洪啟迪 董文江 梅麗寶 龍宇宙 胡榮鎖 初眾 王海茹

摘 ?要：綠咖啡油是一種富含生物活性成分的功能性油脂，貯藏過(guò)程中極易氧化酸敗影響產(chǎn)品品質(zhì)。本文以海南地區(qū)興隆咖啡為原料提取綠咖啡油，系統(tǒng)研究在60 ℃加速貯藏36 d內(nèi)氧化指標(biāo)、生物活性成分及表征氧化的光譜特征峰變化。結(jié)果表明：過(guò)氧化值、茴香胺值、硫代巴比妥酸、總氧化值初始值分別為0.97±0.04 meq/kg、4.19±0.14、55.08± 1.98 nmol/mL、8.05±0.06，經(jīng)過(guò)36 d的氧化分別顯著升高到28.56±0.15 meq/kg、19.19±0.13、102.38±2.18 nmol/mL、133.43± 0.45。本研究中共鑒定出11種脂肪酸，在綠咖啡油氧化過(guò)程中，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比值由1.14上升至1.49。利用高效液相色譜測(cè)定綠咖啡油中的二萜類物質(zhì)和生育酚，咖啡豆醇、咖啡醇的初始含量分別為21.01±0.31 mg/g、23.44±0.52 mg/g，在氧化24 d后升高至8.21±0.10 mg/g、8.99±0.02 mg/g，隨后含量趨于穩(wěn)定。共定性出α、δ和γ-生育酚，總生育酚含量由初始的49.75±0.88 mg/100 g在氧化18 d達(dá)到最大值53.70±1.72 mg/100 g，在氧化結(jié)束時(shí)降至34.58± 0.05 mg/100 g。利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）從特征官能團(tuán)的角度分析綠咖啡油的氧化過(guò)程，油脂在3008、2927、2854、1745、1461、1375、1238、1164、721 cm–1處有特征吸收峰。采用拉曼光譜技術(shù)表征綠咖啡油加速貯藏中的氧化變質(zhì)，在1000～1800 cm–1波段的峰強(qiáng)度有明顯減弱趨勢(shì)。本研究表明綠咖啡油在熱誘導(dǎo)下的貯藏過(guò)程中發(fā)生了明顯的氧化反應(yīng)，可為提升綠咖啡油貯藏穩(wěn)定性提供理論參考。

關(guān)鍵詞：綠咖啡油;油脂氧化;傅里葉變換紅外光譜;拉曼光譜

中圖分類號(hào)：TS221 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Green coffee oil is a kind of functional oil rich in biologically active ingredients， which is easily oxidized and rancid during storage and affects product quality. In this paper， green coffee oil was extracted from Xinglong coffee in Hainan area， and the changes in the oxidation index， biologically active components and spectral characteristic peaks

that characterize oxidation were systematically studied within 36 days of accelerated storage at 60 ℃. The results

showed that the initial values of peroxide value， anisidine value， thiobarbituric acid and total oxidation value was 0.97±0.04 meq/kg， 4.19±0.14， 55.08±1.98 nmol/mL， 8.05±0.06， respectively. After 36 days of oxidation， it significantly increased to 28.56±0.15 meq/kg， 19.19±0.13， 102.38±2.18 nmol/mL， and 133.43±0.45. A total of 11 fatty acids were identified in this study. During the oxidation of green coffee oil， the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids rose from 1.14 to 1.49. High performance liquid chromatography was used to determine diterpenoids and toco-pherol in green coffee oil. The initial content of cafestol and kahweol was 21.01±0.31 mg/g and 23.44±0.52 mg/g， re-spectively， which increased to 8.21±0.10 mg/g and 8.99±0.02 mg/g after 24 days of oxidation， and then the content tended to be stable. This experiment qualified α， δ and γ-tocopherols. The content of total tocopherols increased from the initial 49.75±0.88 mg/100 g to a maximum value of 53.70±1.72 mg/100 g after 18 days of oxidation， and dropped to 34.58±0.05 mg/100 g at the end of oxidation. Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） was used to analyze the oxidation process of green coffee oil from the perspective of characteristic functional groups. The oil had characteristic absorption peaks at 3008， 2927， 2854， 1745， 1461， 1375， 1238， 1164 and 721 cm–1. Raman spectroscopy was used to characterize the oxidative deterioration of green coffee oil during accelerated storage， and the peak intensity in the 1000–1800 cm–1 band had a significant weakening trend. This study showed that the green coffee oil undergone a significant oxidation reaction during the thermally induced storage process， which can provide a theoretical reference for improving the storage stability of green coffee oil.

Keywords： green coffee oil; lipid oxidation; Fourier transform infrared spectroscopy; Raman spectroscopy

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.035

咖啡為世界三大飲料之一，主要生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。目前世界范圍內(nèi)有兩種被商業(yè)開發(fā)的品種：阿拉比卡咖啡和羅布斯塔咖啡[2]。2020年度世界咖啡產(chǎn)量比前一年增加700萬(wàn)袋（60 kg），達(dá)到1.755億袋。我國(guó)咖啡種植主要集中在云南、海南和四川等地，種植面積達(dá)12萬(wàn) hm2以上，2020年度產(chǎn)量已達(dá)到200萬(wàn)袋?？Х戎泻性S多活性物質(zhì)，咖啡醇和咖啡豆醇是兩種二萜，主要以脂肪酸酯的形式存在于綠咖啡油中，具有抗氧化、消炎和保護(hù)肝臟的作用[3]。生育酚是綠咖啡油中的抗氧化活性成分，可作為抗氧化劑抑制多不飽和脂肪酸的氧化，也有消炎作用[4]。

含有脂質(zhì)的食物在受熱、受光、受氧、受潮或受酶的作用下，可能會(huì)酸敗或變形，這可能會(huì)導(dǎo)致品質(zhì)下降，甚至可能產(chǎn)生毒物?？Х戎泻?0%～15%的脂質(zhì)，咖啡油主要由三酰甘油（75%）和脂肪酸（18%）組成，脂肪酸的組成與食用植物油相似[5]。目前關(guān)于咖啡油的研究較少，Cong等[6]研究了羅布斯塔咖啡在加速貯藏20 d過(guò)程中的脂質(zhì)氧化過(guò)程，評(píng)價(jià)了常規(guī)氧化指標(biāo)和脂肪酸組成，并預(yù)測(cè)綠咖啡豆的貨架期。Williamson等[7]利用核磁共振分析（NMR）結(jié)合核磁共振成像（MRI）研究烘焙對(duì)咖啡油的影響，其中二萜、氧化水解產(chǎn)物和不飽和脂肪酸是最明顯的標(biāo)志。除咖啡脂質(zhì)以外，有許多關(guān)于其他油脂氧化方面的研究。Tavakoli等[8]研究了杏仁油在加熱過(guò)程中的氧化穩(wěn)定性和化學(xué)組成，Wang等[9]研究了芫荽精油調(diào)味葵花油在加速貯藏24 d下的氧化穩(wěn)定性。綠咖啡油是一種具有潛在保健價(jià)值的新型油脂資源，具有包括抗氧化和癌癥預(yù)防活性在內(nèi)的生物學(xué)特性。由于綠咖啡油中多不飽和脂肪酸的含量較高，容易發(fā)生氧化變質(zhì)，不僅會(huì)產(chǎn)生惡臭，而且會(huì)因其降解產(chǎn)物而降低營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量和安全性，對(duì)人體健康產(chǎn)生有害影響。因此，了解綠咖啡油氧化過(guò)程中的氧化穩(wěn)定性和活性物質(zhì)至關(guān)重要。目前尚未有關(guān)于綠咖啡油氧化過(guò)程中質(zhì)量特性的文獻(xiàn)報(bào)道。

在油脂工業(yè)中，在常溫下進(jìn)行油脂儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘鎸?shí)反映油脂的氧化穩(wěn)定性，但是這種方法需要耗費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間，實(shí)際操作性差。Schaal烘箱法通過(guò)將油脂儲(chǔ)存于60 ℃的烘箱進(jìn)行加速氧化，間隔相同的時(shí)間測(cè)定過(guò)氧化值以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)油脂氧化程度[10]。檢測(cè)油脂品質(zhì)除常規(guī)分析方法如高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法之外，光譜技術(shù)可快速測(cè)定油脂品質(zhì)，其特點(diǎn)是對(duì)樣品的前處理少且操作簡(jiǎn)單[11]。史潤(rùn)鴿[12]對(duì)不同熱氧化時(shí)期的牡丹籽油進(jìn)行紅外光譜分析，觀察到脂肪酸成分在加熱前后有明顯變化。張勝來(lái)[13]分析了藻油、棕櫚仁油和橄欖油氧化過(guò)程中的拉曼峰變化情況。

本文采用Schaal烘箱法，將綠咖啡油于60 ℃條件下進(jìn)行氧化，測(cè)定其測(cè)定過(guò)氧化值（PV）、酸值（AV）、碘值（IV）、茴香胺值（P-AV）、總氧化值（TOTOX）、硫代巴比妥酸（TBARS）、游離脂肪酸（FFA）、共軛二烯（K232）和共軛三烯（K268）和脂肪酸組成。此外，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定二萜類物質(zhì)（咖啡醇、咖啡豆醇）和生育酚的含量，利用傅里葉紅外光譜和拉曼光譜對(duì)綠咖啡油氧化過(guò)程中的分子基團(tuán)信息進(jìn)行表征。采用主成分分析和相關(guān)性分析方法，以融合后的數(shù)據(jù)集為輸入變量，對(duì)綠咖啡油在氧化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)分布、差異分析和相關(guān)性進(jìn)行了研究，解析綠咖啡油加速貯藏氧化過(guò)程及活性成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為綠咖啡油貯藏穩(wěn)定性提升及制定阻控氧化策略提供理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?采用海南萬(wàn)寧地區(qū)的中粒種羅布斯塔‘熱研1號(hào)’品種的咖啡鮮果，采摘于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所咖啡試驗(yàn)基地，全紅果經(jīng)低溫?zé)岜酶稍铮?0 ℃）干燥后，脫殼、篩分得生咖啡豆。石油醚、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀、正己烷、三氟化硼甲醇均為分析純;甲基叔丁基醚、甲醇、正庚烷為色譜純，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;丙二醛（MDA）試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI有限公司;7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司;1290超高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司;E2695/W2475高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司;顯微共聚焦拉曼光譜儀，英國(guó)Renishaw公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?綠咖啡油提取 ?將生咖啡豆用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后準(zhǔn)確稱量100 g咖啡粉加入500 mL錐形瓶中，加入300 mL石油醚（沸程60～90 ℃），于55 ℃恒溫水浴振蕩器中提取1 h，濾布過(guò)濾，收集濾液。重復(fù)提取3次，合并濾液，濾紙過(guò)濾后使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑，收集綠咖啡油，并將其轉(zhuǎn)移至30 mL棕色玻璃瓶中，放置于–80 ℃超低溫冰箱冷藏備用。

1.2.2 ?綠咖啡油加速氧化 ?采用Schaal烘箱加速氧化法，將制備好的綠咖啡油分裝于30 mL棕色玻璃瓶中，每瓶20 g，封口后置于60 ℃恒溫烘箱貯藏，每隔6 d取樣檢測(cè)，取至36 d[14]。

1.2.3 ?脂質(zhì)氧化指標(biāo)測(cè)定 ?（1）參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定過(guò)氧化值（PV）（GB/T 5009.227—2016）、酸價(jià)（AV）（GB 5009.229—2016）、碘值（IV）（GB/T 5532—2008）、茴香胺值（P-AV）（GB/T 24304—2009）。

（2）游離脂肪酸（FFA）含量測(cè)定參考Nhouchi等[15]方法略作修改。準(zhǔn)確稱取1.00 g的綠咖啡油溶解于20 mL二氯甲烷/乙醇（1∶1，V/V）混合溶液中。滴加2～3滴酚酞作為指示劑，攪拌均勻，用0.1 mol/L氫氧化鉀溶液滴定至溶液呈粉紅色并持續(xù)30 s不褪色。游離脂肪酸含量表示為每克綠咖啡油中KOH的含量（mg/g）。

（3）硫代巴比妥酸（TBARS）采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的丙二醛（MDA）試劑盒測(cè)定。硫代巴比妥酸值表示為每毫升綠咖啡油中MDA的含量（nmol/mL）。

（4）總氧化值（TOTOX）由PV及P-AV計(jì)算，公式如下：

TOTOX=4PV+P-AV

其中PV為過(guò)氧化值，P-AV為對(duì)茴香胺值。

（5）共軛二烯（K232）和共軛三烯（K268）按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 22500—2008）測(cè)定。

1.2.4 ?脂肪酸組成測(cè)定 ?脂肪酸組成參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5009.168—2016）進(jìn)行分析。準(zhǔn)確稱量1.00 g綠咖啡油進(jìn)行脂肪皂化和脂肪酸甲酯化。利用安捷倫7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，配有CP-Sil 88色譜柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm）。升溫程序：初始溫度10 ℃保持13 min，以10 ℃/min增加到180 ℃保持6 min，以1 ℃/min增加到200 ℃保持20 min，然后以4 ℃/min增加到230 ℃保持10.5 min。接口溫度和離子源溫度均為250 ℃。氦氣為載氣，流量1 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

1.2.5 ?二萜類物質(zhì)（咖啡醇、咖啡豆醇）測(cè)定 ?參考Chartier等[16]方法并稍作修改。稱取0.1 g綠咖啡油，加入2 mL 2.5 mol/L氫氧化鉀的甲醇溶液，80 ℃水浴1 h進(jìn)行皂化反應(yīng)，冷卻后加入2 mL去離子水和2 mL甲基叔丁基醚提取不皂化物，混勻并收集上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入5 mL正己烷溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后，采用UPLC-DAD檢測(cè)。使用安捷倫1290超高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Zorbax Eclispe Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為甲醇和水，85%甲醇等梯度洗脫10 min，后運(yùn)行時(shí)間6 min。柱溫25 ℃，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。將咖啡醇、咖啡豆醇標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷配制成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用UPLC檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，含量以mg/g表示。

1.2.6 ?生育酚（α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚）測(cè)定 ?參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T 26635—2011）對(duì)綠咖啡油中生育酚含量進(jìn)行分析。將0.5 g綠咖啡油溶解在2 mL正己烷中，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜。使用沃特世E2695/W2475高效液相色譜儀，色譜柱為Agilent Zorbax Eclispe Plus C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇和水，體積比98∶2，流速為1 mL/min。采用UPLC-FLD檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為325 nm。將α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的保留時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)生育酚進(jìn)行定性和定量，含量以mg/100 g表示。

1.2.7 ?傅里葉變換紅外光譜分析 ?使用傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Fisher，美國(guó)）監(jiān)測(cè)分析綠咖啡油氧化過(guò)程中譜峰的變化趨勢(shì)。將干燥后的光譜純溴化鉀充分研磨后用壓片機(jī)壓成透明薄片，掃描后作為背景。用移液槍準(zhǔn)確移取0.5 μL綠咖啡油滴在溴化鉀壓片上，待形成一層均勻液膜后進(jìn)行掃描，測(cè)定掃描范圍為4000～400 cm–1，掃描次數(shù)為32次，分辨率為1 cm–1。利用OMNIC軟件對(duì)光譜進(jìn)行平滑和基線校正處理，光譜數(shù)據(jù)輸出格式為吸光度。

1.2.8 ?拉曼光譜分析 ?拉曼光譜作為新興的檢測(cè)油脂氧化的分析手段有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)，使用拉曼光譜對(duì)綠咖啡油氧化過(guò)程中分子結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。參考林新月等[17]方法并稍作修改，顯微共聚焦拉曼光譜儀（Renishaw，英國(guó)）選用785 nm的激光光源，物鏡使用5倍焦距鏡頭，準(zhǔn)確移取10 μL綠咖啡油滴在用錫箔紙包裹的載玻片上，將其置于顯微共聚焦拉曼光譜儀載物臺(tái)的物鏡視野下并找到合適的位置，調(diào)整焦距至清晰可見，設(shè)置掃描參數(shù)為光柵600 mm–1，積分時(shí)間為15 s，掃描次數(shù)為1次，掃描范圍設(shè)為200～3300 cm–1，掃描后對(duì)拉曼譜峰進(jìn)行基線扣除。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與計(jì)算;在SPSS 22.0軟件上采用Ducan’s法進(jìn)行一元方差方差分析（ANOVA）;使用Origin 2021軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析及主成分分析（PCA）。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?綠咖啡油氧化指標(biāo)分析

2.1.1 ?不同氧化時(shí)間對(duì)過(guò)氧化值、酸價(jià)、游離脂肪酸的影響 ?過(guò)氧化值（PV）用于通過(guò)測(cè)量油氧化降解形成的初級(jí)氧化產(chǎn)物（過(guò)氧化物）來(lái)確定油的質(zhì)量，決定了油的穩(wěn)定性。PV是綠咖啡油氧化酸敗的重要指標(biāo)，反映了初級(jí)水平的脂質(zhì)氧化程度。如圖1A所示，樣品的PV隨氧化時(shí)間的延長(zhǎng)幾乎呈指數(shù)型增長(zhǎng)。綠咖啡油的初始PV為0.97±0.04 meq/kg，經(jīng)過(guò)36 d的氧化，PV增加到28.56±0.15 meq/kg。在氧化過(guò)程中，咖啡油樣品的PV越高，說(shuō)明其氧化酸敗程度越高。初始階段PV增加可能是由于自由基對(duì)不飽和脂肪酸的影響和過(guò)氧化物的形成，由于過(guò)氧化物性質(zhì)不穩(wěn)定，會(huì)分解成二次氧化產(chǎn)物（醛、酮等）[18]。

酸價(jià)（AV）可作為油脂質(zhì)量劣變的指標(biāo)，其決定了甘油三酯水解產(chǎn)生的游離脂肪酸的數(shù)量。在光、熱或脂肪酶的作用下，脂質(zhì)分子釋放出游離脂肪酸，這會(huì)影響油脂的穩(wěn)定性。綠咖啡油在氧化過(guò)程中AV變化如圖1B所示，AV隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，從1.75±0.08 mg/g（0 d）增加到2.64± 0.06 mg/g（36 d），6 d到12 d與18 d到24 d的AV無(wú)顯著差異，在氧化后期，樣品AV變化速率較前期更快，說(shuō)明油脂水解酸敗程度更高。在食用植物油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，植物原油的AV須低于4 mg/g。

游離脂肪酸（FFA）被用于測(cè)定油脂中甘油三酯水解情況。當(dāng)甘油三酯分解，游離脂肪酸濃度增加時(shí)，促進(jìn)了油脂的氧化過(guò)程，從而縮短了油脂的儲(chǔ)存期。如圖1C所示，游離脂肪酸初始含量為1.47±0.08 mg/g。所有樣品的游離脂肪酸含量在氧化36 d內(nèi)均有增加，在氧化的中期12 d到24 d之間無(wú)顯著變化，氧化終點(diǎn)的FFA為2.28±0.05 mg/g，說(shuō)明綠咖啡油在氧化的過(guò)程中發(fā)生了水解。氧化過(guò)程中FFA的形成影響了油的AV，因此，AV和FFA含量呈極顯著正相關(guān)。

2.1.2 ?不同氧化時(shí)間對(duì)茴香胺值、硫代巴比妥酸值、碘值的影響 ?茴香胺值（P-AV）能評(píng)估油脂次級(jí)氧化，醛羰基鍵在脂質(zhì)次級(jí)氧化過(guò)程中形成。在本研究中，如圖2A所示。氧化初期P-AV為4.19±0.14，加速氧化6 d后，P-AV降到2.83±0.20，原因是在氧化初期并沒(méi)有發(fā)生次級(jí)氧化反應(yīng)，在隨后氧化的30 d升高到19.19±0.13，說(shuō)明綠咖啡油的氧化程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，產(chǎn)生較多的醛酮類物質(zhì)導(dǎo)致P-AV上升。

硫代巴比妥酸（TBARS）主要用于評(píng)估氧化的次級(jí)產(chǎn)物（如醛和酮）的形成，這些產(chǎn)物主要來(lái)源于多不飽和脂肪酸的降解。過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸縮合，因而測(cè)試MDA的量可以反應(yīng)油脂過(guò)氧化程度。食品中TBARS越高，代表食品越不新鮮。如圖2B所示，在氧化初期，TBARS為55.08±10.98 nmol/mL，

氧化中期即12～30 d，TBARS升高較為平緩，由77.62±1.26 nmol/mL升高至85.87±1.20 nmol/mL。油樣在氧化末期快速升高到102.38±2.18 nmol/mL，表明在氧化末期，綠咖啡油產(chǎn)生的醛類物質(zhì)較多，次級(jí)氧化反應(yīng)加快。

碘值（IV）可用于測(cè)定脂肪酸的不飽和程度，樣品中IV與不飽和雙鍵呈正相關(guān)，IV越高，不飽和脂肪酸含量越高。圖2C所示，在氧化的36 d內(nèi)，碘值呈線性趨勢(shì)降低，由73.67±0.55 g/g逐漸下降至55.51±0.58 g/g。這種下降主要是由于脂肪氧化引起脂肪酸雙鍵破壞，不飽和雙鍵減少，不飽和脂肪酸含量降低。也有其他學(xué)者通過(guò)IV來(lái)反映油脂氧化程度，夏義苗等[19]在葵花籽油品質(zhì)的研究中，在180 ℃加熱條件下，24 h內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，碘值迅速降低，氧化程度升高，不飽和鍵快速減少。

2.1.3 ?不同氧化時(shí)間對(duì)總氧化值的影響 ?總氧化值（TOTOX）由茴香胺值和過(guò)氧化值計(jì)算得來(lái)，它綜合了初級(jí)和次級(jí)氧化程度的信息，能評(píng)估油脂的總體氧化狀態(tài)。圖3所示為TOTOX值的變化趨勢(shì)，與過(guò)氧化值的變化趨勢(shì)相似，即綠咖啡油的TOTOX值在氧化期間呈指數(shù)型升高。TOTOX初始值為8.05±0.06，0～6 d油樣無(wú)顯著變化，在24～30 d的TOTOX升高速率最快，經(jīng)過(guò)36 d的加速氧化，TOTOX增加到133.43±0.48。這些結(jié)果表明，氧化過(guò)程促進(jìn)了初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物的生成，從而降低綠咖啡油的氧化穩(wěn)定性。TOTOX結(jié)合了初級(jí)化產(chǎn)物（氫過(guò)氧化物）與次級(jí)氧化產(chǎn)物（不飽和醛類）的指標(biāo)，更能全面的評(píng)價(jià)油脂氧化劣變程度。

2.1.4 ?不同氧化時(shí)間對(duì)共軛二烯、三烯的影響 ?共軛二烯（K232）是在油脂發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)由多不飽和脂質(zhì)產(chǎn)生的十八碳二烯氫過(guò)氧化物，通過(guò)在波長(zhǎng)為232 nm處的最大吸收峰進(jìn)行定量測(cè)定。在波長(zhǎng)268 nm處的吸光度能夠反映綠咖啡油氧化過(guò)程中次級(jí)氧化產(chǎn)物共軛三烯（K268）的多少[20]。從圖4A可以看出，K232值在0～12 d中無(wú)明顯變化，在12 d后開始升高，在36 d達(dá)到最大值。加速氧化對(duì)K268值的影響如圖4B所示，在36 d的氧化過(guò)程中，K268值在6 d時(shí)由0.26降低到0.22，最終增加到0.29，此現(xiàn)象能與茴香胺值在氧化6 d后降低相對(duì)應(yīng)，表明在氧化初期并沒(méi)有生成次級(jí)氧化產(chǎn)物，在氧化后期次級(jí)氧化產(chǎn)物增加。

2.2 ?脂肪酸組成變化

如表1所示，本研究中共鑒定出11種脂肪酸：十五烷酸（C15∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、十七烷酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2）、α-亞麻酸（C18∶3）、花生酸（C20∶0）、二十烷酸（C20∶1）、二十碳二烯酸（C20∶2）和二十一烷酸（C21∶0）。

如圖5A，樣品主要的脂肪酸為棕櫚酸（29.42%～26.64%）、硬脂酸（15.12%～20.65%）、油酸（10.53%～12.88%）和亞油酸（33.86%～ 26.40%），這是與本課題組前期研究結(jié)果一致[21]。在咖啡油氧化過(guò)程中，飽和脂肪酸（SFA）含量由53.30%上升至59.89%，不飽和脂肪酸（UFA）由46.70%降至40.11%（圖5B），導(dǎo)致SFA/UFA由1.14上升至1.49，這種現(xiàn)象是由于UFA水解和氧化產(chǎn)生的影響，與前文碘值下降的結(jié)果相印證。本研究中，油脂氧化過(guò)程中多不飽和脂肪酸（PUFA）含量存在顯著差異，在氧化過(guò)程中有明顯的下降。這可能是因?yàn)镻UFA在氧化過(guò)程中不穩(wěn)定，受溫度及時(shí)間影響而發(fā)生裂變、聚合等反應(yīng)而氧化生成單不飽和脂肪酸（MUFA）和SFA，從而導(dǎo)致綠咖啡油中MUFA和SFA的含量隨氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。MUFA是最穩(wěn)定的不飽和脂肪酸，MUFA與SFA的比率與健康特性相關(guān)，這是因?yàn)镸UFA（主要是油酸）能夠降低血液中有害膽固醇（LDL）的水平，提高人體中的高密度脂蛋白（HDL）水平[8]。

2.3 ?二萜及生育酚含量分析

關(guān)于咖啡醇和咖啡豆醇的研究表明，咖啡醇和咖啡豆醇具有抗氧化、消炎和保護(hù)肝臟的作用，它們是咖啡脂質(zhì)組分物質(zhì)中特有的二萜類物質(zhì)，對(duì)健康有積極的作用[22]，其含量如表2所示?？Х榷勾寂c咖啡醇在氧化過(guò)程中均有上升的趨勢(shì)。咖啡豆醇含量由氧化初期的21.01±0.31 mg/g在氧化24 d時(shí)升高到23.44±0.52 mg/g，在之后的氧化過(guò)程中無(wú)顯著變化，油樣在30 d、36 d的咖啡豆醇含量分別為23.78±0.27 mg/g、23.69±0.19 mg/g?？Х却嫉淖兓厔?shì)與咖啡豆醇相同，含量由8.21±0.10 mg/g（0 d）升高到8.99±0.02 mg/g（24 d）后趨于穩(wěn)定。

生育酚是植物油中一種重要的天然抗氧化劑，它不僅能阻斷自由基的產(chǎn)生，還能抑制單線態(tài)氧的產(chǎn)生，對(duì)植物油多不飽和脂肪酸氧化變質(zhì)具有保護(hù)作用[23]。本研究共定性出3種生育酚，分別為α、δ和γ-生育酚。3種生育酚的抗氧化能力為：α-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚。本研究中γ-生育酚是綠咖啡油中的主要生育酚，占咖啡油生育酚總量的64.08%～76.34%，含量在26.40± 0.37 mg/100 g～33.19±0.47 mg/100 g，其次為α-生育酚、γ-生育酚。3種生育酚含量在氧化過(guò)程中均呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)，均在氧化18 d時(shí)達(dá)到最大值，因此在氧化后期，由于生育酚含量的減少，綠咖啡油的抗氧化能力隨之減弱。

2.4 ?傅里葉紅外光譜分析

綠咖啡油在波段為4000～400 cm–1范圍內(nèi)紅外光譜圖如圖6A所示，從圖中可看出，油脂的光譜在波段3008、2927、2854、1745、1461、1375、1238、1164和721 cm–1處有吸收峰，這些譜峰與油脂化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在的官能團(tuán)有關(guān)，揭示了組分的特征[24]。不同氧化時(shí)間下的譜峰的強(qiáng)度存在變化，這些變化是由于綠咖啡油氧化過(guò)程中生成了氫過(guò)氧化物、醛、酮、游離脂肪酸等氧化產(chǎn)物，因此，可采用紅外光譜從特征官能團(tuán)的角度分析綠咖啡油的氧化過(guò)程。

波段721 cm–1處是順式取代烯烴的CH2伸縮振動(dòng)與平面外振動(dòng)的重疊峰，如圖6B所示，峰強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明氧化過(guò)程中，油脂分子鏈斷裂，分子量變小。1164 cm–1處為酯基團(tuán)（-C-O）伸縮振動(dòng)，在氧化過(guò)程中吸收峰變窄，1461 cm–1處為亞甲基（-CH2）彎曲振動(dòng)，峰強(qiáng)隨時(shí)間增長(zhǎng)有輕微下降（圖6C）。1746 cm–1為甘油三酯羰基（-C=O）伸縮振動(dòng)峰，此處的吸收峰最強(qiáng)，此峰峰強(qiáng)隨著氧化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這是由于油脂氧化過(guò)程中生成醛、酮、酸等物質(zhì)使官能團(tuán)增加而引起的（圖6D）。2854 cm–1處為甲基（-CH3）對(duì)稱伸縮振動(dòng)，2927 cm–1處為亞甲基（-CH2）不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，兩者在氧化過(guò)程中吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)（圖6E）。3008 cm–1處為油脂烯烴不飽和C原子上C-H伸縮振動(dòng)，吸收峰在氧化過(guò)程中下降，此處吸收峰強(qiáng)度與油脂不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）含量相關(guān)，說(shuō)明不飽和脂肪酸含量下降。通過(guò)紅外光譜分析綠咖啡油在氧化過(guò)程中譜圖的變化，能說(shuō)明特征官能團(tuán)吸收峰每一個(gè)微小的變化都反映了油脂內(nèi)部的改變。

2.5 ?拉曼光譜分析

利用拉曼光譜可以監(jiān)測(cè)脂質(zhì)氧化過(guò)程中分子結(jié)構(gòu)變化。圖7所示為綠咖啡油氧化過(guò)程中的拉曼光譜圖，從圖中可看出各峰所代表的組分分子基團(tuán)結(jié)構(gòu)信息。油脂中的每一種分子基團(tuán)都能跟某種具有拉曼活性的振動(dòng)方式相匹配，從而相應(yīng)地在拉曼光譜中形成一個(gè)特征峰，并且該特征峰的強(qiáng)度隨著該分子基團(tuán)濃度的增加或降低而增強(qiáng)或減弱，即兩者成正比關(guān)系。由圖7A可知，綠咖啡油氧化過(guò)程中，拉曼光譜的變化大多數(shù)集中在1000～1800 cm–1和2800～3050 cm–1區(qū)域，特別是1000～1800 cm–1區(qū)域。在1082、1265、1442、1658、1745、2850 cm?1區(qū)域觀察到拉曼強(qiáng)度的變化。在整個(gè)氧化過(guò)程中，咖啡油的拉曼光譜強(qiáng)度均呈減弱趨勢(shì)，說(shuō)明基團(tuán)發(fā)生了變化。1082 cm–1處的峰強(qiáng)與不飽和度呈正相關(guān)，此處峰強(qiáng)降低代表了脂肪酸不飽和程度降低（表3）。1265 cm–1和1658 cm–1處峰強(qiáng)減弱，是由于在油脂氧化的過(guò)程中，隨著氧化程度的加深，順式雙鍵發(fā)生異構(gòu)化并重排成為穩(wěn)定的反式雙鍵構(gòu)型的趨勢(shì)越來(lái)越強(qiáng)烈，即在反式結(jié)構(gòu)成分持續(xù)增多的同時(shí)，順式結(jié)構(gòu)普遍減少[17]。

標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV）主要是用以消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對(duì)光譜的影響。一階導(dǎo)數(shù)可消除光譜中基線的平移和漂移，可有效消除其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度[25]。圖7B是將原光譜圖進(jìn)行SNV和一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后的結(jié)果，能清晰觀察到1000～1800 cm–1和2800～3050 cm–1區(qū)域拉曼強(qiáng)度隨氧化時(shí)間的增長(zhǎng)而減弱。

2.6 ?主成分分析

主成分分析（PCA）是一種把多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的分析方法，目的是簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)和揭示變量之間的關(guān)系[26]。用PCA分析了綠咖啡油各氧化指標(biāo)、活性物質(zhì)、脂肪酸與氧化時(shí)間的關(guān)系。如圖8所示，第一主成分（PC1）貢獻(xiàn)率為87.1%，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為7.2%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.3%，表明前兩個(gè)主成分可解析原始變量94.3%的信息。圖8A顯示了樣品的二維得分投影圖（PC1-PC2），根據(jù)樣品特征對(duì)不同氧化時(shí)間的樣品進(jìn)行分類。顯然，不同氧化時(shí)間下的綠咖啡油在得分圖的四個(gè)象限很容易區(qū)分，氧化中期（18 d～24 d）的綠咖啡油樣品有輕微重疊。每個(gè)主成分都是原始變量的線性組合，線性組合中各變量對(duì)主成分的影響用載荷表示，載荷絕對(duì)值越大，其影響越大，各指標(biāo)的載荷如圖8B所示。PC1中，酸價(jià)、過(guò)氧化值、總氧化值的載荷絕對(duì)值最大，均為0.28，說(shuō)明這三個(gè)指標(biāo)對(duì)PC1起決定性作用。PC2中，咖啡醇與K268的載荷絕對(duì)值最大，分別為0.44、0.43，表明這兩個(gè)指標(biāo)是PC2的代表指標(biāo)。氧化0 d的綠咖啡油與其他樣品區(qū)分開的主要影響指標(biāo)是不飽和脂肪酸和碘值。PCA結(jié)果表明，各氧化時(shí)間下的綠咖啡油可根據(jù)不同指標(biāo)進(jìn)行聚類。此外，部分樣品氧化時(shí)間的分組較為緊密，這可能是二萜類和生育酚指標(biāo)相似的結(jié)果。

2.7 ?相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究綠咖啡油氧化過(guò)程中各指標(biāo)間相關(guān)性，對(duì)其進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析，如圖9所示為綠咖啡油不同氧化階段各氧化指標(biāo)、生育酚、二萜、脂肪酸之間的關(guān)系。上三角區(qū)紅色橢圓表示二者呈正相關(guān)，藍(lán)色橢圓表示二者呈負(fù)相關(guān)，橢圓越扁顏色越深表明相關(guān)性越大，無(wú)星號(hào)標(biāo)記表明二者無(wú)相關(guān)性;下三角區(qū)則標(biāo)明了相關(guān)系數(shù)。過(guò)氧化值與酸價(jià)、游離脂肪酸、茴香胺值、總氧化值、共軛二烯、飽和脂肪酸呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），這些指標(biāo)都隨氧化時(shí)間的增長(zhǎng)而升高;過(guò)氧化值與碘值、總生育酚、不飽和脂肪酸呈極顯著負(fù)相關(guān)?？Х却肌⒖Х榷勾寂c多個(gè)指標(biāo)無(wú)相關(guān)性，表明脂質(zhì)氧化對(duì)綠咖啡油中二萜類成分影響不大。由此可進(jìn)一步說(shuō)明在綠咖啡油氧化過(guò)程中，其品質(zhì)變化與脂質(zhì)氧化降解密切相關(guān)，各指標(biāo)的變化有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3 ?討論

油脂氧化的途徑有自動(dòng)氧化、光敏氧化和酶促氧化。綠咖啡油貯藏過(guò)程中主要發(fā)生自動(dòng)氧化，油脂氧化過(guò)度會(huì)導(dǎo)致感官分值降低、風(fēng)味劣化、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值流失等一系列損害。不少學(xué)者通過(guò)熱誘導(dǎo)加速氧化法對(duì)油脂進(jìn)行氧化處理，Li等[27]描述了加速氧化對(duì)大豆油顏色變化的影響，討論了返色與氧化之間的定量關(guān)系。Rotich等[28]對(duì)4種意大利特級(jí)初榨橄欖油的熱氧化穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。

綠咖啡油中共檢測(cè)出11種脂肪酸，隨著油脂氧化，SFA和MUFA含量升高，SFA與USFA比值增大，這是由于PUFA在氧化過(guò)程中發(fā)生了裂變與降解。碘值降低、傅里葉紅外光譜中3008 cm–1處吸收峰強(qiáng)度降低和拉曼光譜中1082 cm–1處的峰強(qiáng)降低同時(shí)表征了USFA在氧化過(guò)程中含量減少的信息。此結(jié)果與Cui等[29]研究冷榨榛子油在加速氧化40 d過(guò)程中氧化特性、脂肪酸及主要生物活性物質(zhì)的變化規(guī)律一致。

綠咖啡有中含有豐富的活性物質(zhì)，本研究中測(cè)定的生育酚是常見的天然抗氧化劑，且存在多種構(gòu)型。3種生育酚在加速氧化18 d后均呈下降趨勢(shì)，且α-生育酚減少59.11%，消耗最多且最快，其原因是α-生育酚生理活性在生育酚同系物中最強(qiáng)，更容易氧化降解。盡管綠咖啡油中存在一定的抗氧化物質(zhì)，但僅能減緩而不能阻止油脂在熱誘導(dǎo)下的加速氧化，因此，不少學(xué)者通過(guò)添加抗氧化劑來(lái)增強(qiáng)油脂的抗氧化能力。Martin-Rubio等[30]研究了添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%～5%的α-生育酚對(duì)大豆油氧化穩(wěn)定性的影響。Zhao等[31]研究了米糠油熱氧化過(guò)程中谷維素和生育酚最佳配比的添加及其與米糠油理化指標(biāo)的關(guān)系，說(shuō)明天然抗氧化劑對(duì)油脂的穩(wěn)定性和營(yíng)養(yǎng)特性十分重要。

4 ?結(jié)論

（1）熱處理會(huì)促進(jìn)綠咖啡油的氧化，氧化程度越高，綠咖啡油品質(zhì)越差。

（2）綠咖啡油中的活性物質(zhì)咖啡豆醇、咖啡醇含量在氧化過(guò)程中均有上升，生育酚含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。

（3）綠咖啡油的紅外光譜分析結(jié)果表明氧化過(guò)程中的分子基團(tuán)發(fā)生了變化，拉曼光譜譜圖中代表不飽和脂肪酸的基團(tuán)峰強(qiáng)下降明顯。

（4）本研究為評(píng)判綠咖啡油加速氧化過(guò)程匯總品質(zhì)變化提供了多個(gè)典型理化指標(biāo)信息，不僅為利用綜合指標(biāo)來(lái)評(píng)判油脂品質(zhì)提供了有益思路，亦為綠咖啡油貯藏穩(wěn)定性提升及制定阻控策略提供了參考。

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責(zé)任編輯：崔麗虹