EDTA誘導(dǎo)的低血鈣山羊的鈣調(diào)因子水平及瘤胃發(fā)酵的影響

2021-12-24 01:47馬政發(fā)楊春紅吳文旋吳佳海
飼料工業(yè) 2021年21期
關(guān)鍵詞:血鈣飼糧瘤胃

■馬政發(fā) 楊春紅 許 可 吳文旋,2* 吳佳海

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究所,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院,貴州省山地畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550025;3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所,貴州貴陽(yáng) 550006)

低血鈣癥臨床表現(xiàn)為血鈣濃度低于8 mg/dL,是常發(fā)生在圍產(chǎn)期乳畜的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病,低血鈣容易誘發(fā)酮病、乳房炎、產(chǎn)后癱瘓等多種疾病,影響圍產(chǎn)乳畜的生長(zhǎng)健康和生產(chǎn)性能。實(shí)際生產(chǎn)中防治低血鈣的方法,如圍產(chǎn)前期補(bǔ)充維生素D 和甲狀旁腺激素、產(chǎn)犢時(shí)使用CaCl2等補(bǔ)鈣制劑或產(chǎn)前飼喂低鈣飼糧等,存在諸多困難而不再使用。飼糧陰陽(yáng)離子差(di?etary cation-anion difference, DCAD)具有操作簡(jiǎn)單和實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),是當(dāng)前生產(chǎn)中防治低血鈣最有效的措施。DCAD 是指每千克飼糧干物質(zhì)中主要陽(yáng)離子(Na+、K+)和陰離子(Cl-、S2-)之間毫摩爾數(shù)的差值,低DCAD 可誘導(dǎo)機(jī)體酸化產(chǎn)生酸中毒,促進(jìn)骨鈣動(dòng)員、小腸鈣吸收以及腎鈣重吸收,有效維持體內(nèi)血鈣穩(wěn)恒,提高血鈣濃度。

乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)是一種絡(luò)合劑,能與Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+等金屬離子結(jié)合而消除相應(yīng)離子的功效。EDTA 可被研究用于礦物質(zhì)代謝來(lái)誘導(dǎo)低血鈣狀態(tài),從而建立試驗(yàn)動(dòng)物生理和體液的生物模型。研究指出,通過(guò)靜脈注射Na2EDTA 可成功誘發(fā)低血鈣。以上研究為將EDTA 和低DCAD 聯(lián)合使用提高血鈣水平防治低血鈣提供了有益的借鑒,但目前鮮見相關(guān)研究報(bào)道。據(jù)此,本試驗(yàn)通過(guò)在飼糧中添加EDTA人工降低血鈣含量建立低血鈣模型后,再飼喂低DCAD 飼糧,研究血鈣水平恢復(fù)、鈣調(diào)蛋白因子以及瘤胃發(fā)酵參數(shù)的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用年齡(2.5±0.2)年、體重(43.6±2.2)kg差異不顯著的6 只黔北麻羊母羊(貴州地方品種山羊)為試驗(yàn)動(dòng)物,隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組和處理組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1只羊,開展三個(gè)階段的試驗(yàn),每個(gè)階段持續(xù)20 d。第一階段為適應(yīng)期,用于觀察試羊健康狀況,更換籠位、驅(qū)蟲、消毒管理并觀察試羊?qū)︼暭Z的適應(yīng)性。第二階段為EDTA處理期,在試羊飼糧中添加2%的EDTA誘發(fā)低血鈣。第三階段為DCAD處理期,分別飼喂對(duì)照組(DCAD=203 mmol/kg DM)和處理組(DCAD=-170 mmol/kg DM)飼糧,然后采樣。其中處理組飼糧在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加45 g/d 的陰離子鹽(MgSO4·7H2O+MgCl2·6H2O),3 個(gè)階段試驗(yàn)羊飼糧結(jié)構(gòu)一致,其飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 山羊飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊單籠舍飼,試驗(yàn)開始前驅(qū)蟲,每天8:00、12:00、18:00飼喂3次,保證試羊自由采食、自由飲水。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 采食量

連續(xù)測(cè)定試驗(yàn)最后5 d 采食量。測(cè)定方法為:晨飼前清理食槽,準(zhǔn)確記錄飼喂量和次日剩料量,計(jì)算干物質(zhì)采食量(DMI)。

1.3.2 尿液pH

自第三階段開始,每天在試驗(yàn)羊采食2 h 后測(cè)定尿液pH,判斷低DCAD 飼糧是否引起山羊體內(nèi)酸化。檢測(cè)方法:使用pH精密試紙(pH范圍為5.4~7.0,6.4~8.0,上海試劑三廠)蘸取試驗(yàn)羊所排的新鮮尿液,在試紙顯示顏色3 s后與精密比色卡比對(duì)觀察。

1.3.3 血鈣水平

血樣采集分3步進(jìn)行,用抗凝血管經(jīng)頸靜脈采血10 mL,4 000 r/min 離心15 min(80-2 型離心沉淀機(jī);江蘇中大儀器科技有限公司),收集血漿,用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定血漿中Ca2+水平。采樣方法為,在第一階段,連續(xù)3 d 采血檢測(cè),確保血漿Ca2+水平均處于正常范圍內(nèi)(8~12 mg/dL);在第二階段,EDTA 處理后,每3 d采血測(cè)定使其處于下降狀態(tài),直至發(fā)生低血鈣(<8 mg/dL);在第三階段,DCAD 處理后,每3 d 采血測(cè)定,直至血漿Ca2+含量最終正常。

1.3.4 血鈣代謝因子

在第三階段最后1 d,用抗凝血管經(jīng)頸靜脈采血10 mL,在4 000 r/min 條件下離心15 min(80-2 型離心沉淀機(jī);江蘇中大儀器科技有限公司),收集血漿,用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定血漿中甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)、瞬時(shí)受體電位通道香草酸受體6(transient receptor potential vanilloid receptor 6, TRPV6)、維生素D 受體(vitamin D receptor, VDR)、鈉鈣交換體1(Na+/Ca2+exchanger 1, NCX1)、細(xì)胞膜鈣泵(plasma membrane Ca-ATPase 1b, PMCA1b)水平。

1.3.5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

第三階段試驗(yàn)結(jié)束后,在晨飼前用瘤胃液采集器經(jīng)口腔插入采集山羊的瘤胃液,測(cè)定瘤胃pH(FG2-ELK,梅特勒-托利多儀器),4 層紗布過(guò)濾后離心20 min(12 000 r/min),取上清液測(cè)定氨態(tài)氮(ammonia nitrogen, NH3-N)、揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)。其中NH3-N 濃度參照王加啟的方法測(cè)定;VFA 參照尹召華等的方法測(cè)定,利用氣相色譜儀(GC-9A,日本島津)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,試驗(yàn)結(jié)果以“平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示,P<0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低DCAD飼糧對(duì)山羊DMI的影響(見表2)

表2 低DCAD飼糧對(duì)山羊DMI的影響

由表2 可知,處理組DMI 略低于對(duì)照組,兩組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 低DCAD飼糧對(duì)山羊尿液pH的影響(見表3)

表3 低DCAD飼糧對(duì)山羊尿液pH的影響

在第三階段,對(duì)照組山羊尿液pH 在整個(gè)試驗(yàn)期均保持穩(wěn)定,處于7.7~8.0 之間(pH=7.9±0.1);處理組山羊采食低DCAD 水平飼糧后尿液pH 值下降(pH=6.5±0.7),顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 低DCAD 飼糧對(duì)山羊血漿鈣及鈣調(diào)節(jié)因子的影響(見表4)

表4 低DCAD飼糧對(duì)山羊血漿鈣及鈣調(diào)節(jié)因子的影響

由表4 可見,在第三階段處理組血漿Ca2+、VDR、TRPV6 和PMCA1b 顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。處理組PTH、NCX1 水平均略高于對(duì)照組,但無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 低DCAD飼糧對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵的影響(見表5)

表5 低DCAD飼糧對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵的影響

由表5 可知,與對(duì)照組相比,處理組丙酸濃度顯著升高(P<0.05)。兩組其余指標(biāo)(瘤胃pH、NH3-N 濃度、TVFA)差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 低DCAD飼糧對(duì)山羊干物質(zhì)采食量的影響

干物質(zhì)采食量(DMI)反映飼料適口性的好與壞,影響著動(dòng)物的生長(zhǎng)、泌乳及繁殖性能,許多研究均表明低DCAD 飼糧會(huì)引起動(dòng)物DMI 下降。一方面是由于降低DCAD 水平所添加的陰離子鹽帶有苦澀味,會(huì)影響飼糧適口性,DMI 也隨之降低。另一方面是因?yàn)榈虳CAD 會(huì)引起血液酸堿度和碳酸氫鹽水平降低,減弱瘤胃的緩沖能力;同時(shí)胃腸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感覺神經(jīng)元中酸敏感離子通道可能會(huì)感應(yīng)到低DCAD 的質(zhì)子負(fù)荷變化,從而改變神經(jīng)元的興奮性狀態(tài),共同影響著動(dòng)物的采食行為與食欲。本試驗(yàn)在DCAD 處理期開始時(shí),也觀察到DMI 下降的現(xiàn)象,但隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng),處理組山羊逐漸恢復(fù)正常采食,表明飼喂低DCAD 飼糧所導(dǎo)致的機(jī)體酸堿平衡狀態(tài)改變并不是影響山羊DMI 的最主要因素,這得到朱倫琴等、于磊等研究結(jié)果的支持。同時(shí)本試驗(yàn)所飼喂的飼糧為顆粒飼料,一定程度上掩蓋了陰離子鹽的苦澀味,提高了飼糧的可食用性。結(jié)合前期研究結(jié)果,說(shuō)明飼喂顆?;暭Z可改善陰離子鹽的適口性來(lái)防止DMI 的下降。

3.2 低DCAD飼糧對(duì)山羊尿液pH的影響

尿液pH 是評(píng)估陰離子鹽飼糧引起機(jī)體代謝性酸中毒程度的關(guān)鍵指標(biāo),其變化范圍可以衡量血鈣水平的恒穩(wěn)狀態(tài),常用來(lái)反映飼糧的DCAD 水平是否適宜。尿液pH 的改變是由于機(jī)體攝入陰離子Cl-、S2-后,導(dǎo)致Cl-、S2-在血液中的水平升高,為維持溶液的電中性,機(jī)體則通過(guò)增加尿液中的H+來(lái)排泄出多余的Cl-、S2-,最終尿液pH 呈現(xiàn)出降低的現(xiàn)象。一般而言,尿液pH 維持在5.5~6.8 比較合適,當(dāng)尿液pH 低于5.5 時(shí)會(huì)引起機(jī)體過(guò)度酸化以及代謝性酸中毒作用的問(wèn)題,對(duì)動(dòng)物造成損傷的同時(shí)并沒有額外的收益;然而當(dāng)尿液pH 大于6.8時(shí)機(jī)體的酸化并不充分,PTH 對(duì)鈣調(diào)因子的作用較弱,對(duì)改善血鈣穩(wěn)衡以及防治低血鈣意義不大。本試驗(yàn)的尿液pH 受DCAD 的改變而下降,但仍處于合理范圍之內(nèi)(pH=6.5±0.7),充分表明DCAD 與尿液pH 之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性,與相關(guān)研究結(jié)論類似。

3.3 低DCAD 飼糧對(duì)山羊血鈣及其相關(guān)代謝指標(biāo)的影響

鈣是動(dòng)物必需的重要元素,參與神經(jīng)元活動(dòng)、調(diào)節(jié)酶活、血液凝集、激素合成分泌等機(jī)體各種生理代謝過(guò)程。機(jī)體可通過(guò)胃腸道對(duì)鈣吸收、骨鈣溶解和腎重吸收鈣來(lái)使血鈣水平維持在一定范圍內(nèi),靜脈注射EDTA可以影響腸道和骨骼中鈣的吸收以及免疫抑制的變化,在誘導(dǎo)低血鈣癥上已有許多研究。與其他研究不同的是,本試驗(yàn)采用直接飼喂EDTA的方式來(lái)與體內(nèi)的鈣絡(luò)合達(dá)到降低血鈣含量的目的,山羊血鈣水平在進(jìn)入第三階段前已低于8 mg/dL,處于低血鈣狀態(tài)。此后飼喂對(duì)照組和處理組飼糧,處理組血鈣水平顯著高于對(duì)照組,結(jié)合處理組尿液pH 值顯著降低,說(shuō)明含陰離子鹽的低DCAD 飼糧可誘發(fā)機(jī)體輕度代謝性酸中毒,促進(jìn)飼料鈣在小腸的吸收,同時(shí)還可以促進(jìn)骨鈣動(dòng)員,進(jìn)而加快血鈣水平的恢復(fù)速度。Goff等前期研究結(jié)果也表明,飼喂低DCAD 飼糧可提高血鈣水平。

骨鈣溶解需以胃腸道鈣吸收量不足為前提,才能釋放骨鈣進(jìn)入血液,提高血鈣水平。由于尿鈣濃度很低,腎重吸收鈣對(duì)維持血鈣水平的貢獻(xiàn)十分有限,不是提高血鈣水平的主要因素。因此,增強(qiáng)胃腸道對(duì)鈣的吸收能力是實(shí)現(xiàn)血鈣水平提高的最佳方式。鈣在胃腸道的吸收包括細(xì)胞旁路被動(dòng)擴(kuò)散入血和跨上皮細(xì)胞刷狀緣部主動(dòng)吸收兩種方式,其中以主動(dòng)跨膜吸收為主。Ca2+跨膜途徑受多種因子的協(xié)同調(diào)控,吸收過(guò)程分3 步進(jìn)行:①首先由位于細(xì)胞膜上對(duì)Ca2+有高度選擇性的特異轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白TRPV6 轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞;②在細(xì)胞內(nèi)與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞基膜;③跨細(xì)胞膜排出入血,這一步驟由PMCA1b 和NCX1 發(fā)揮作用。此外PTH 能促進(jìn)機(jī)體合成與分泌Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2VD3],VDR 則通過(guò)與1,25-(OH)2VD3結(jié)合促進(jìn)胃腸道上皮細(xì)胞形成鈣結(jié)合蛋白,二者在Ca2+的吸收過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。綜合來(lái)看,PTH、VDR、TRPV6、PMCA1b、NCX1 等因子水平是影響胃腸道鈣吸收效率的關(guān)鍵因素。前期報(bào)道發(fā)現(xiàn),低DCAD 飼糧可提高PTH、TRPV6、VDR 的水平,這是因?yàn)榈虳CAD 破壞機(jī)體的酸堿平衡,代謝性酸中毒提高了組織對(duì)鈣調(diào)節(jié)激素的響應(yīng)能力,刺激甲狀旁腺主細(xì)胞對(duì)PTH 的分泌,1,25-(OH)2VD3的合成也隨之增加;同時(shí)它們的提高能激活磷脂肌醇信號(hào)系統(tǒng)(protein kinase system, PKC system)誘導(dǎo)β-葡萄糖苷酸酶的釋放,進(jìn)而刺激TRPV6 的生成。此外低DCAD 所誘導(dǎo)的酸化作用還會(huì)上調(diào)VDR mRNA 的表達(dá),促進(jìn)VDR 與1,25-(OH)2VD3相結(jié)合,增進(jìn)鈣的吸收。本試驗(yàn)與對(duì)照組相比,低DCAD飼糧組的PTH、VDR、TRPV6 都出現(xiàn)上升的趨勢(shì),其中VDR、TRPV6 達(dá)到顯著差異水平,這與相關(guān)研究一致。在Ca2+吸收過(guò)程中,PMCA1b 依賴ATP 以電化學(xué)梯度的形式將Ca2+排出細(xì)胞外;而NCX1 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則依靠介導(dǎo)Na+內(nèi)流、Ca2+外排和作用相反的兩種轉(zhuǎn)運(yùn)模式來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,低DCAD 飼糧可提高PMCA1b 和NCX1 的水平,提高鈣的吸收效率。

綜上,飼喂低DCAD飼糧能提高血鈣水平的恢復(fù)速率,上調(diào)鈣調(diào)控因子水平,加強(qiáng)胃腸道吸收鈣入血過(guò)程的化學(xué)反應(yīng)。

3.4 低DCAD飼糧對(duì)山羊瘤胃發(fā)酵的影響

反芻動(dòng)物的瘤胃pH、NH3-N 和VFA 是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵狀態(tài)和正常功能的首要指標(biāo),反映出瘤胃微生物對(duì)飼料養(yǎng)分的消化吸收情況。瘤胃pH 的大小表明瘤胃是否處于健康狀態(tài),與瘤胃微生物對(duì)纖維素的消化程度直接相關(guān)。莘海亮等通過(guò)對(duì)山羊飼喂不同DCAD 水平飼糧,發(fā)現(xiàn)低DCAD 飼糧組的瘤胃pH與高DCAD 飼糧組相比差異不顯著。這與本試驗(yàn)結(jié)果類似,也得到其他報(bào)道的支持。以上研究充分說(shuō)明了,飼喂含陰離子鹽飼糧并不會(huì)引起瘤胃酸堿度的明顯改變,不會(huì)對(duì)瘤胃pH 產(chǎn)生明顯影響。瘤胃內(nèi)含氮物的代謝主要是能利用飼料的蛋白質(zhì)和非蛋白氮,同時(shí)合成微生物蛋白供機(jī)體所用,常用瘤胃NH3-N 來(lái)衡量氮的代謝利用情況。Wang 等報(bào)道,DCAD 變化不會(huì)影響瘤胃pH、NH3-N 和TVFA 的摩爾百分比。本試驗(yàn)結(jié)果也表明,處理組瘤胃NH3-N 水平與對(duì)照組相比也未產(chǎn)生顯著差異。TVFA 主要包括乙酸、丙酸、丁酸等,是飼料碳水化合物(carbohy?drate, CHO)被瘤胃微生物降解的產(chǎn)物,在瘤胃壁吸收后氧化供能,主要受飼糧碳水化合物含量的影響。Nguyen 等最新研究表明,DCAD 水平變化不會(huì)影響奶山羊瘤胃TVFA、丙酸和乙酸/丙酸水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,處理組乙酸、丁酸、乙酸/丙酸、TVFA與對(duì)照組差異不顯著,但丙酸含量顯著高于對(duì)照組,其原因有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

山羊飼糧添加EDTA可降低血鈣水平,在此條件下飼喂低DCAD飼糧有利于血鈣水平的恢復(fù),且并不會(huì)影響瘤胃發(fā)酵。但有關(guān)EDTA 降低血鈣的分子機(jī)制、低DCAD飼糧對(duì)胃腸道組織鈣調(diào)因子表達(dá)水平及信號(hào)通路的影響尚待進(jìn)一步深入研究。

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