郭靜遠(yuǎn) 趙輝 屈靜 張麗麗 郭安平

摘 ?要：狗尾草是重要的模式植物，是研究C4光合作用的優(yōu)秀模型，具有熱帶植物的典型特征。U6啟動(dòng)子主要用于構(gòu)建RNAi和CRISPR表達(dá)載體，有啟動(dòng)干擾發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達(dá)和基因編輯引導(dǎo)序列復(fù)合結(jié)構(gòu)的表達(dá)的作用，該啟動(dòng)子具有特殊的啟動(dòng)位點(diǎn)G，能夠保證轉(zhuǎn)錄后RNA結(jié)構(gòu)的完整性。隨著CRISPR 技術(shù)的發(fā)展，利用狗尾草進(jìn)行基因編輯的研究日益增多和深入，目前還沒有針對狗尾草U6啟動(dòng)子的克隆及功能鑒定。U6啟動(dòng)子具有種屬特異性，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，使用轉(zhuǎn)化物種本身或親緣物種的U6啟動(dòng)子能取得更高的的啟動(dòng)效率，本研究克隆了狗尾草2個(gè)U6啟動(dòng)子基因，并構(gòu)建不同序列長度的U6啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化狗尾草胚性愈傷，瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證表明，克隆出的2個(gè)狗尾草 U6啟動(dòng)子在狗尾草上具有很強(qiáng)的啟動(dòng)效率;并且將該載體轉(zhuǎn)化狗尾草后，獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)GUS基因的轉(zhuǎn)基因植株;將該U6啟動(dòng)子用于構(gòu)建狗尾草PDS基因CRISPR編輯載體，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)的白化苗，說明克隆的狗尾草U6啟動(dòng)子能夠很好的啟動(dòng)基因編輯載體的轉(zhuǎn)錄。

關(guān)鍵詞：狗尾草;U6啟動(dòng)子;CRISPR系統(tǒng);RNA干擾

中圖分類號(hào)：Q949.748.5 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Setaria viridis is an important model plant and an excellent model for C4 photosynthesis， which has typical characteristics of tropical plants. U6 promoter is mainly used to construct RNAi and CRISPR expression vectors. It has the function of initiating the expression of the interference hairpin structure and the expression of the compound struc-ture of the gene editing guide sequence. The promoter has a special start site G， which can ensure the integrity of the RNA structure after transcription. With the development of CRISPR technology， there are more and more researches on gene editing by Setaria viridis. At present， there is no cloning and functional identification of U6 promoter of S. viridis. The U6 promoter is species-specific. In transgenic technology， using the U6 promoter of the transformed species itself or relative species can achieve higher activation efficiency. In this study， two U6 promoter genes of S. viridis were cloned， and U6 promoter sequences with different length were constructed to drive GUS gene expression. GUS fusion expression vector was transformed into embryogenic callus of S. viridis， and the transient expression verification showed that the two cloned U6 promoters of S. viridis had strong activation efficiency on S. viridis. After the vector was transformed into S. viridis， the transgenic plants were obtained which could stably expressing GUS gene. The U6 promoter was used to construct CRISPR editing vector of PDS gene of S. viridis， and the albino seedlings with stably expressing GUS gene were obtained， which indicated that the cloned U6 promoter of S. viridis could well start the tran-scription of gene editing vector.

Keywords： Setaria viridis; U6 promoter; CRISPR system; RNA interference

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.0014

由于許多糧食作物為禾本科、單子葉植物，而傳統(tǒng)的模式植物擬南芥則為雙子葉植物，與單子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在雙子葉模式植物中研究單子葉植物的基因功能時(shí)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)同家族基因功能的嚴(yán)重分化，甚至基因功能完全相反。因此，在擬南芥中對單子葉植物基因功能的研究，離最終農(nóng)作物中的應(yīng)用還很遠(yuǎn)。而單子葉的狗尾草（Setaria viridis）具有雙子葉模式植物擬南芥作為模式植物的優(yōu)點(diǎn)，比如生長周期短、植株矮小、易于種植、容易轉(zhuǎn)化、基因組小、二倍體、能產(chǎn)生大量自交系種子等;因此狗尾草是優(yōu)良的研究單子葉植物的模型;此外狗尾草是C4植物，而擬南芥是C3植物，因此狗尾草還是研究C4植物的模式植物;它起源于熱帶，與谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草類親緣關(guān)系接近，更是谷子（Setaria italica）的野緣近親種，亦是研究人工選擇對作物進(jìn)化影響的模式植物;狗尾草對非生物脅迫耐受能力強(qiáng)，抗性基因豐富，是研究耐旱、耐熱、耐鹽等脅迫反應(yīng)的重要模式;狗尾草與重要的能源作物柳枝稷、芒草等黍亞科草類形態(tài)學(xué)上非常相似，因此狗尾草還是研究這些能源草類的重要模式植物[1-10]。

U6啟動(dòng)子是二型啟動(dòng)子，與真核生物RNA聚合酶III結(jié)合后，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄U6 RNA，這類啟動(dòng)子的特點(diǎn)是幾乎所有啟動(dòng)子元件（除了+1位的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)）都位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，也即它對轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)后的序列無特殊選擇或要求，能保證轉(zhuǎn)錄序列的結(jié)構(gòu)特征。U6啟動(dòng)子+1位是鳥苷酸。RNA聚合酶III啟動(dòng)子識(shí)別的終止信號(hào)是連續(xù)4～5個(gè)胸苷酸，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物末端一般有4個(gè)尿苷酸。幾乎所有的真核生物都具有U6啟動(dòng)子，U6啟動(dòng)子在真核生物體內(nèi)一般是啟動(dòng)小片段的表達(dá)，不帶PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA，經(jīng)剪切后產(chǎn)生成熟siRNA，產(chǎn)生干擾效果;shRNA的表達(dá)量取決于啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，與同類的RNA聚合酶III的啟動(dòng)子H1相比，U6啟動(dòng)子啟動(dòng)能力更強(qiáng)，表達(dá)時(shí)間也長。

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，U6啟動(dòng)子多用在構(gòu)建RNAi表達(dá)載體上，用于啟動(dòng)干擾發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達(dá);此外，隨著基因編輯技術(shù)的興起，U6啟動(dòng)子也被開始廣泛用于CRISPR系統(tǒng)中引導(dǎo)序列復(fù)合RNA結(jié)構(gòu)（CrRNA+sgRNA）轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)表達(dá)，以保證引導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)特征。U6啟動(dòng)子具有種屬特異性，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，使用轉(zhuǎn)化物種本身或接近物種的U6啟動(dòng)子能取得更高的啟動(dòng)效率。有研究表明，U6啟動(dòng)子有幾個(gè)明顯的特點(diǎn)[11]：（1）具有TATA box，位于–30～25 bp，被Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄;（2）在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游–66～47 bp處存在PSE （proximal sequence element），該元件是snRNA激活因子蛋白復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn);（3）在–244～214 bp處存在DSE（distal sequence element）;（4）啟動(dòng)子下游存在5-TTTT-3序列為Pol III提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào);（5）PSE和DSE之間的距離變化可顯著影響轉(zhuǎn)錄效率;（6）+1位的G對轉(zhuǎn)錄效率影響較大。根據(jù)這些特點(diǎn)，在使用U6啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，U6啟動(dòng)子的長度最好在300 bp左右，盡量不改變PSE和DSE的間距，同時(shí)保留TATA box和+1位的G，在下游應(yīng)有5-TTTTT-3序列作為終止信號(hào)。另外可以根據(jù)需要在啟動(dòng)子上游或終止信號(hào)下游設(shè)計(jì)測序引物序列、酶切位點(diǎn)等等。

通常首選PDS基因作為開展植物基因組編輯體系建立時(shí)的靶標(biāo)基因。原因在于：1）PDS基因是類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，其可催化無色的八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩念惡}卜素[12]，即如果PDS基因突變后，純合體表型就會(huì)變?yōu)槿庋劭梢姷陌咨?，方便開展后續(xù)研究;2）PDS基因在植物基因組中以單拷貝形式存在[13]，方便設(shè)計(jì)sgRNA（small guide RNA）的靶位點(diǎn)，可以節(jié)省人力物力。

正因?yàn)楣肺膊葑鳛槟Ｊ街参锏闹匾?，因此本研究克隆了狗尾?個(gè)U6啟動(dòng)子基因，并構(gòu)建不同序列長度的U6啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，驗(yàn)證U6啟動(dòng)子在狗尾草體內(nèi)能否正常啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，同時(shí)，將克隆的啟動(dòng)子用于構(gòu)建狗尾草PDS基因CRISPR編輯載體，驗(yàn)證它們在啟動(dòng)基因編輯載體轉(zhuǎn)錄上的能力。為后續(xù)在狗尾草中通過基因編輯來驗(yàn)證基因功能時(shí)奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以狗尾草A10品系為實(shí)驗(yàn)材料，材料由美國Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?U6啟動(dòng)子的克隆 ?在https：//phytozome.jgi. doe.gov網(wǎng)站上，用擬南芥AtU6啟動(dòng)子的snRNA序列（gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaa gattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatgg tccaaatttt）與狗尾草的基因組（Setaria viridis v1.1）序列進(jìn)行比對（BLAST）。檢查比對結(jié)果，從中挑選出序列同源性大于95%的位置，下載這些位置的序列信息，并在http：//seqtool.sdsc.edu/CGI/ BW.cgi#！網(wǎng)站上對挑選出的序列進(jìn)行BOXSHADE（盒式）序列分析比對，找到這些啟動(dòng)序列的USE位置和TATA框位置。

在下載的U6啟動(dòng)序列USE和TATA框位置前尋找和設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)參考http：// bioin-fo.ut.ee/primer3-0.4.0/網(wǎng)站，盡量選擇能區(qū)別克隆目標(biāo)啟動(dòng)序列的引物，引物見表1。然后以狗尾草A10品系的DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增到的片段進(jìn)行測序比對。PCR試劑購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，退火設(shè)計(jì)50～55 ℃和55～60 ℃兩個(gè)溫度梯度45 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.2.2 ?融合植物表達(dá)載體的構(gòu)建 ?以帶GUS基因的pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）質(zhì)粒（圖1）為骨架質(zhì)粒，質(zhì)粒由美國Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell實(shí)驗(yàn)室提供;以表1克隆的ETARIA 02_Reverse（Q）和SETARIA 04-Reverse U6（S）啟動(dòng)子序列為模版，設(shè)計(jì)帶骨架質(zhì)粒GUS基因啟動(dòng)子粘性末端的引物（表1）PCR克隆目標(biāo)啟動(dòng)子序列，通過酶切連接將質(zhì)粒GUS基因前的ZmUbi啟動(dòng)子替換為克隆的狗尾草U6啟動(dòng)子，構(gòu)建狗尾草U6啟動(dòng)子與GUS基因融合植物表達(dá)載體。融合植物表達(dá)載體通過DNA測序檢測目標(biāo)啟動(dòng)序列構(gòu)建情況。用限制性內(nèi)切酶SpeI和HindIII雙酶切骨架質(zhì)粒，切膠回收后，用T4連接酶連接雙酶切質(zhì)粒骨架和PCR產(chǎn)物，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測和雙酶切反應(yīng)，兩種驗(yàn)證方法都獲得與目的基因片段大小一致的條帶。表明已成功構(gòu)建狗尾草U6啟動(dòng)子與GUS基因融合植物表達(dá)載體。

1.2.3 ?狗尾草U6啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力驗(yàn)證 ?將對照質(zhì)粒pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH），狗尾草U6啟動(dòng)子與GUS基因融合植物表達(dá)載體pSeU6Q- GUS（SeU6Q-HPH），pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH），轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL1菌株，以狗尾草成熟種子誘導(dǎo)的胚性愈傷為轉(zhuǎn)化外植體材料，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)5 d后取出胚性愈傷進(jìn)行GUS染色觀察，從GUS基因的GUS染色表達(dá)情況評估克隆的U6啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力和表達(dá)活性。同時(shí)，取同等重量的每種愈傷GUS染液的藍(lán)色上清液在620 nm波長（藍(lán)色上清液的最大吸收波長）處測定光吸收值。數(shù)據(jù)、圖標(biāo)處理在Excel 2010下進(jìn)行，通過Sigma Plot 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、差異顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

將對照質(zhì)粒pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH），狗尾草U6啟動(dòng)子與GUS基因融合植物表達(dá)載體pSeU6Q-GUS（SeU6Q-HPH），pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH），農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到狗尾草ME34品系，觀察轉(zhuǎn)基因植株的GUS基因穩(wěn)定表達(dá)情況。

1.2.4 ?狗尾草U6啟動(dòng)子和PDS編輯載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化狗尾草 ?（1）基因編輯載體改造。以pJG310-GG2質(zhì)粒為骨架質(zhì)粒（圖2），質(zhì)粒由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)的Daniel Voytas實(shí)驗(yàn)室提供，以克隆的Q和S啟動(dòng)子序列為模版，設(shè)計(jì)帶AarⅠ酶切位點(diǎn)的引物對，PCR克隆目標(biāo)啟動(dòng)子序列，通過酶切連接將pJG310-GG2質(zhì)粒的TaU6啟動(dòng)子替換為克隆的狗尾草U6啟動(dòng)子，命名為pJG310- Q和pJG310-S。

（2）靶位點(diǎn)的選擇。在https：//phytozome.jgi. doe.gov網(wǎng)站上，用擬南芥PDS基因序列（AF360196）與狗尾草的基因組（Setaria viridis v1.1）序列進(jìn)行比對（BLAST），找到狗尾草PDS基因序列。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識(shí)別PAM序上游約20 nt核苷酸序列的特點(diǎn)，在ORF區(qū)域設(shè)計(jì)帶有限制性酶切位點(diǎn)的靶位點(diǎn)（SvPDScutF：5-TAG TGG TGC TTT CTA GCG GAG GTC TG-3;SvPDScutR：5-AAA ACA GAC CTC CGC TAG AAA GCA CC-3）。

（3）PDS CRISPR編輯表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化狗尾草。將SvPDScutF/R稀釋成100 μmol/L濃度后各取5 μL，混合均勻到PCR管中，放入PCR儀并按下列程序運(yùn)行：95 ℃ 2 min，75 ℃ 2 min，37 ℃ 2 min，25 ℃ 2 min，16 ℃保存。取2 μL產(chǎn)物加198 μL ddH2O即為SvPDS雙鏈片段。利用GoldenGate克隆技術(shù)將SvPDS雙鏈片段克隆到pJG310-Q載體上，反應(yīng)體系為：pJG310-Q 150 ng、SvPDS雙鏈片段2 μL、BsaI 1.5 μL、T4 ligase 1 μL、10×T4 DNA ligase buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 10 min，16 ℃ 15 min，循環(huán)數(shù)為10，37 ℃ 15 min，80 ℃ 5 min，16 ℃保存。測序結(jié)果顯示序列正確。同樣的方法將SvPDS雙鏈片段克隆到pJG310-S載體上，并進(jìn)行終載體的連接。將測序正確質(zhì)粒命名為pTC278- Q-PDS和pTC278-S-PDS并導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1。參考趙輝等[14]的方法，將帶pTC278-Q- PDS和pTC278-S-PDS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL1轉(zhuǎn)化狗尾草ME34品系，觀察PDS基因的編輯情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?狗尾草U6啟動(dòng)子與AtU6啟動(dòng)子snRNA序列比對情況

經(jīng)過https：//phytozome.jgi.doe.gov網(wǎng)站BLAST比對，與AtU6啟動(dòng)子snRNA序列同源性大于95%的狗尾草基因組位置分別位于如下位置：Chr_08（1個(gè)匹配位置），Chr_06（1個(gè)匹配位置），Chr_04（1個(gè)匹配位置），Chr_02（2個(gè)匹配位置），Chr_09（1個(gè)匹配位置）。這6個(gè)高度同源的snRNA位置，其前方DNA序列，很可能是狗尾草U6啟動(dòng)子的所在位置，下載這6個(gè)位置前400～700 bp DNA序列，用http：//seqtool.sdsc. edu/CGI/BW.cgi#！網(wǎng)站進(jìn)行BOXSHADE比對，找到這些啟動(dòng)序列的USE位置和TATA框位置。比對結(jié)果見圖3，高度保守的部位為U6基因的snRNA位置，snRNA位置前端是U6基因的啟動(dòng)子位置，標(biāo)紅色下劃線的保守部位為U6啟動(dòng)子TATA框位置，擬南芥TATA框位置序列為GTTTATA，狗尾草的TATA框位置序列為（G/A） （C/G）TTATA;標(biāo)藍(lán)色下劃線的保守部位為U6啟動(dòng)子USE位置，擬南芥USE位置序列為GTCCC ACATCG，狗尾草USE位置序列為GT（C/A）CC （A/G）（C/T）（A/C）（T/C）CG。比對結(jié)果的保守序列位置表明，這6個(gè)狗尾草U6啟動(dòng)子可能具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能。

2.2 ?狗尾草U6啟動(dòng)子的克隆及融合表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)梯度PCR實(shí)驗(yàn)鑒定，U6啟動(dòng)子Q基因片段最佳退火溫度為60 ℃，S基因片段最佳退火溫度為55 ℃?；厥誕引物對在60 ℃退火條件下的反應(yīng)產(chǎn)物（圖4），回收S引物對在55℃退火條件下的反應(yīng)產(chǎn)物（圖4），測序結(jié)果表明（圖5），PCR克隆的目標(biāo)序列跟預(yù)期序列一致。將之前克隆的S（U6）啟動(dòng)子和Q（U6）啟動(dòng)子，通過酶

切連接將質(zhì)粒GUS基因前的ZmUbi啟動(dòng)子替換為克隆的狗尾草U6啟動(dòng)子S和Q，構(gòu)建狗尾草U6啟動(dòng)子與GUS基因融合植物表達(dá)載體。測序驗(yàn)證結(jié)果表明成功構(gòu)建了U6啟動(dòng)子與GUS基因融合植物表達(dá)載體。

2.3 ?GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化狗尾草胚性愈傷瞬時(shí)表達(dá)情況

觀察GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化狗尾草愈傷后的染色情況，收集胚性愈傷觀察拍照（圖6）。同時(shí)，取同等重量的每種愈傷GUS染液的藍(lán)色上清液在620 nm波長（藍(lán)色上清液的最大吸收波長）處測定光吸收值（表2），差異顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析表明，以農(nóng)桿菌AGL 1進(jìn)行愈傷瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化，目標(biāo)載體啟動(dòng)子Q、S與對照Ubi啟動(dòng)子啟動(dòng)能力差異不顯著（表2）。這表明經(jīng)改造后的2個(gè)U6啟動(dòng)子都可以高效的啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。

2.4 ?GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化狗尾草后的表達(dá)情況

將具有瞬時(shí)高表達(dá)能力的GUS融合表達(dá)載體pSeU6Q-GUS（SeU6Q-HPH）、pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH）載體轉(zhuǎn)化狗尾草，獲得穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，從轉(zhuǎn)基因植株葉片GUS染色可觀察到，克隆的狗尾草U6啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)組成型GUS基因的穩(wěn)定表達(dá)，但穩(wěn)定表達(dá)量不如Ubi組成型啟動(dòng)子的表達(dá)效率高（圖7）。

Ubi是對照載體pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）載體，S是pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH）載體，Q是pSeU6Q-GUS（SeU6Q-HPH）載體，CK是不經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷，為空白對照。

NoteUbi is the control vector pzmubi pZmUbi-GUS （ZmU-bis-HPH）， S is the vector pSeU6S-GUS （SeU6S-HPH）， Q is the vector pSeU6Q-GUS （SeU6Q-HPH）， CK is the callus without transformation， which is the blank control.

2.5 ?PDS CRISPR編輯表達(dá)載體轉(zhuǎn)化狗尾草驗(yàn)證

將帶pTC278-Q-PDS和pTC278-S-PDS質(zhì)粒的PDS基因編輯載體以及含有小麥TaU6啟動(dòng)子的對照載體轉(zhuǎn)化入狗尾草ME34品系，從PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)化苗的再生情況可明顯的觀察到部分轉(zhuǎn)化植株得到了編輯，編輯后的狗尾草苗表現(xiàn)出白化現(xiàn)象（圖8）。這表明PDS基因被編輯后突變了，才會(huì)出現(xiàn)白化苗，同時(shí)也證明了經(jīng)改造后的U6啟動(dòng)子可以很好的啟動(dòng)編輯載體的表達(dá)。

3 ?討論

U6啟動(dòng)子是二型啟動(dòng)子，在生物體內(nèi)與真核生物RNA聚合酶III結(jié)合負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄U6RNA。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，由于U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較高和從G堿基開始轉(zhuǎn)錄的特性，有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，能消除無關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄，大大減少脫靶效應(yīng)[15-17]。U6啟動(dòng)子被使用得越來越多，主要利用于啟動(dòng)RNAi表達(dá)載體的RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄和CRISPR系統(tǒng)引導(dǎo)序列復(fù)合RNA結(jié)構(gòu)（CrRNA+sgRNA）的轉(zhuǎn)錄。Sun等[18]克隆了大豆11個(gè)U6啟動(dòng)子，并將其中的GmU6啟動(dòng)子用于啟動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)化大豆，結(jié)果表明與擬南芥AtU6啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率相比，GmU6啟動(dòng)子誘導(dǎo)的大豆基因編輯效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于擬南芥的AtU6啟動(dòng)子，從3.2%～9.7%提高到14.7%～20.2%。還有研究者為了比較擬南芥和蘋果U6啟動(dòng)子在蘋果中的轉(zhuǎn)錄活性，將AtU6-1P：： LUC和MdU6-10-3P：：LUC載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至蘋果愈傷組織，結(jié)果表明MdU6-10-3P：：LUC轉(zhuǎn)染的愈傷組織熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著高于AtU6-1P：：LUC。說明在蘋果愈傷組織中，蘋果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性高于擬南芥U6啟動(dòng)子[19]，以上結(jié)果都表明使用受體材料本身的U6啟動(dòng)子會(huì)取得更高的基因編輯效率，在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中轉(zhuǎn)錄活性會(huì)存在一定差異。U6啟動(dòng)子雖然有較高的啟動(dòng)效率，但在不同物種中啟動(dòng)效率有差異，并且同一物種有多個(gè)U6啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率也不同[20-21]。

雖然多種植物的U6啟動(dòng)子在CRISPR/Cas9基因編輯體系中得到應(yīng)用，但U6啟動(dòng)子在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中并不適用[22]。目前，還沒有狗尾草內(nèi)源U6啟動(dòng)子介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯體系。本研究克隆了2個(gè)狗尾草U6啟動(dòng)子Q和S，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示克隆的Q（414 bp）和S（204 bp）啟動(dòng)子都能很好的啟動(dòng)RNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄，之所以克隆一個(gè)序列比較短的S啟動(dòng)子，是因?yàn)榍叭搜芯勘砻?，U6啟動(dòng)子在具備必要元件時(shí)即具有轉(zhuǎn)錄活性，反而序列過長可能存在一些抑制因子，使較長的U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性下降[19，23]。番茄上的U6啟動(dòng)子被截取到200 bp左右時(shí)仍具有較高的活性[24]，棉花上的U6啟動(dòng)子截取到105 bp仍具有較高的活性[25]。實(shí)驗(yàn)證明序列比較短的U6（S）啟動(dòng)子甚至能啟動(dòng)組成型基因GUS在狗尾草上的表達(dá)，啟動(dòng)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)量與組成型玉米Ubi啟動(dòng)子啟動(dòng)效率差異不顯著，但在轉(zhuǎn)基因狗尾草上的穩(wěn)定表達(dá)量比組成型玉米Ubi啟動(dòng)子低。這主要是因?yàn)閁6啟動(dòng)子的功能主要是高效啟動(dòng)編輯載體的表達(dá)，在啟動(dòng)過表達(dá)基因的表達(dá)方面沒有組成型啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力更強(qiáng)。但該實(shí)驗(yàn)證明了我們克隆的U6啟動(dòng)子可以正常啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。

狗尾草U6啟動(dòng)子Q和S編輯載體轉(zhuǎn)化狗尾草的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了利用克隆的狗尾草U6啟動(dòng)子可以啟動(dòng)CRISPR編輯載體的表達(dá)，狗尾草PDS基因被成功編輯，轉(zhuǎn)基因狗尾草出現(xiàn)了白化苗，這表明克隆的2個(gè)狗尾草U6啟動(dòng)子都能很好的啟動(dòng)編輯載體的表達(dá)，在狗尾草上都有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄能力，能很好地作為狗尾草及近親轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)的重要啟動(dòng)子工具。

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