岑怡 程俊 丁元昊 吳剛 伍寶朵 范睿 譚樂和 胡麗松

摘 ?要：為分析不同色澤菠蘿蜜果肉中類黃酮物質(zhì)的差異，以紅色和黃色菠蘿蜜果肉為材料，基于超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜平臺，定性和定量分析類黃酮物質(zhì)。結(jié)果表明：菠蘿蜜果肉中共鑒定出82種類黃酮物質(zhì)，包括27種黃酮、24種黃酮醇、12種黃烷酮、11種黃酮碳糖苷以及8種其他類型類黃酮物質(zhì);定性定量分析的整體結(jié)果表明，紅色果肉中類黃酮物質(zhì)的種類和總含量要明顯優(yōu)于黃色果肉;紅色果肉和黃色果肉之間差異組分的統(tǒng)計結(jié)果表明，在紅色果肉中優(yōu)勢積累的類黃酮物質(zhì)有19個，僅3個黃酮碳糖苷在黃色果肉中優(yōu)勢積累。研究結(jié)果揭示了紅色果肉中類黃酮總含量和種類的優(yōu)勢，為菠蘿蜜品種選育提供了數(shù)據(jù)和材料參考。

關(guān)鍵詞：菠蘿蜜;果肉;顏色;類黃酮

中圖分類號：S667.8 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Flavonoids are important pigments and active substances in plants. Here， the composition and content of flavonoids in jackfruit were investigated based on the ultra performance liquid chromatography-electrospray ioniza-tion–tandem mass spectrometry system. 82 flavonoids with differential accumulation were identified， including 27 flavones， 24 flavonol， 12 flavanone， 11 flavone C-glycosides and eight others. The overall ?quantitative and qualitative analysis showed that the composition and content of flavonoids in red fruit were significantly super to that of yellow fruit. The comparative analysis between red and yellow fruit showed that there were 19 flavonoids predominantly accumulated in the red fruit， and only 3 flavanones accumulated in yellow fruit， the differential accumulated flavonoids in red flesh was also super to that of yellow flesh.

Keywords： jackfruit; different fleshed fruit; flavonoid

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.032

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），又名木菠蘿，是?？疲∕oraceae）木菠蘿屬（Artocarpus）熱帶園藝作物，在東南亞、太平洋島國及中南美洲熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植[1]。我國引種栽培已有一千多年歷史，海南是我國菠蘿蜜最大的主產(chǎn)地。隨著海南旅游業(yè)的發(fā)展及生活水平的提高，人們對各種名優(yōu)稀特水果的需求日益增加，菠蘿蜜果實味甜、香氣獨特，含有豐富的糖類、萜類、維生素和礦物質(zhì)等，深受大眾歡迎。近年來菠蘿蜜產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，種植面積以每年20%左右的速度增長，目前已經(jīng)接近1.4萬hm2，已經(jīng)成為熱帶地區(qū)人民創(chuàng)收致富的新途徑，具有廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景[2]。果肉色澤是菠蘿蜜果肉重要的品質(zhì)性狀，相比于普通的品種，紅肉品種的營養(yǎng)價值、外觀品質(zhì)、風(fēng)味口感更具市場優(yōu)勢。紅肉菠蘿蜜果肉粉紅色至紅色，色澤均勻，有特殊香味，品質(zhì)優(yōu)、商品性好已成為育種研究和市場消費的新焦點。

黃酮類物質(zhì)和類胡蘿卜素是植物中兩大主要的呈色物質(zhì)，在植物組織呈色、逆境響應(yīng)以及人類健康飲食方面具有廣泛的功能，有關(guān)黃酮類物質(zhì)和類胡蘿卜素合成途徑及其相關(guān)基因的遺傳操作調(diào)控得到了廣泛的研究[3]。類胡蘿卜素普遍存在于高等植物中，是由異戊二烯骨架構(gòu)成的C40或C30萜類化合物，目前已鑒定出1000多種，是植物花、果實及根呈現(xiàn)黃色、橙紅色至紅色的原因[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，脂溶性類胡蘿卜素是菠蘿蜜果肉的呈色物質(zhì)，其組分和含量的差異導(dǎo)致果肉呈現(xiàn)紅色和黃色2種顏色[5]。項目組前期通過液相色譜法建立了菠蘿蜜類胡蘿卜素分析方法，鑒定出16種不同的類胡蘿卜素組分。通過不同色澤果肉組分定量定性分析發(fā)現(xiàn)，紅色果肉中類胡蘿卜素總含量高于黃色果肉。其中，β-檸烏素是紅色果肉的呈色組分，紫黃質(zhì)是黃肉果肉主要的呈色組分，紫黃質(zhì)合成前體的裂解反應(yīng)及下游異構(gòu)化反應(yīng)是造成果肉色澤差異的潛在原因[6]。關(guān)于菠蘿蜜果肉中類黃酮物質(zhì)的分析尚未見報道。

類黃酮物質(zhì)由1分子香豆酰輔酶A和3分子的丙二酰輔酶A縮合生成，具有典型的C6（A環(huán)）-C3-C6（B環(huán)）結(jié)構(gòu)。根據(jù)中間三碳鍵結(jié)構(gòu)的成環(huán)與否和氧化程度、B環(huán)位點修飾形式，黃酮類物質(zhì)可以分為黃酮類（flavone），黃酮醇類（flavonol），黃烷酮類（Flavanone），花色素類（anthocyanidins）等，目前植物界已經(jīng)鑒定出超過8000種類黃酮物質(zhì)[7]。類黃酮一般呈黃色至橙黃色，不同類型組分、液泡pH、B環(huán)的修飾形式等使得組織呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色。除了參與形成植物組織的色澤外，類黃酮物質(zhì)在人體中具有廣泛的生理活性，如抗氧化、保護神經(jīng)元、血管舒張等[8]。本研究以不同色澤的菠蘿蜜果肉為材料，基于高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜平臺，分析不同色澤果肉中類黃酮物質(zhì)的差異，為菠蘿蜜優(yōu)質(zhì)資源的篩選和新品種選育提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

選取盛產(chǎn)期內(nèi)兩組不同果肉顏色的菠蘿蜜為材料，紅肉品種/系為‘R-M5’‘R-珍珠果’‘R-四季紅’，黃肉品種/系為‘Y-QY1’‘Y-XYS8’‘Y-XYS11’。所有果實取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科院香料飲料研究所菠蘿蜜種質(zhì)資源圃，按照菠蘿蜜果肉發(fā)育周期，取開花后110 d果肉，–80 ℃保存，取樣時間控制在0.5 h內(nèi)，每個品系/種從3個不同單株取樣作為生物學(xué)重復(fù)[9]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品提取 ?菠蘿蜜果肉冷凍干燥后研磨成粉。取0.1 g粉末溶解于1.0 mL70%甲醇提取液中，4 ℃過夜提取。離心（轉(zhuǎn)速10000 ×g，10min），吸取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品并保存于進樣瓶中，用于超高效液相色譜（UPLC，Shim-pack UFLC Shimadzu CBM30A，日本島津）串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（MS/MS， Applied Biosystems 6500 QTRAP， 美國Applied Biosystems）分析。

1.2.2 ?色譜質(zhì)譜分析條件 ?代謝組分析樣品處理、物質(zhì)提取、上機檢測等方法參考Chen等[10]開發(fā)的廣泛靶向代謝組學(xué)研究方法。分析方法分為超高效液相色譜和串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜兩部分。色譜柱為C18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），流動相A相為超純水（含0.04%乙酸），B相為乙腈（含0.04%乙酸）。洗脫條件為：0 min，A-B（95∶5，V/V）;11.0 min，A-B（5∶95）;12.0 min，A-B（5∶95）;12.1 min，A-B（95∶5）;15.0 min，A-B（95∶5）。流速0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量5 μL。質(zhì)譜電噴霧離子源（electrospray ionization， ESI）溫度設(shè)為500 ℃，質(zhì)譜電壓5500 V，簾氣25 psi?；谶~維代謝自建數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database）的物質(zhì)信息進行物質(zhì)定性。利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring， MRM），根據(jù)特征碎片離子的峰面積進行代謝物定量[11]。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

根據(jù)峰面積統(tǒng)計鑒定出的物質(zhì)種類和含量，其中檢測不出的物質(zhì)面積統(tǒng)一計為9。物質(zhì)種類和面積的差異顯著性采用t檢驗。

根據(jù)（log10峰面積+1）的值繪制熱圖，熱圖采用R語言繪制。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?類黃酮物質(zhì)鑒定與分析

選取3個紅色果肉品系/種（‘R-M5’‘R-珍珠果’‘R-四季紅’）和3個黃色果肉品系/種（Y-QY1’‘Y-XYS8’‘Y-XYS11），開展類黃酮代謝組分析，果肉色澤如圖1所示。6個品系/種果肉中共鑒定出82種類黃酮物質(zhì)，包括27種黃酮類（flavone）、24種黃酮醇類（flavonol）、12種黃烷酮類（flavanone）、11種黃酮碳糖苷（flavone C-glycosides）、4種異黃酮類（isoflavone）以及2種黃酮-木脂素（flavonolignan）和2種原花青素（proanthocyanidins）。

紅色果肉材料中，‘R-M5’含有類黃酮物質(zhì)75種，‘R-珍珠果’含有75種，‘R-四季紅’含有73種;黃色果肉材料中，‘Y-XYS8’含有類黃酮物質(zhì)71種，‘Y-QY1’含有69種，‘Y-XYS11’含有68種（表1）。t檢驗結(jié)果表明，紅肉材料中類黃酮種類顯著多于黃肉材料（P<0.05）。根據(jù)每個樣品中所有類黃酮物質(zhì)的峰面積計算總含量，‘R-M5’總峰面積值為456000，‘R-珍珠果’總峰面積值為299000，‘R-四季紅’總峰面積值為287000，‘Y-XYS11’總峰面積值為182000，‘Y-QY1’‘Y-XYS8’的總峰面積值均為174000。t檢驗結(jié)果表明，紅肉材料類黃酮總含量也顯著高于黃肉材料（P<0.05）。定性和定量分析的結(jié)果表明，紅色果肉中類黃酮物質(zhì)的種類和總含量要明顯優(yōu)于黃色果肉。

2.2 ?差異類黃酮物質(zhì)分析

根據(jù)定量分析結(jié)果，將類黃酮物質(zhì)分為3類：（1）在紅色果肉中大量積累的物質(zhì);（2）在黃色果肉中大量積累的物質(zhì);（3）在紅色和黃色果肉間積累無顯著差異的物質(zhì)。結(jié)果表明，在紅色果肉中大量積累的類黃酮物質(zhì)有19個，包括黃酮醇類7個、黃酮類6個、黃烷酮類3個、原花青素2個、黃酮碳糖苷1個;在黃色果肉中優(yōu)勢積累的類黃酮物質(zhì)僅有3個黃酮碳糖苷;其他60個類黃酮物質(zhì)在紅肉和黃肉中無明顯的積累差異趨勢（圖2）。差異組分的統(tǒng)計結(jié)果同樣表明，在紅色果肉中優(yōu)勢積累的類黃酮組分要多于黃色果肉。

2.3 ?類黃酮差異組分代謝關(guān)聯(lián)分析

為進一步解析紅色果肉和黃色果肉中類黃酮代謝差異，本研究初步分析了差異類黃酮物質(zhì)之間的代謝關(guān)聯(lián)。首先，整體上數(shù)量和含量的優(yōu)勢表明，紅色果肉中類黃酮物質(zhì)的合成要優(yōu)于黃色果肉。差異組分覆蓋黃烷酮、黃酮、黃酮醇3個主要的代謝分支，而黃色果肉中高量積累的為3種黃酮糖苷（flavone C-glycosides）。4，5，7-三羥黃烷酮（naringenin）是類黃酮代謝不同分支途徑的關(guān)鍵中間體。三羥黃烷酮B環(huán)2位或3位碳原子經(jīng)過羥基化修飾后進入異黃酮代謝支路。三羥黃烷酮A環(huán)7位糖基化修飾和B環(huán)4位甲基化修飾后進入黃烷酮代謝支路，在此基礎(chǔ)上對A環(huán)7位和B環(huán)4位點進行第二輪糖基化修飾，則進入黃酮途徑。其他黃烷醇、原花青素等支路途徑的差異同樣基于碳環(huán)上不同位點，不同的修飾類型。由此可見，紅色果肉中類黃酮代謝支路的活性差異是造成物質(zhì)種類和含量的內(nèi)在原因（圖3）。其中，麥黃酮O-鼠李糖苷（tricin o-rhamnoside），紫杉葉素（dihydroquercetin），橙皮素（hesperetin），原花青素B2（procyanidin B2），原花青素B3（procyanidin B3）等物質(zhì)提供了黃色、紅色和粉色組分，盡管類黃酮物質(zhì)的呈色與細胞內(nèi)pH、外界環(huán)境刺激等因素相關(guān)，但總體來講，數(shù)量和含量上的優(yōu)勢使得紅色果肉比黃色果肉擁有更加鮮艷的色澤。

3 ?討論

菠蘿蜜是典型的熱帶園藝作物，除了果實鮮食外，在東南亞還是一種重要的民間用藥，被應(yīng)用在保護皮膚、促進消化、預(yù)防貧血等方面。類黃酮物質(zhì)因其廣泛的生理活性和多變的顏色，一直是園藝研究的熱點[12]。菠蘿蜜類黃酮物質(zhì)的鑒定，前期主要以核磁共振技術(shù)為主，已報道的物質(zhì)包括artoindonesianin P，artelastoxanthone，artonin衍生物等[13-17]。江西中醫(yī)藥大學(xué)任剛團隊采用四級桿飛行時間串聯(lián)線性四極離子阱質(zhì)譜從菠蘿蜜的根中鑒定出47種類黃酮物質(zhì)，該研究為類黃酮物質(zhì)的高通量鑒定提供了重要的物質(zhì)信息和技術(shù)參考[18]。本研究基于高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜平臺，利用已有數(shù)據(jù)庫中的代謝物信息，從不同色澤的菠蘿蜜果肉中鑒定出82種類黃酮物質(zhì)，研究結(jié)果是對菠蘿蜜果肉中類黃酮物質(zhì)信息的重要補充，同時也為后續(xù)物質(zhì)鑒定研究提供了技術(shù)參考。

類黃酮物質(zhì)含量和組分的不同，影響了果實的色澤和生理活性，對感官和營養(yǎng)品質(zhì)的形成具有重要的作用。本研究通過對比發(fā)現(xiàn)，紅色果肉中類黃酮物質(zhì)種類和總含量均優(yōu)于黃色果肉?；谙嗤牟牧希捌谘芯縖6]結(jié)果表明紅色果肉中類胡蘿卜素種類和總含量同樣優(yōu)于黃色果肉。因此，我們認為類黃酮物質(zhì)和類胡蘿卜素共同參與了菠蘿蜜果肉的色澤和風(fēng)味的形成。然而，在代謝途徑上二者具有明顯的差異，類黃酮物質(zhì)起始于莽草酸途徑的香豆酰輔酶A和脂肪酸代謝途徑的丙二酰輔酶A縮合反應(yīng)，高等植物的類胡蘿卜素則起源于質(zhì)體中的 2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑。在實際的研究中，類黃酮和類胡蘿卜素一般作為2個獨立的性狀進行遺傳改良，如富含類胡蘿卜素的“黃金大米”和富含花青素的“紫晶米”，DE-ETIOLATED1是唯一一個可以同時提高組織中類黃酮和類胡蘿卜素的基因，關(guān)于同時提高類黃酮和類胡蘿卜素的調(diào)控機制有待進一步深入研究[19-21]。菠蘿蜜紅色果肉中類黃酮和類胡蘿卜素同時表現(xiàn)出優(yōu)勢積累，該特征為研究同時提升果實營養(yǎng)和感官品質(zhì)的新途徑提供了理想材料。

參考文獻

[1] Prakash O， Kumar R， Mishra A， et al. Artocarpus hetero-phyllus （Jackfruit）： an overview[J]. Pharmacognosy Re-views， 2009， 3（6）： 353-358.

[2] 吳 ?剛， 陳海平， 桑利偉， 等. 中國菠蘿蜜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 33（2）： 91-7.

[3] Tanaka Y， Sasaki N， Ohmiya A. Biosynthesis of plant pig-ments： anthocyanins， betalains and carotenoids[J]. The Plant Journal， 2010， 54（4）： 733-749.

[4] 高慧君， 明家琪， 張雅娟， 等. 園藝植物中類胡蘿卜素合成與調(diào)控的研究進展[J]. 園藝學(xué)報， 2015， 42（9）： 1633-1648.

[5] De Faria A F， De Rosso V V， Mercadante A Z. Carotenoid composition of jackfruit （Artocarpus heterophyllus）， deter-mined by HPLC-PDA-MS/MS[J]. Plant Foods for Human Nutrituon， 2009， 64（2）： 108-15.

[6] 胡麗松， 吳 ?剛， 郝朝運， 等. 菠蘿蜜類胡蘿卜素檢測方法研究及呈色物質(zhì)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2017， 38（5）： 950-956.

[7] Forkmann G. Flavonoids as flower pigments： the formation of the natural spectrum and its extension by genetic engi-neering[J]. Plant Breeding， 2010， 106（1）： 1-26.

[8] Falcone Ferreyra M L， Rius S P， Casati P. Flavonoids： bio-synthesis， biological functions， and biotechnological applications[J]. Frontiers in Plant Science， 2012， 3（222）： 222-236.

[9] Hu L， Wu G， Hao C， et al. Transcriptome and selected me-tabolite analyses reveal points of sugar metabolism in jack-fruit （Artocarpus heterophyllus Lam.） [J]. Plant Science， 2016， 248：45-56.

[10] Chen W， Gong L， Guo Z， et al. A novel integrated method for large-scale detection， identification， and quantification of widely targeted metabolites： application in the study of rice metabolomics[J]. Molecular Plant， 2013， 6（6）： 1769-1780.

[11] Fraga C G， Clowers B H， Moore R J， et al. Signature-di-scovery approach for sample matching of a nerve-agent precursor using Liquid Chromatography?Mass Spectrometry， XCMS， and chemometrics[J]. Analytical Chemistry， 2010， 82（10）： 4165-4173.

[12] Swami S B， Kalse S B. Jackfruit （Artocarpus heterophyllus）： Biodiversity， nutritional contents， and health[M]//Mérillon J M， Ramawat K. Bioactive molecules in food. Cham， Swit-zerland： Springer International Publishing. 2018： 1-23.

[13] Ko F N， Cheng Z J， Lin C N， et al. Scavenger and antioxi-dant properties of prenylflavones isolated from Artocarpus heterophyllus[J]. Free Radical Biology and Medicine， 1998， 25（2）： 160-168.

[14] Lin C N， Lu C M， Huang P L. Flavonoids from Artocarpus heterophyllus[J]. Phytochemistry， 1995， 39（6）： 1447-1451.

[15] Chung M I， Lu C M， Huang P L， et al. Prenylflavonoids of Artocarpus heterophyllus[J]. Phytochemistry， 1995， 40（4）： 1279-1282.

[16] Nomura T， Aida M， Shinomiya K， et al. Artonins Q， R， S， T， and U， five new isoprenylated phenoles from the bark of Artocarpus heterophyllus Lamk[J]. Heterocycles， 1994， 39： 847-858.

[17] Nomura T， Aida M， Shinomiya K， et al. Artonins J， K， and L， three new isoprenylated flavones from the root bark of Artocarpus heterophyllus Lamk[J]. Heterocycles， 1993， 36： 575-583.

[18] Ye J B， Ren G， Li W Y， et al. Characterization and identifi-cation of prenylated flavonoids from Artocarpus heterophyllus Lam. Roots by quadrupole time-of-flight and linear trap quadrupole orbitrap mass spectrometry[J]. Molecules， 2019， 24（24）： 4591.

[19] Davuluri G R， Van Tuinen A， Fraser P D， et al. Fruit-specific RNAi-mediated suppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes[J]. Nature Biotechnology， 2005， 23（7）： 890-895.

[20] Ye X， Al-Babili S， Kl Ti A， et al. Engineering the provitamin A （beta-carotene） biosynthetic pathway into （carotenoid-free） rice endosperm[J]. Science， 2000， 287（5451）： 303-305.

[21] Zhu Q， Yu S， Zeng D， et al. Development of “Purple Endosperm Rice” by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system[J]. Molecular Plant， 2017， 10（7）： 918-929.

責(zé)任編輯：崔麗虹