董世滿 李智博 郭鑫 李淑霞 于曉玲 彭明

摘 ?要：木薯是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物。木薯種莖是目前唯一的繁殖方式，然而采收后木薯種莖如何應(yīng)對(duì)脫水脅迫及糖代謝基因的表達(dá)尚不清楚。本研究通過檢測(cè)對(duì)照組和保水處理組的木薯種莖在采后不同時(shí)間點(diǎn)水分和糖分的含量變化來探究離體條件下木薯種莖內(nèi)糖類發(fā)揮的作用。通過檢測(cè)糖類代謝相關(guān)基因的表達(dá)來解析不同糖分間的代謝關(guān)系及離體種莖的活性狀態(tài)。結(jié)果表明，在保水處理組中隨著采后時(shí)間的延長(zhǎng)，種莖中的果糖、葡萄糖和蔗糖的含量先降低后升高，而海藻糖含量變化正好相反。同時(shí)，保水處理組的果糖、葡萄糖和蔗糖的含量顯著高于對(duì)照組，而海藻糖含量顯著低于對(duì)照組。qPCR分析發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的脫水脅迫顯著地提高了糖酵解基因的表達(dá)。這些結(jié)論表明，脫水脅迫顯著影響木薯莖中糖類的相互轉(zhuǎn)化。推測(cè)脫水脅迫前20 d通過合成海藻糖來響應(yīng)脫水脅迫，在20～30 d則通過分解海藻糖為木薯種莖提供必要的能量物質(zhì)。同時(shí)本研究通過甘油處理提高了木薯種莖的貯藏時(shí)間，為木薯種莖的貯藏提供新的方法。

關(guān)鍵詞：木薯種莖;脫水脅迫;甘油處理;糖酵解;海藻糖;種莖保藏

中圖分類號(hào)：S533 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Cassava is an important food and economic crop in tropical and subtropical areas. The cassava stems are currently the only way to reproduce. However， it is not clear how cassava stems respond to dehydration stress and the expression of glucose metabolism genes in cassava after harvest. In this study， the variation of water and sugar content in cassava stems of control and treatment at different time after harvest was investigated respectively to explore the role of sugars in cassava stems in vitro conditions. The metabolic relationship among different sugars and the activity of cassava stem in vitro were analyzed through the expression of genes related to carbohydrate metabolism. The results showed that the contents of fructose， glucose and sucrose in cassava stem decreased firstly and then increased with the prolongation of postharvest time in the treatment， and the contents were significantly higher than those in the control， while the change and content of trehalose was just the opposite. qPCR analysis demonstrated that the expression of glycolytic genes in cassava stem was improved when exposed to severe dehydration stress. The conclusions suggested that the interconversion of sugars in cassava stems was affected significantly exposed to dehydration stress. Thus， it was speculated that trehalose was synthesized in the first 20 days of dehydration stress in response to dehydration stress， and then was decomposed in the second 20-30 days to provide necessary energy sub-stances for cassava stem. In addition， the storage period of cassava stem increased by glycerol treatment， providing a new method for cassava stem storage.

Keywords： cassava stem; dehydration stress; glycerine treatment; glycolysis; trehalose; stem preservation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.021

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯屬植物[1]，是世界三大薯類作物之一。木薯是一種耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)的作物[2]。木薯種莖是木薯目前唯一的繁殖方式，人們對(duì)采后木薯種莖抗旱的研究主要是通過覆膜、浸水、蠟封等方法對(duì)木薯種莖進(jìn)行處理，研究不同處理對(duì)木薯產(chǎn)量的影響[3-4]。然而采后的木薯種莖是如何應(yīng)對(duì)脫水脅迫并沒有引起人們的關(guān)注。可溶性糖在植物的抗逆脅迫中發(fā)揮著重要的作用，木薯種莖的皮層、中柱都存在大量的淀粉和糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)參與構(gòu)成木薯種莖的形態(tài)，并在木薯種莖的生長(zhǎng)和抗逆中起著至關(guān)重要的作用。

糖在植物生長(zhǎng)發(fā)育中提供碳骨架和能量，并增強(qiáng)植物的抗逆性[5-6]。干旱脅迫下植株體內(nèi)的可溶性糖含量顯著提升[7]。體外研究表明，蔗糖、麥芽糖、海藻糖等二糖是植物體抵抗外來脅迫的重要保護(hù)劑，它們均能在干燥狀態(tài)下保持細(xì)胞內(nèi)酶的活性、且使生物膜的結(jié)構(gòu)免受破壞[8]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中糖主要作為重要的碳源和能量物質(zhì)參與植物的代謝[9]，在高等植物中主要通過糖酵解途徑產(chǎn)生ATP、NADH以及丙酮酸來行使功能，維持生物正常的生理代謝。

蔗糖主要在植物體內(nèi)參與光合固定產(chǎn)物的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)從光合作用源組織到非光合作用的庫(kù)組織[10]，包括韌皮部裝卸、維管束運(yùn)輸和卸載3個(gè)過程。在植物中觀察到的許多糖反應(yīng)是通過轉(zhuǎn)化酶或蔗糖合成酶?jìng)鲗?dǎo)的，近年來的研究表明，內(nèi)源蔗糖與海藻糖6-磷酸（T6P）水平密切相關(guān)，T6P是蔗糖有效性的信號(hào)，影響蔗糖和淀粉的相對(duì)含量[11]。T6P是合成海藻糖的前提物質(zhì)之一，而海藻糖是一種非還原性雙糖，存在于多種生物中，如細(xì)菌、真菌、地衣、藻類和無(wú)脊椎動(dòng)物[12-13]，在大多數(shù)高等植物中，海藻糖的含量極低，曾被懷疑是微生物污染[13]。

體外研究表明，蔗糖、海藻糖等雙糖在干燥狀態(tài)下具有穩(wěn)定酶活性和保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的功能，是植物中重要的脫水保護(hù)劑[14]。大量研究結(jié)果證明，海藻糖在抵御外界脅迫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。植物通過改變滲透調(diào)節(jié)和次生代謝產(chǎn)物來提高對(duì)干旱脅迫的抗性，從而適應(yīng)干旱脅迫[15]。海藻糖在干燥和冷凍條件下具有很強(qiáng)的水合能力，通過取代生物分子表面的結(jié)合水，可以提高蛋白質(zhì)和生物膜的穩(wěn)定性[16]，因此海藻糖含量的增加可以改善干旱誘導(dǎo)的滲透脅迫的負(fù)面效應(yīng)[17-18]，在干旱脅迫下蔗糖、海藻糖含量的提高可以有效抵御外來脅迫對(duì)植物的傷害[19-20]。與此同時(shí)，海藻糖還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和葉片的生長(zhǎng)和發(fā)育[19]。

本研究通過測(cè)量離體脫水條件下木薯種莖隨時(shí)間變化的失水率，各糖分變化及淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)來研究采后的木薯種莖如何應(yīng)對(duì)離體脫水脅迫，探討木薯種莖離體脫水條件下生理活性的變化。同時(shí)通過甘油處理組和對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，為木薯的種莖保藏提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?選材和處理

本實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所澄邁實(shí)驗(yàn)種質(zhì)圃提供的木薯品種（60444）。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的木薯品種，處理組兩端用甘油均勻涂抹，對(duì)照組不做處理。處理組和對(duì)照組一起放在室內(nèi)，室內(nèi)溫度約30 ℃，室內(nèi)濕度約57%。每10 d測(cè)量木薯種莖的含水量。

截取兩支長(zhǎng)勢(shì)相同的木薯莖稈約60 cm，處理組用甘油均勻地涂抹木薯種莖兩端，對(duì)照組不做處理。木薯種莖放在溫度約在30 ℃，濕度約57%，正常通風(fēng)的室內(nèi)，在采收后的1、10、20、30 d分別從木薯種莖下端取樣，盡可能地取有活性的木薯種莖。取樣后甘油處理組再次用甘油均勻地涂抹木薯種莖的取樣端。取木薯種莖約2 cm小段，先在105 ℃殺青20 min，再80 ℃烘干，測(cè)量其中糖分的含量。

每次取樣額外取木薯種莖韌皮部，迅速放在液氮中冷凍，隨后放在–80 ℃冰箱冷藏，用于提取RNA。

1.2 ?可溶性糖檢測(cè)

由上海三黍生物科技有限公司利用色譜法測(cè)量可溶性糖的含量。采用Thermo ICS5000（Dionex，Thermo Scientific，Waltham，US）離子色譜系統(tǒng)，采用CarboPac? PA20（250 mm×3.0 mm）液相色譜柱，流動(dòng)相為A：H2O，B：200 mmol/L NaOH，檢測(cè)器為電化學(xué)檢測(cè)器，進(jìn)樣量為25 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。使用外標(biāo)法對(duì)糖分含量進(jìn)行定量，通過不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來制備擬合曲線，根據(jù)儀器導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行人工數(shù)據(jù)處理，樣品可溶性糖含量（μg/mg）=（C×V×F）/M。其中C為儀器讀取的樣品濃度，單位μg/mL;V為樣品最終定容體積;F為樣品稀釋倍數(shù);M為樣品稱量質(zhì)量。測(cè)定烘干后木薯種莖中的海藻糖，蔗糖，葡萄糖，麥芽糖，果糖的含量。

1.3 ?RNA的提取及qPCR檢測(cè)

使用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取木薯種莖韌皮部總RNA，用Fastking一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑合成第一鏈cDNA試劑盒做反轉(zhuǎn)錄。

qPCR的檢測(cè)以MeACTIN基因作為內(nèi)參（表1），采用20 μL反應(yīng)體系：2× SYBRⅡ 10 μL，Primer（正反向）1.6 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 1 μL，SYBR ROXDYe 50× 0.4 μL。反應(yīng)步驟：第一步，95 ℃預(yù)變性30 s，第二步（45個(gè)循環(huán)），95 ℃：5 s，60 ℃：30 s。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?離體脫水條件下木薯種莖含水量的變化

在離體脫水條件下，木薯種莖前20 d失水速率較快。其中對(duì)照組在離體脫水脅迫20 d的平均失水率達(dá)到65%，而甘油處理組的木薯種莖在脅迫處理20 d的平均失水率僅為38%。隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，失水率逐漸減慢。離體脫水脅迫20～30 d，對(duì)照組失水變化較小，但對(duì)照組的總體失水率達(dá)73%，而甘油處理組總失水率僅為52%，表明甘油處理能顯著提高木薯種莖的保水率（圖1）。

2.2 ?離體條件下木薯種莖中糖分的含量變化

在對(duì)照組中，果糖、D-葡萄糖、蔗糖的含量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)含量不斷降低，到離體脫水脅迫處理30 d含量幾乎為0。在甘油處理組中，果糖、D-葡萄糖的干重含量在前20 d分別降低到1.5 μg/mg和0.65 μg/mg，在20～30 d又逐漸增加，含量分別達(dá)到16.6 μg/mg和9.2 μg/mg。在甘油處理組中，麥芽糖和蔗糖的含量在前10 d沒有明顯的變化，但是，麥芽糖初始含量極低且在處理20 d后低于檢測(cè)限，而蔗糖含量在10～20 d快速下降后又在實(shí)驗(yàn)處理30 d恢復(fù)到31.7 μg/mg。對(duì)照組和處理組中海藻糖的含量隨著時(shí)間的變化先升高后急劇降低，但在相同處理天數(shù)處理組的海藻糖含量均低于對(duì)照組。在離體脫水脅迫下，對(duì)照組和處理組中的總糖分呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，均呈先增加后降低的趨勢(shì)，并在30 d達(dá)到最低水平（圖2）。

在離體脫水脅迫下，與糖代謝密切相關(guān)的果糖和D-葡萄糖的初始占比在25%～30%。隨著脅迫程度的加深，果糖和D-葡萄糖的占比逐漸減少，但在脅迫處理30 d，甘油處理組中果糖和蔗糖的占比有大幅度回升，其中果糖占比28%，D-葡萄糖占比16%。在脅迫條件下，木薯種莖內(nèi)蔗糖的初始含量占比相對(duì)較高。對(duì)照組中蔗糖的初始含量占比在55%，20 d后木薯種莖內(nèi)蔗糖幾乎消失，而在實(shí)驗(yàn)處理組中蔗糖的起始占比在45%，在脅迫處理的前20 d蔗糖占比穩(wěn)步下調(diào)，30 d占比出現(xiàn)較大回升，約占總糖分含量的55%。同為雙糖的麥芽糖占比極低并很快被消耗殆盡。在對(duì)照組中，與植物抗逆密切相關(guān)的海藻糖含量占比呈現(xiàn)急劇上升后穩(wěn)定在98%左右，而在甘油處理中，海藻糖占比先快速上升，在20 d達(dá)到峰值83%后又急劇減少至幾乎消失（圖3）。

因此，果糖和D-葡萄糖在脅迫條件下主要作為能源不斷被消耗從而維持細(xì)胞正常的生理代謝，蔗糖作為糖代謝的中間產(chǎn)物同時(shí)也具有維持細(xì)胞滲透壓抵抗脫水脅迫的功能，海藻糖含量的升高能維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定從而抵御脫水脅迫，麥芽糖在脫水脅迫中發(fā)揮的作用最小，其含量極低并很快被消耗殆盡。

2.3 ?離體脫水條件下木薯種莖中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，在脫水脅迫下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，合成6-磷酸磷酸海藻糖的關(guān)鍵基因6-磷酸海藻糖合成酶（圖4A）在甘油處理組中起始表達(dá)水平最高，隨后平穩(wěn)表達(dá)約與對(duì)照組起始水平相同，而在對(duì)照組中，僅在實(shí)驗(yàn)處理第1天測(cè)得該基因的表達(dá)。

嚴(yán)重的脫水脅迫促進(jìn)了糖酵解基因的表達(dá)，在對(duì)照組中，與糖酵解相關(guān)基因6-P葡萄糖糖異構(gòu)酶（圖4C）、己糖激酶（圖4D）、6-磷酸果糖激酶（圖4E）、丙酮酸激酶（圖4G）都表達(dá)較為活躍，呈不斷上升趨勢(shì)，但都僅在前20 d表達(dá)，而這些基因在甘油處理的木薯種莖中則表達(dá)穩(wěn)定且波動(dòng)較小，在30 d仍能穩(wěn)定表達(dá)。

與糖異生有關(guān)的基因6-P葡萄糖糖異構(gòu)酶（圖4C）在對(duì)照組中的表達(dá)極為活躍，在10 d的表達(dá)量是初始表達(dá)量的27倍，但在20 d和30 d未測(cè)到該基因表達(dá)，而該基因在甘油處理組中的表達(dá)呈現(xiàn)先緩慢上升后急劇下降。1，6二磷酸果糖酶（圖4H）在對(duì)照組中僅在處理第1天測(cè)得該基因表達(dá)，而在甘油處理組中該基因能在處理組中穩(wěn)定表達(dá)但表達(dá)水平不足對(duì)照組的一半。磷酸丙酮酸水合酶基因（圖4I）在對(duì)照組中呈不斷下降且僅在離體脫水脅迫前10 d表達(dá)，而在處理組中該基因表達(dá)較為穩(wěn)定起伏波動(dòng)較小。

在脫水脅迫下與蔗糖水解相關(guān)的β-呋喃果糖苷酶基因（圖4B）在對(duì)照組中均有表達(dá)且在脫水脅迫20 d表達(dá)量急劇增加至初始表達(dá)量的9倍左右，其它時(shí)間的表達(dá)水平和初始表達(dá)水平相近。而在甘油處理組中，該基因的表達(dá)趨勢(shì)先下降后緩慢上升，且各階段的表達(dá)水平均低于對(duì)照組。

分解麥芽糖的麥芽糖化酶基因（圖4F）僅在前10 d測(cè)得該基因的表達(dá)，在10 d的表達(dá)量約為起始表達(dá)量的3倍，而在甘油處理組中的表達(dá)水平較對(duì)照組低，表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)先緩慢升高后緩慢降低。

離體脫水脅迫下糖酵解基因在對(duì)照組中活躍表達(dá)可以為木薯種莖正常的生理代謝提供必要的能量，脫水脅迫下海藻糖含量的增加能提高細(xì)胞滲透壓。而甘油處理組的含水量較對(duì)照組高，糖酵解基因表達(dá)穩(wěn)定，海藻糖含量低于對(duì)照組，表明甘油處理可以降低脫水脅迫對(duì)木薯種莖的不利影響。因此，用甘油處理木薯種莖是一種有效的方法來提高木薯種莖的活性從而延長(zhǎng)木薯種莖的貯藏時(shí)間。

3 ?討論

對(duì)于植物來說，干旱是一種主要的環(huán)境脅迫，它阻礙了植物的生長(zhǎng)，降低果實(shí)產(chǎn)量，嚴(yán)重的干旱脅迫會(huì)使植物死亡。而對(duì)大豆、水稻、百合花等植物的干旱脅迫的研究主要停留在對(duì)植物葉、根、球莖等部位[9， 14-15]。木薯是一種耐熱耐干旱耐貧瘠的經(jīng)濟(jì)作物，木薯種莖繁殖是木薯目前唯一的繁殖方式，但采后木薯種莖如何應(yīng)對(duì)脫水脅迫仍然未知，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采收后的木薯種莖內(nèi)生理活性的變化和糖酵解基因表達(dá)等進(jìn)行了系統(tǒng)的分析研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在受脅迫較為嚴(yán)重的對(duì)照組中糖酵解基因活躍表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)海藻糖對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)最為強(qiáng)烈。

在各類可溶性糖對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)的研究中，研究較多的是蔗糖、海藻糖以及可溶性糖總含量在葉片、根莖中怎么響應(yīng)干旱脅迫[11， 21]。在對(duì)木薯葉片的滲透脅迫耐性研究中發(fā)現(xiàn)海藻糖是比蔗糖、葡萄糖和果糖更重要的滲透壓調(diào)節(jié)因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，采收后的木薯種莖在脅迫處理的前20 d，葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖的含量隨著實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間的延長(zhǎng)不斷減少，僅有海藻糖的含量是在不斷增加。因此海藻糖對(duì)干旱脅迫中的響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它糖類。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組中，合成T6P的關(guān)鍵基因海藻糖-6-磷酸合成酶基因僅在第1天表達(dá)，但離體脅迫前20 d海藻糖含量隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)其含量不斷增加，因此推測(cè)還有其它更穩(wěn)定快速的代謝通路在脫水脅迫條件下誘導(dǎo)海藻糖的合成。而在脅迫處理20～30 d海藻糖的含量大量減少，分析推測(cè)在脫水脅迫前20 d木薯種莖通過合成海藻糖提升植株本身的抗逆能力，在干旱脅迫后期木薯種莖中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被充分消耗，則海藻糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖來維持木薯種莖正常的生理代謝。同時(shí)推測(cè)采收后20～30 d保水處理組中，D-葡萄糖、果糖、蔗糖含量的大幅增加是由于海藻糖的分解和木薯種莖側(cè)芽逐漸失活減少了對(duì)糖分的消耗。

海藻糖在響應(yīng)干旱脅迫中具有維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞的優(yōu)良特性[23]，因此有研究將海藻糖合成基因轉(zhuǎn)入水稻和煙草中，轉(zhuǎn)基因植株沒有發(fā)生毒副反應(yīng)并且提高了水稻和煙草的耐旱性[13-14]。因此將海藻糖合成基因通過基因工程轉(zhuǎn)入重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物中，提高作物的抗旱性從而提升作物產(chǎn)量是一條行之有效的方法。

本實(shí)驗(yàn)通過甘油保水處理提高了木薯種莖的貯存時(shí)間，是一種有效的提高木薯貯藏時(shí)間的方法。但同時(shí)甘油處理不能抑制側(cè)芽的生長(zhǎng)從而大量消耗木薯種莖內(nèi)有限的養(yǎng)分，后續(xù)試驗(yàn)可以探索能否通過甘油處理木薯種莖兩端和控制環(huán)境含水量或者噴灑激素抑制側(cè)芽生長(zhǎng)相結(jié)合的方法來提升木薯種莖的貯藏時(shí)間，以及通過基因工程增強(qiáng)木薯合成海藻糖的基因在干旱脅迫下的表達(dá)，從而增強(qiáng)木薯植株的抗旱能力，進(jìn)而延長(zhǎng)采收后木薯種莖的保藏時(shí)間及在干旱脅迫下增加木薯的產(chǎn)量。同時(shí)，木薯內(nèi)合成海藻糖的相關(guān)基因是一種優(yōu)質(zhì)的基因資源，篩選和改造這些基因使其可以在其它經(jīng)濟(jì)作物內(nèi)表達(dá)從而提升作物的抗旱性，為植物的抗旱研究提供一種新方法。

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