肖健 陳思宇 孫妍 楊尚東 譚宏偉

摘 ?要：解析甘蔗間作不同豆科作物對甘蔗植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響，旨在評價甘蔗間作不同豆科作物對甘蔗植株健康狀況及抗性的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單作的甘蔗（CK）相比，甘蔗間作黃豆顯著提高甘蔗內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富度;間作綠豆雖然有助于提升甘蔗植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性與豐富度，但與CK之間無顯著差異;間作花生導(dǎo)致甘蔗植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性與豐富度顯著降低。門分類水平，與CK相比，間作處理甘蔗植株中變形桿菌門（Proteobacteria）內(nèi)生細(xì)菌豐度占比急劇下降，放線菌門（Actinobacteria）以及屬于其他（others）分類的內(nèi)生細(xì)菌豐度占比上升;屬分類水平，與CK相比，間作處理甘蔗植株中泛菌屬（Pantoea）和Burkholderia-Paraburkholderia屬豐度占比下降，紅球菌屬（Rhodococcus）內(nèi)生細(xì)菌豐度占比上升;另一方面，unclassified_f__Micrococcaceae和Pseudarthrobacter是間作甘蔗植株中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬，但同時草螺菌屬（Herbaspirillum）和Williamsia屬內(nèi)生細(xì)菌缺失。此外，Rubrobacter、norank_f__MSB-1E8、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、norank_c__Actinobacteria、norank_f__Euzebyaceae、Gaiella、Defluviicoccus、norank_f__Elev-16S-1332、norank_o__Acidimicrobiales、norank_f__Propionibacteriaceae、norank_o__Gaiellales、norank_f__Gemmatimonadaceae是甘蔗/黃豆間作（A）處理中甘蔗植株特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬;鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬賽菌屬（Massilia）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Sinomonas、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、金黃色桿菌屬（Chryseobacterium）、根霉菌屬（Rhizomicrobium）是甘蔗/綠豆間作（B）處理中甘蔗特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬。甘蔗/花生間作模式下，甘蔗植株根系中不存在特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬;而草螺菌屬（Herbaspirillum）和Williamsia是甘蔗單作模式下甘蔗植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬。甘蔗間作黃豆和綠豆不僅有助于提升甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與豐富度，而且改善了甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，尤其間作黃豆效果更佳;與之相反，甘蔗間作花生無助于提高甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與豐富度，亦不利于改善甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。

關(guān)鍵詞：甘蔗;豆科作物;間作;內(nèi)生細(xì)菌

中圖分類號：S566.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： To evaluate the effects of intercropping with different legume crops on the health and resistance of sugarcane plants，endophytic bacterial diversity in the roots of sugarcane were analyzed. The diversity and richness of endophytic bacteria in the roots of sugarcanes under sugarcane / soybean intercropping system were significantly increased than those of monoculture （CK）. Even though the diversity and richness of endophytic bacteria in the roots of sugarcanes under sugarcane / mung bean system were higher than those of CK， there was no significant differences between each other. Moreover， they were significantly decreased under sugarcane / peanut systems compared to CK. At the phylum level， the abundances of Proteobacteria， Actinobacteria and the phylum of other were all increased under sugarcane intercropping systems compared to CK. At the genus level， the abundances of Pantoea and Burkholderia- Paraburkholderia were decreased， but that of Rhodococcus was increased under sugarcane intercropping systems compared to CK. In addition， compared to CK， the unclassified_f__Micrococcaceae and Pseudarthrobacter were the specific dominant endophytic bacterial genera， but also lost the Herbaspirillum and Williamsia in roots of sugarcanes under different intercropping systems. Moreover， the Rubrobacter， norank_f__MSB-1E8， Nocardioides， norank_c__Actinobacteria， norank_f__Euzebyaceae， Gaiella， Defluviicoccus， norank _f__Elev-16S-1332， norank_o__Acidimicrobiales， norank_f__Propionibacteriaceae， norank_o__Gaiellales， norank_f__Gemmatimonadaceae were the specific dominant endophytic bacterial genera in roots of sugarcanes under sugarcane/soybean intercropping （A） system. The Streptomyces， Massilia， Mycobacterium， Methylobacterium， Sinomonas， Rhodanobacter， Chryseobacterium and Rhizomicrobium were the specific dominant endophytic bacterial genera in roots of sugarcanes under sugarcane/mung bean intercropping （B） system. And there were no specific dominant endophytic bacterial genera in roots of sugarcanes under sugarcane/peanut intercropping （C） system. However， the Herbaspirillum and Williamsia were the specific dominant endophytic bacterial genera in roots of sugarcanes under monoculture （CK） system. The diversity and richness of endophytic bacteria were not only promoted， but also the composition of endophytic bacterial communities in roots of sugarcanes was improved by intercropping with soybean and mung bean. In particularly， the better effect was intercropping with soybean. By contrast， not only the diversity and richness， but also the composition of endophytic bacterial communities in roots of sugarcanes was all deceased under sugarcane/peanut intercropping system.

Keywords： sugarcane （Saccharum spp. hybrids）; legume crops; intercropping; endophytic bacteria

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.018

甘蔗（Saccharum spp. hybrids）是一種重要的糖料作物，在世界各地被用作生物燃料和可再生生物能源[1]。中國是世界上僅次于巴西和印度的第三大產(chǎn)糖國家。中國甘蔗大約90%種植于華南與西南地區(qū)，包括廣西、廣東和云南。特別是廣西，自1993年以來，是中國最大的甘蔗生產(chǎn)和制糖省份，占全國糖產(chǎn)量的65%以上[2]。然而，與世界產(chǎn)糖大國相比，我國甘蔗單位面積產(chǎn)量偏低仍然是制約我國蔗糖產(chǎn)業(yè)國際市場競爭力的一大問題。為了提高甘蔗產(chǎn)量，我國蔗民盲目使用化肥。例如，我國甘蔗生產(chǎn)中年均氮肥用量高達(dá)600～800 kg/hm2，而產(chǎn)糖大國巴西，相應(yīng)的施用量僅為60 kg/hm2，即使是宿根蔗的用量亦僅為80～120 kg/hm2[3]。另一方面，過度施用化肥不僅土壤生態(tài)系統(tǒng)失衡，亦會破壞水生生態(tài)系統(tǒng)功能[4]。因此，甘蔗生產(chǎn)中，如何減少化肥，尤其是氮肥的投入，提高單位面積甘蔗產(chǎn)量，是廣西甘蔗可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。

間作是在同一塊地里同時種植兩種或兩種以上的作物，雖然是一種古老的種植制度，但至今仍在世界各地廣泛實施[5]。間作模式不僅為種植系統(tǒng)帶來了有計劃的植物多樣性，而且提升了種植系統(tǒng)應(yīng)對環(huán)境壓力和病蟲害的能力[6]。唐秀梅等[7]發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)階段國內(nèi)外甘蔗間作種植模式主要包括甘蔗/豆科作物（甘蔗/大豆、豌豆、花生）、甘蔗/禾本科（甘蔗/玉米、小麥）、甘蔗/蔬菜（甘蔗/馬鈴薯、芥菜、洋蔥、大蒜）等;至今的研究已發(fā)現(xiàn)，間作模式不僅可以提高作物對光、水、土、肥的利用效率，改善土壤狀況，而且顯著提高了土壤微生物數(shù)量和微生物多樣性;但大部分涉及甘蔗間作的研究主要集中在甘蔗產(chǎn)量效益、光合品質(zhì)、土壤肥力以及病蟲草害等方面[8-9]。

另一方面，植物內(nèi)生細(xì)菌是指在其生活史的一定階段或全部階段，生活于健康植物的各種組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌[10]。植物內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物關(guān)系密切，內(nèi)生細(xì)菌還具有溶磷、解鉀、固氮等作用以及產(chǎn)生鐵載體、抗菌活性物質(zhì)和植物生長激素來促進(jìn)宿主植物生長、營養(yǎng)物質(zhì)積累和提高抗逆性（抗病蟲害、高溫、鹽堿或干旱等）[11]，內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)一定程度上具有指示甘蔗植株健康生長與否以及抗性大小的作用。然而，至今，甘蔗間作對指示甘蔗植株健康生長狀況以及抗性大小的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮見報道。

為此，本文基于高通量測序技術(shù)，分析甘蔗與不同豆科作物間作模式下，甘蔗植株內(nèi)生細(xì)菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化規(guī)律，旨在為改良甘蔗產(chǎn)區(qū)土壤環(huán)境、改進(jìn)栽培管理技術(shù)措施以及開發(fā)利用內(nèi)生細(xì)菌抗逆和促生等功能提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗地概況

試驗于2017年和2018年在廣西壯族自治區(qū)崇左市龍州縣西郊的廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)場（106°47′34″ E，22°19′42″ N）進(jìn)行。試驗地屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，熱量豐富，雨量充沛，日照充足，冬春微寒，夏炎多雨，秋季溫涼，干濕季分明，濕熱、干冷同季;年無霜期為350 d，有霜期13 d，年平均溫度約22 ℃，年降水量約1273.6 mm;第四紀(jì)紅壤土，前作為甘蔗。采樣地土壤理化性質(zhì)如下：土壤pH 6.2，有機(jī)質(zhì)含量23.3 g/kg，土壤全氮含量1.77 g/kg，速效磷含量12.4 mg/kg，速效鉀含量66.1 mg/kg。

1.2 ?試驗設(shè)計

以甘蔗品種‘新臺糖22’為試驗材料，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計4種種植模式，以甘蔗單作作為對照（CK），以甘蔗/黃豆間作（A），甘蔗/綠豆間作（B），甘蔗/花生間作（C）為處理進(jìn)行田間試驗。每種種植模式為一個試驗處理，共4個處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)，共12個小區(qū)，每個小區(qū)5行，行長7 m，甘蔗栽培行距1.8 m，小區(qū)面積63 m2。試驗地用大型拖拉機(jī)犁耙整地開行后于2018年3月30日種植。甘蔗行間分別栽種黃豆（‘桂春10號’）、綠豆（‘中綠8號’）和花生（‘桂花1026’），所有間作處理均按相同常規(guī)田間管理。

1.3 ?樣品采集

2018年5月30日，于甘蔗栽培區(qū)隨機(jī)采集甘蔗植株樣品。采集甘蔗植株樣品時，先用75%乙醇噴灑鐵鏟進(jìn)行消毒，在每種間作模式下隨機(jī)選取3株長勢一致的甘蔗植株，然后以蔗莖為中心（直徑約60 cm）挖深度約40 cm，形成疏松、環(huán)形的根際圈，然后手握植株莖基部用力將整個植株連根帶土拔起，并抖掉附著在根部的土壤，整個蔗兜放入無菌密封袋后，裝入放有冰袋的冰盒中標(biāo)記并帶回實驗室[12]。植株樣品用無菌水沖洗表面的泥土和附屬物并用無菌濾紙吸干，然后采用75%酒精噴灑消毒后的剪刀采集植株根部樣品，待測。

1.4 ?土壤細(xì)菌多樣性分析

根系內(nèi)生細(xì)菌總DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測定均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。測序具體類型與引物序列[13-14]如表1所示。具體測序流程：DNA抽提和PCR擴(kuò)增：根據(jù)FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，USA）說明書進(jìn)行總DNA抽提，使用NanoDrop2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測DNA濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR產(chǎn)物鑒定、純化及定量。IlluminaMiseq測序：回收PCR產(chǎn)物（2%瓊脂糖凝膠），使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，USA）純化，Tris-HCl洗脫，電泳檢測，并用Quantus? Fluorometer （Promega，USA）對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量，構(gòu)建PE2*300的文庫。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，具體流程如下：接頭鏈接;使用磁珠篩選去除接頭自連片段;利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集;磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina測序公司MiseqPE300平臺進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。本研究以Shannon和Simpson指數(shù)指示內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，Chao1和Ace指數(shù)指示內(nèi)生細(xì)菌的豐富度。參考Chao等[15]的方法計算Chao1指數(shù)，參考Grice等[16]的方法計算Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)：參考Simpson[17]的方法計算Simpson指數(shù)，Chao1、Ace和Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種豐富度和多樣性越高。

1.5 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行計算，采用IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，采用鄧肯（Duncan’s）法進(jìn)行顯著性檢驗（P< 0.05），并利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。平均數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同間作模式下甘蔗內(nèi)生細(xì)菌OTU聚類分析

基于高通量測序技術(shù)分析，在97%相似度水平對樣品序列進(jìn)行OTU聚類。由表2可知，不同間作模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落隸屬于23門、49綱、117目、244科、432屬、679種、1010 OTU（分類操作單元）。其中，甘蔗/黃豆間作模式（A）下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落隸屬于21門、41綱、98目、194科、323屬、502種和712 OTU;甘蔗/綠豆間作模式（B）下，甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌群落隸屬于19門、33綱、77目、157科、270屬、370種和487 OTU;甘蔗/花生間作模式（C）下，甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌群落隸屬于12門、23綱、57目、109科、170屬、235種和285 OTU，甘蔗單作模式（CK）下，甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌隸屬于15門、28綱、76目、146科、231屬、338種和447 OTU。上述結(jié)果表明：甘蔗與黃豆、綠豆間作有助于提高甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌的分類數(shù)量，但甘蔗與花生間作不僅無助于提高甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌的分類數(shù)量，反而導(dǎo)致根系內(nèi)生細(xì)菌分類數(shù)量降低。

2.2 ?不同種植模式下甘蔗內(nèi)生細(xì)菌Alpha分析

基于美吉云分析平臺，計算不同間作模式下，甘蔗內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)。以Shannon和Simpson指數(shù)指示細(xì)菌的多樣性，Chao1和Ace指數(shù)指示細(xì)菌的豐富度。由表3可知，與CK相比，A模式下，甘蔗植株根系指示內(nèi)生細(xì)菌多樣性的香農(nóng)指數(shù)顯著高于相應(yīng)的CK，辛普森指數(shù)顯著低于相應(yīng)的CK;而指示內(nèi)生細(xì)菌豐富度的Chao1指數(shù)同樣顯著地高于相應(yīng)的CK，Ace指數(shù)雖然高于相應(yīng)的CK，但差異不顯著;B模式下，甘蔗植株根系中指示內(nèi)生細(xì)菌多樣性的香農(nóng)指數(shù)雖然高于相應(yīng)的CK，但差異不顯著，辛普森指數(shù)則顯著低于相應(yīng)的CK;指示內(nèi)生細(xì)菌豐富度的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于相應(yīng)的CK，但差異均不顯著;C模式下，甘蔗植株根系中指示內(nèi)生細(xì)菌多樣性的香農(nóng)指數(shù)低于相應(yīng)的CK，但差異不顯著;但辛普森指數(shù)顯著高于相應(yīng)的CK;同時，指示內(nèi)生細(xì)菌豐富度的Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著低于相應(yīng)的CK;另一方面，不同間作處理之間，A模式下，甘蔗植株根系中指示內(nèi)生細(xì)菌多樣性的香農(nóng)和辛普森指數(shù)雖然與B模式之間無顯著差異，但均顯著高于或低于相應(yīng)的C模式間作處理;此外，指示甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌豐富度的Ace和Chao1指數(shù)亦以甘蔗間作黃豆處理為最高，依次分別為B和C處理，且不同間作處理間除Ace指數(shù)在B和C處理之間無顯著差異外，其余間作處理間均存在顯著差異。上述結(jié)果表明，甘蔗和黃豆間作提升甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度的效果最佳，其次為甘蔗/綠豆;甘蔗與花生間作不僅無助于提升甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富度，反而導(dǎo)致甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度降低。

2.3 ?群落組成分析

2.3.1 ?不同間作模式下甘蔗內(nèi)生細(xì)菌門分類水平優(yōu)勢群落分析 ?門分類水平，不同間作模式甘蔗植株根系中，占比大于1%的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌門分類水平數(shù)量及占比如圖1所示。A、B、C和CK中，甘蔗植株根系中優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌門分類數(shù)量分別為6、5、3和3個。其中，A間作模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢細(xì)菌門豐度占比順序分別為：變形桿菌門（Proteobacteria，46.63%）>放線菌門（Acti?nobacteria，44.59%）>厚壁菌門（Firm-icutes，2.76%）>綠彎菌門（Chloroflexi，1.22%）>芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，1.17%）>Tectom?icro?bia（1.12%）和其他（others，0.87%）。B間作模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢細(xì)菌門豐度占比順序分別為：放線菌門（Acti?nobacteria，46.75%）>變形桿菌門（Proteobacteria，43.75%）>厚壁菌門（Firmicutes，5.26%）>擬桿菌門（Bacteroidetes，1.60%）>酸桿菌門（Acidob?acteria，1.21%）和其他（others，0.35%）;C間作模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢細(xì)菌門豐度占比順序分別為：放線菌門（Actinobacteria，54.65%）>變形桿菌門（Proteo?bacteria，41.45%）>厚壁菌門（Firmicutes，2.06%）和其他（others，0.20%）;CK模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢細(xì)菌門豐度占比順序分別為：變形桿菌門（Proteobacteria，76.39%）>放線菌門（Actinobacteria，18.77%）>厚壁菌門（Firmicutes，3.39%）和其他（others，0.12%）（圖1）。

與CK相比，甘蔗間作黃豆和綠豆不僅引起變形桿菌門（Proteoba?cteria）細(xì)菌豐度占比下降，放線菌門（Actino?bacteria）細(xì)菌豐度占比上升，而且還改變了甘蔗植株根系中優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌的組成，富集了諸如綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmat?imo?nadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和Tectomicrobia門細(xì)菌。與之相反，甘蔗間作花生模式缺乏間作黃豆、綠豆類似的效果，甘蔗間作花生模式中，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢群落組成與對照相仿，均由放線菌門（Actinobacteria）、變形桿菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）組成，僅改變了放線菌門和變形桿菌門的豐度占比。由此推斷，并非所有的甘蔗間作模式均有助于提升甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性、豐富度和改變內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢群落結(jié)構(gòu)組成。

2.3.2 ?不同間作模式下甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌屬分類水平優(yōu)勢菌群分析 ?屬分類水平，不同間作模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌豐度占比大于1%的優(yōu)勢細(xì)菌屬數(shù)量及占比如圖2所示。A、B、C和CK處理中，甘蔗植株根系中優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬分類數(shù)量分別為24、23、10和10個。

與對照的甘蔗單作相比，甘蔗間作不同豆科作物后，甘蔗植株根系中泛菌屬（Pant?oea）、Burkholderia-Paraburkholderia屬細(xì)菌豐度占比下降，紅球菌屬（Rhodococcus）豐度占比上升;另一方面，unclassified_f__Micrococca?ceae和Pseudarthrobacter富集成為間作模式下甘蔗植株根系特有的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬;而草螺菌屬（Herbaspirillum）和Williamsia成為單作模式下甘蔗植株根系中特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬。此外，Rubrobacter、norank_f__MSB-1E8、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、norank_c__Actinobacteria、no-ra?nk_f__Euzebyaceae、Gaiella、Defluviicoccus、nora?nk_f__Elev-16S-1332、norank_o__Acidimi?cr?ob-iales、norank_f__Propionibacteriaceae、nor?ank_o__Gaiellales、norank_f__Gemmatimonadac?eae是A模式下，甘蔗植株根系中特有的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬;鏈霉菌屬（Stre?ptomyces）、馬賽菌屬（Massilia）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、甲基桿菌屬（Methylob?acterium）、Sinomonas、羅思河小桿菌屬（Rhodano?bacter）、金黃色桿菌屬（Chryseobacterium）、根霉菌屬（Rhizomicrobium）是B模式下，甘蔗植株根系中特有的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬;此外，C模式下，甘蔗植株根系中不存在豐度占比大于1%的特有優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬類（表4）。

2.4 ?物種Venn分析

基于屬分類水平（圖3A）和種分類水平（圖3B）Venn圖可知，與對照相比，不同間作模式導(dǎo)致甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢細(xì)菌屬和種分類組成發(fā)生顯著變化。其中，A、B、C和CK處理中，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌屬的總數(shù)量分別為323、270、170和231個，特有的內(nèi)生細(xì)菌屬數(shù)量分別為66、45、12和24個。

另一方面，種分類水平，A、B、C和CK模式下，甘蔗植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌種的數(shù)量分別為144、68、23和37個。

上述結(jié)果表明：無論是屬亦或是種分類水平， A和B間作模式下，甘蔗植株根系中特有的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量均高于相應(yīng)的CK處理;與之相比，C間作模式下，甘蔗植株根系中特有的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遜色于相應(yīng)的CK模式。由此推斷，甘蔗間作黃豆和綠豆均有助于富集和提升甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬、種水平，但甘蔗間作花生不僅無提升效果，反而導(dǎo)致甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌屬、種分類水平數(shù)量降低。這一現(xiàn)象可能是甘蔗與花生各自根系分泌物的相互作用有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

2.5 ?群落Heatmap圖分析

選取不同間作模式下，甘蔗植株中根系內(nèi)生細(xì)菌豐度占比居前50的屬繪制豐度熱圖（圖4）。由圖4上方的樣本層級聚類樹顯示，甘蔗/綠豆和甘蔗/花生間作模式下，甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落組成更為相似，獨自聚為一個分支;并分別與甘蔗/黃豆以及對照處理（CK）之間存在差異。其中，甘蔗/黃豆間作模式處理改變甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落組成的效果最強(qiáng)。

3 ?討論

甘蔗是我國乃至世界最重要的糖料及能源作物，也是廣西壯族自治區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一[18]。蔗糖業(yè)為廣西重要經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，是廣西重點發(fā)展的“千億元產(chǎn)業(yè)”[19]之一。

間作制度對作物產(chǎn)量和土壤礦物有效性呈正相關(guān)。研究已表明，間作比相應(yīng)的單作更有利于植株生產(chǎn)力和養(yǎng)分的獲取[20-21]，如我國科研人員在撒哈拉以南非洲地區(qū)等不利于作物生長的環(huán)境下通過谷物/豆類間作讓作物取得了良好的產(chǎn)量與品質(zhì)[22]。

微生物是生態(tài)系統(tǒng)中功能活躍，開發(fā)潛力最大、最寶貴、最豐富的生物資源庫[23]。植物內(nèi)生細(xì)菌除了具有防治病害的發(fā)生之外，還具有促進(jìn)植物生長的作用[24]。至今的研究已發(fā)現(xiàn)，植物根際及內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高時，植物抵御病原菌的綜合能力就越強(qiáng)[25-26]。

本文基于高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與甘蔗單作（CK）相比，甘蔗間作黃豆顯著提高了甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和豐富度;但甘蔗間作綠豆提升甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度的效果遜于間作黃豆;同時，甘蔗間作花生不僅無助于提升甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與豐富度，反而導(dǎo)致甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度下降。實際生產(chǎn)中，甘蔗與許多豆科作物間套作均能獲得良好的經(jīng)濟(jì)收益[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，禾本科作物與豆科作物間作可通過豆科作物生物固氮而提高禾本科作物產(chǎn)量[29-34]。楊建波[35]亦研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗/大豆間作系統(tǒng)中，特別是間作共生期，通過根瘤的衰老解體以及根系分泌物的增加，增加了根際細(xì)菌、根瘤菌等的遷移，從而使得甘蔗根系內(nèi)生細(xì)菌、根瘤菌的數(shù)量增大。由此推測，與甘蔗單作相比，甘蔗和黃豆和綠豆間作通過促進(jìn)根際細(xì)菌的富集與遷移來使根系內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量升高，但甘蔗與花生間作可能缺乏同樣的效果，從而無助于提升甘蔗根系的內(nèi)生細(xì)菌多樣性與豐富度。

與甘蔗單作（CK）相比，門分類水平，甘蔗間作其它作物不僅改變了甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌組成的豐度占比，如：變形桿菌門（Proteo?ba-cteria）細(xì)菌占比下降，放線菌門（Actinobacteria）細(xì)菌占比上升，而且改變了甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌的群落組成。與甘蔗單作（CK）相比，綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemm?atim?onadetes）和Tectomicrobia門細(xì)菌是甘蔗/黃豆間作（A）模式下甘蔗植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢門類;擬桿菌門（Bacteroidetes）和酸桿菌門（Acidobacteria）細(xì)菌則是甘蔗/綠豆間作（B）模式下甘蔗植株根系特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢門類;甘蔗/花生間作模式下甘蔗植株根系中不存在特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢門類。

同樣與甘蔗單作（CK）相比，屬分類水平，甘蔗間作其他作物亦改變了甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌組成的豐度占比，如：泛菌屬（Pantoea）、Burkholderia-Paraburkholderia占比下降，紅球菌屬（Rhodococcus）占比上升;同時亦改變了甘蔗植株根系中內(nèi)生細(xì)菌群落組成。其中，unclassif-ied_f__Micrococcaceae和Pseudarthrobacter是間作模式下甘蔗植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬，而草螺菌屬（Herbaspirillum）和Williamsia是甘蔗單作模式下甘植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬類。另一方面，Rubrobacter、norank_ f__MSB-1E8、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、norank_c__Actinobacteria、norank_f__Euzebyac-eae、Gaiella、Defluviicoccus、nora?nk_f__Elev-16S- 1332、norank_o__Acidimicrobiales、norank_f__Pr-opionibacteriaceae、norank_o__Gaiellales、nor-ank_f__Gemmatimonadacea為是甘蔗/黃豆間作（A）中甘蔗植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬類;鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬賽菌屬（Mas-silia）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、Sinomonas、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、金黃色桿菌屬（Chryseobacterium）和根霉菌屬（Rhizomi-crobium）是甘蔗/綠豆間作（B）中甘蔗植株根系中特有的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬類;甘蔗間作花生（C）模式下，甘蔗植株根系中不存在豐度占比大于1%的特有優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌屬類。

植物內(nèi)生細(xì)菌不僅可以拮抗宿主植物的病原菌，而且可以產(chǎn)生植物激素和鐵載體促進(jìn)宿主植物生長，并進(jìn)一步影響植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝，提高植物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬（Pantoea）細(xì)菌具有產(chǎn)多糖、溶磷、IAA、鐵載體、拮抗病原真菌等特性，具有促進(jìn)植物生長發(fā)育[36]的功能;紅球菌屬（Rhodococcus）具有產(chǎn)類胡蘿卜素、各種酶制劑、維生素、有機(jī)酸等活性物質(zhì)，并具有代謝多樣性和提升對多變環(huán)境條件的獨特適應(yīng)能力，在生物修復(fù)、生物轉(zhuǎn)化和生物催化中具有潛在的應(yīng)用前景[37]。而Pseudarthr-obacter屬細(xì)菌從沙漠中分離出來，具有較強(qiáng)的耐旱、耐紫外線照射等的抗逆能力[38]。此外，類諾卡氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等細(xì)菌具有溶磷、產(chǎn)鐵載體以及固氮功能[39]，對植物生長具有良好的促生功能。

綜上所述，甘蔗間作黃豆和綠豆不僅有助于提升甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與豐富度，而且改善了甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，尤其間作黃豆效果更佳;與之相反，甘蔗間作花生不僅無助于提高甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與豐富度，而且不利于改善甘蔗植株根系內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。

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