竇宏雙 梁曉 陳青 伍春玲 劉迎 范東哲 吳巖

摘 ?要：本研究通過比較二斑葉螨為害前后抗、感螨木薯品種轉錄組差異，篩選差異表達基因，并采用qPCR驗證水楊酸、茉莉酸信號途徑基因的差異表達。轉錄組分析結果表明，與螨害前相比，螨害1、8 d后，抗螨木薯品種C1115的差異表達基因為589、587個，感螨木薯品種BRA900的差異表達基因為1271、930個，C1115相對于BRA900的差異表達基因分別為383、251個。GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因主要顯著集中在次生代謝物質合成、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成和氧化還原反應等過程。qPCR驗證結果顯示，二斑葉螨為害后，抗螨參照標準木薯品種C1115的水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7和NPR3的表達量較為害前呈現(xiàn)先顯著提高后降低的趨勢，而感螨參照標準木薯品種BRA900中上述4個基因的表達始終維持在顯著高于為害前的水平。受螨害后抗螨木薯C1115中茉莉酸信號途徑基因JAR1、LOX2和OPR11的表達量也較為害前顯著提高，而感螨木薯BRA900中這3個基因的表達量則降低至顯著低于螨害前的水平，qPCR驗證結果和轉錄組分析結果相一致。本研究結果表明，抗螨木薯品種C1115受螨害后能夠同時激活水楊酸、茉莉酸信號途徑以抵御二斑葉螨為害，為深入闡明木薯抗螨分子機理，選育和創(chuàng)制抗螨木薯品種提供了理論參考依據(jù)。

關鍵詞：二斑葉螨;抗、感木薯品種;轉錄組分析;水楊酸信號途徑;茉莉酸信號途徑

中圖分類號：S533 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： To the best of our knowledge， there is no report on transcriptome difference while resistant and susceptible cassava cultivars were infested by pests. In this study， by comparing the transcriptome differences of resistant and sus-ceptible cassava cultivars before and after Tetranychus urticae infestation， we screened the differentially expressed genes， and verified the differential expression of salicylic acid and jasmonic acid pathway genes through qPCR. The results of transcriptome analysis showed that there were 589 and 587 differentially expressed genes in mite-resistant cassava cultivar C1115， 1271 and 930 differentially expressed genes in mite-susceptible cassava cultivar BRA900， and 383 and 251 differentially expressed genes between C1115 and BRA900 respectively. In addition， the Go and KEGG enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were significantly enriched in the secondary metabolite biosynthesis， phenylpropane biosynthesis， flavonoid biosynthesis and redox related reactions. qPCR verification indicated that after infested by T. urticae for 1 d and 8 d， the transcriptions of salicylic acid signaling pathway genes such as PAL2， 4CL3， WRKY7 and NPR3 in the standard mite-resistant cassava cultivar C1115 were first significantly increased and then decreased， while the expression level of the four genes in the standard mite-resistant cassava cultivar BRA900 was significantly higher than those before infestation. Besides， the transcription of jasmonic acid signal pathway genes like JAR1， LOX2 and OPR11 in C1115 was also significantly higher than those before infestation， while the transcription of the three genes in BRA900 was significantly lower than those before infestation. The results speculated that mite-resistant cassava cultivar C1115 could activate salicylic acid and jasmonic acid signaling pathways to defend T. urticae infestation. This study would lay a theoretical foundation for further elucidating the molecular mechanism of cassava resistance to mite， and for breeding and creating mite-resistant cassava cultivars.

Keywords： Tetranychus urticae; mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars; transcriptome analysis; salicylic acid signaling pathways; jasmonic acid signaling pathways

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.013

木薯（Manihot esculenta Crantz）是全球9億多人的主糧，同時也是重要的飼料作物、工業(yè)原料作物和生物能源[1]。木薯作為“先鋒作物”，在我國農(nóng)業(yè)外交和對外科技援助中發(fā)揮著舉足輕重的作用。我國生產(chǎn)的木薯絕大部分用于制備乙醇，在玉米等糧食作物作為乙醇生產(chǎn)原料供給不足導致燃料乙醇產(chǎn)業(yè)遇到瓶頸的形勢下，發(fā)展“非糧”燃料乙醇已成為世界燃料乙醇技術的發(fā)展趨勢[2]。2018年8月22日國務院常務會議明確提出堅持加快建設木薯燃料乙醇的項目，木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展一直受到國家各級管理部門的高度重視[3]。二斑葉螨（Tetranychus urticae Koch）是世界危險性害螨，其寄主多達50科200余種[4-5]。二斑葉螨是為害木薯最嚴重的四大有害生物之一，嚴重暴發(fā)成災主要集中在木薯種植后6～8個月左右，此時的木薯地已封行，化學藥劑防治困難[6-7]。

培育與利用抗蟲品種是國內(nèi)外公認的最經(jīng)濟、最有效、最簡便的一項帶有方向性的害蟲防治途徑[8-9]，而闡明作物的抗蟲性機理能夠為選育抗蟲品種提供理論依據(jù)。作物抗蟲性是多個基因、酶、蛋白和代謝物共同參與調(diào)控的結果，具有典型的數(shù)量遺傳防御效應特征[10]，因此，作物抗蟲性的形成原因及可能的調(diào)控網(wǎng)絡機制需要通過多維度、多因素、多級聯(lián)關系進行考量，而轉錄組測序分析是開展作物抗蟲性機理研究的強有力工具，已廣泛應用于多種作物抗蟲基因的篩選、挖掘和功能驗證。

水楊酸和茉莉酸介導的防御信號途徑在作物抗蟲性形成過程中發(fā)揮著重要作用，在植物受到害蟲為害時能激活體內(nèi)相應的防御基因表達，可以誘導植物產(chǎn)生影響昆蟲消化的防御蛋白或對昆蟲有毒害作用的次生代謝物質的直接防御[11-13]，也可以誘導產(chǎn)生植物釋放對昆蟲有趨避作用或吸引天敵的揮發(fā)物的間接防御[14-15]。當前關于水楊酸和茉莉酸信號途徑在擬南芥[16]、煙草[17]等模式植物，水稻[18]、小麥[19]、棉花[20]等大宗經(jīng)濟作物抗蟲性的作用機制研究已有較多報道。

當前尚未見害蟲為害后抗、感木薯品種轉錄組差異分析相關報道。因此，本研究通過比較二斑葉螨為害后抗、感螨木薯品種轉錄組差異，篩選水楊酸、茉莉酸差異表達基因，并通過qPCR驗證這兩個信號途徑關鍵基因的差異表達，以期初步闡明木薯抗螨性機理，為抗螨木薯品種選育和分子設計育種提供理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試木薯 ?本研究選擇遺傳穩(wěn)定、健康無病蟲的抗螨參照標準木薯品種C1115和感螨參照標準木薯品種BRA900作為供試木薯[3]。C1115和BRA900均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家木薯種質資源圃提供。

1.1.2 ?供試蟲源 ?二斑葉螨為本實驗室以感螨參照標準木薯品種BRA900植株長期繼代飼養(yǎng)的室內(nèi)試驗種群。飼養(yǎng)溫度為（26±1） ℃，相對濕度為80%。

1.1.3 ?供試試劑 ?多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司，cDNA合成試劑盒、去基因組DNA試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，qPCR試劑盒購自于鉑尚生物技術（上海）有限公司。瓊脂糖、乙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 ?方法

1.2.1 ?二斑葉螨接種和取樣 ?二斑葉螨接種和取樣參照實驗室前期建立的方法進行[21]，為保證試驗材料的一致性和方法的準確性。選取溫室種植3個月、長勢一致、無病蟲的C1115和BRA900健康植株，發(fā)育一致的二斑葉螨雌成螨按50頭/葉分別接種于抗、感木薯植株中下部3張葉片背面，再用浸潤甘油的棉絮包裹住木薯葉柄基部以防止二斑葉螨在葉片間遷移。分別在二斑葉螨接種為害前（0 d，對照）、接種為害后1、8 d采集葉片用于水楊酸、茉莉酸含量測定及RNA提取。每品種設3個重復，每重復取中下部3張葉片（1個重復3張葉片）。

1.2.2 ?二斑葉螨為害后轉錄組差異分析 ?采用1.2.1的方法進行二斑葉螨的接種和木薯葉片取樣。取樣后的木薯葉片馬上放入液氮中粉碎研磨，并取不同處理各0.5 g樣品委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組數(shù)據(jù)測定。去除原始數(shù)據(jù)的接頭序列和低質量reads得到clean data。計算Phred數(shù)值大于30的堿基占總體堿基的百分比Q30，當這2個數(shù)值均大于90%時表示測序的質量良好，能夠滿足建庫的要求。將clean data與木薯參考基因（http：//www.cassava-genome.cn/ index.jsp）進行序列比對，獲得mapped data。對樣品組中的基因表達量進行差異表達、GO（Gene Ontology）功能注釋和KEGG（https：//www.kegg.jp/ kegg/pathway.html）通路富集分析。在差異表達基因篩選方面，從差異倍數(shù)和顯著水平2個水平進行評估，閾值設定一般為|log2（Fold Change）|>1且qvalue<0.005。差異基因GO富集分析方面，選擇直觀反映生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）富集的GO條目上差異基因的個數(shù)分布情況，最終挑選富集最顯著的30個GO條目作圖展示。KEGG富集程度通過rich factor、Q value和富集到此通路上的基因個數(shù)來衡量。其中rich factor指差異表達的基因中位于該pathway條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數(shù)的比值。rich factor越大，表示富集的程度越大。Q value是做過多重假設檢驗校正之后的P value，Q value的取值范圍為[0，1]，越接近于零，表示富集越顯著，最終挑選富集最顯著的20條pathway條目作圖展示。

1.2.3 ?差異表達基因的qRT-PCR驗證 ?以1.2.2轉錄組分析中篩選出的差異表達的水楊酸、茉莉酸信號途徑基因為樣本，并結合文獻報道，進一步篩選具有指示和標記作用的水楊酸和茉莉酸途徑關鍵差異表達基因進行qPCR驗證。采用1.2.1的方法進行二斑葉螨的接種和取樣。采用天根公司（TIANGEN）多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取螨害前后的木薯葉片RNA，用Nanodrop和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取去除gDNA后的RNA樣品1.0 μg用于cDNA的合成。cDNA樣品經(jīng)無核酸酶水5倍稀釋后作為qRT-PCR的模板，分別以木薯Metub為內(nèi)參基因，相關基因的引物信息如表1所示。qPCR反應條件為：95 ℃預溫育1 min后，以40個循環(huán)完成如下程序：95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s。分別以來源于未經(jīng)二斑葉螨為害的木薯葉片cDNA為對照，螨害后的木薯水楊酸、茉莉酸途徑基因表達量變化情況以為害前的相對倍數(shù)表示，根據(jù)Livak等[22]的2-ΔΔCT方法計算而得，每個處理均設置3個重復。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組數(shù)據(jù)的顯著性差異分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有數(shù)據(jù)均為3個生物學重復的平均值，顯著性水平為α=0.05。

2 ?結果與分析

2.1 ?二斑葉螨為害后轉錄組差異分析

2.1.1 ?轉錄組數(shù)據(jù)質量評估 ?由表2可看出，6個處理的18個木薯樣品的轉錄組測序數(shù)據(jù)總共得到6.93 G的clean data。質量分析結果顯示，18個木薯樣品Q30堿基百分比分別均超過90.00%，表明18個木薯轉錄組測序結果的數(shù)量與質量都己合格，可進行下一步分析。

2.1.2 ?差異表達分析 ?用于轉錄組分析的抗、感螨參照標準木薯品種受螨害1、8 d后的癥狀如圖1所示，隨螨害時間的延長，感螨參照標準木薯品種BRA900葉片枯黃褪綠的癥狀越發(fā)明顯，而抗螨參照標準木薯品種C1115葉片無顯著螨害癥狀。圖2結果表明，與為害前（0 d）相比，受二斑葉螨為害1 d后，抗螨木薯C1115共有1023個基因差異表達，其中540個基因上調(diào)表達，483個基因下調(diào)表達（圖2A）;為害8 d后共有1684個基因差異表達，其中757個基因上調(diào)表達，927個基因下調(diào)表達（圖2B）;與為害前（0 d）相比，受二斑葉螨為害1 d后，感螨木薯BRA900共有2137個基因差異表達，其中1001個基因上調(diào)表達，1136個基因下調(diào)表達（圖2C）;為害8 d后共有1751個基因差異表達，其中907個基因上調(diào)表達，844個基因下調(diào)表達（圖2D）。進一步對抗感木薯品種間的轉錄組差異表達基因分析表明，受二斑葉螨為害1 d后，抗螨木薯相較于感螨木薯品種共有882個基因差異表達，其中358個基因上調(diào)表達，524個基因下調(diào)表達（圖2E）;受二斑葉螨為害8 d后，抗螨木薯相較于感螨木薯品種共有251個基因差異表達，其中102個基因上調(diào)表達，149個基因下調(diào)表達（圖2F）。二斑葉螨為害前（0 d）、為害1、8 d后，共同差異表達的基因有91個，其中48個上調(diào)表達，43個下調(diào)表達（圖3）。

2.1.3 ?差異表達基因的GO及KEGG富集分析 ?圖4結果表明，對于不同樣本間的比較，GO的功能注釋均集中在生物學過程（biological process）和分子功能（molecular function）這兩大類。其中受二斑葉螨為害1、8 d后，抗、感螨木薯品種間在生物學過程中富集差異基因個數(shù)最多的均為氧化還原過程（oxidation-reduction process）、單有機體代謝過程（single-organism metabolic process）（1 d）、代謝過程（metabolic process）和碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolic process）（8 d），而為害1、8 d后在分子功能方面富集差異基因個數(shù)最多的為氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）和催化活性（catalytic activity）。KEGG富集分析方面（圖5），抗、感螨木薯品種差異表達基因分別富集到125條和132條，選取的顯著富集的20個條目中，與作物抗蟲性關系最密切的通路有次生代謝物質生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）。

2.2 ?抗、感螨木薯品種被二斑葉螨為害后差異表達基因的qPCR驗證

2.2.1 ?用于qPCR驗證的水楊酸、茉莉酸信號途徑基因的篩選 ?在通過轉錄組分析獲得的二斑葉螨為害后木薯水楊酸、茉莉酸信號途徑差異表達基因的基礎上，進一步參考前人研究已經(jīng)明確的具有指示和標記作用的2個信號途徑關鍵基因，最終篩選了木薯水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7、NPR3和茉莉酸信號途徑JAR1、LOX2和OPR11作為qPCR驗證的基因（表2）。

2.2.2 ?二斑葉螨為害后水楊酸信號途徑差異表達基因qPCR驗證 ?圖6A結果表明，抗螨參照標準木薯品種C1115水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7和NPR3的表達量表現(xiàn)出隨螨害時間延長而顯著降低的趨勢，其中螨害1 d后表達量達到峰值，4個基因表達量分別為螨害前（0 d）的5.11、3.74、2.40、1.92倍。而感螨參照標準木薯品種BRA900上述4個基因的表達量在螨害后均維持在顯著高于螨害前的水平（P<0.05）（圖6B）。在同一螨害時間內(nèi)，相對于BRA900，C1115中PAL2、4CL3和NPR3基因的表達量在螨害1 d時顯著上調(diào)，而在螨害8 d時顯著下調(diào)（圖6C），這與轉錄組分析的基因差異表達結果具有一致性。

2.2.3 ?二斑葉螨為害后茉莉酸信號途徑差異表達基因qPCR驗證 ?圖7A結果表明，抗、感螨參照標準木薯品種被二斑葉螨為害后，茉莉酸信號途徑基因的表達量變化趨勢并不完全一致?？跪臼鞢1115受螨害后，茉莉酸信號途徑基因JAR1、LOX2和OPR11的表達量與螨害前相比均顯著提

高（P<0.05），表達量的最高值均出現(xiàn)在螨害后1 d，分別達到了螨害前的7.16、7.28、8.50倍，隨螨害時間的延長，表達量均表現(xiàn)出下降的趨勢。而感螨木薯BRA900受螨害后，上述3個基因的表達量也隨著螨害時間的延長逐漸降低，并且螨害8 d后JAR1和LOX2的表達量顯著降低至低于螨害前的水平（P<0.05）（圖7B）。此外，螨害前，抗螨品種C1115中JAR1、LOX2和OPR11的表達量僅分別為感螨品種BRA900的1.15倍、1.14倍和1.57倍，而受螨害1 d和8 d后，上述3個基因在C1115中的表達量均顯著高于BRA900（P<0.05）（圖7C）。上述茉莉酸信號途徑基因qPCR驗證的結果與轉錄組分析的差異表達情況基本一致。

3 ?討論

轉錄組分析結果表明，與未受螨害之前相比，隨著螨害時間的延長，抗螨木薯品種C1115的差異表達基因數(shù)基本保持不變，而感螨木薯品種BRA900的差異表達基因數(shù)則顯著下降，并且抗螨木薯相對于感螨木薯的差異表達基因也呈現(xiàn)出隨螨害時間延長而顯著下降的趨勢。推斷抗螨木薯品種在螨害期間能夠穩(wěn)定激活自身的防御反應，而感螨木薯品種因螨害后植株嚴重受損，體內(nèi)的多個生化反應可能停止或被抑制。這在煙粉虱為害抗感棉花品種[30]、枕葉盲蝽為害抗感水牛草品種[31]的轉錄組分析中也能觀察到與本研究相類似的結果。差異表達基因的GO和KEGG富集分析結果表明，差異表達基因主要富集在次生代謝物質合成、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成和氧化還原相關反應方面，而這些生物學過程又與作物抗蟲性息息相關，尤其是苯丙烷合成通路的激活是啟動水楊酸信號途徑的關鍵[32]，而植物內(nèi)源茉莉酸亦能夠激活類黃酮生物合成途徑[33]。因此本研究轉錄組分析的結果可以總體上大致反映抗、感螨木薯品種抗性差異的分子基礎。

水楊酸和茉莉酸途徑是植物抵御害蟲、病原菌和病毒等有害生物入侵過程中研究最廣泛的2條防御信號途徑。因此，本研究從轉錄組分析獲得的差異表達基因中選擇了具有代表性的指示和標記基因PAL2、4CL3、WRKY7、NPR3（水楊酸途徑）和JAR1、LOX2、OPR11（茉莉酸途徑）做進一步的qPCR驗證。結果表明，上述基因在轉錄組分析中的差異表達情況和qPCR驗證的結果基本一致，并且qPCR分析結果還顯示2個途徑基因的表達量變化取食并不一致。許多研究表明，雙子葉植物中JA和SA防御信號途徑既有相互拮抗[34-35]，也存在相互協(xié)同[36-37]，這2個信號途徑之間表現(xiàn)出何種相互作用模式和害蟲和作物的種類有關。一些研究表明刺吸式昆蟲為害后可誘導水楊酸信號途徑的激活，而抑制茉莉酸信號途徑。如煙粉虱為害利馬豆和擬南芥后，植物內(nèi)源水楊酸含量及其調(diào)控的防御基因的表達量均增加，同時抑制內(nèi)源茉莉酸含量及其調(diào)控的防御基因的表達[38]。B型煙粉虱能夠誘導擬南芥的水楊酸途徑基因并抑制茉莉酸途徑基因的表達[39]。煙粉虱為害番茄后，主要誘導水楊酸防御反應，同時抑制茉莉酸防御反應，如何瑜晨[34]研究測定了茉莉酸信號路徑上LOX-D基因的表達情況，結果表明，LOX-D在煙粉虱為害12 h時其表達量顯著增加，但隨著為害時間延長，其表達量逐漸降低，并恢復到對照水平。也有研究表明，刺吸式害蟲為害能同時激活植物的水楊酸和茉莉酸途徑。如姚新建[40]研究發(fā)現(xiàn)抗性小麥品系35-E4和敏感品系35-A20被禾谷縊管蚜為害后，其水楊酸和茉莉酸信號轉導途徑中相關基因（PAL、LOX、NPR）的表達量均顯著提高，但是表達模式存在差異，抗性品系35-E4中相關基因的表達量高于敏感品系35-A20。張羽宇等[41]研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬為害能顯著誘導菜豆植株茉莉酸和水楊酸信號轉導途徑相關防御酶基因LOX，PAL和PR-2的表達，并在菜豆植株不同部位葉片產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。趙麗艷[42]研究發(fā)現(xiàn)，蚜蟲為害既激活了水楊酸信號途徑基因如PAL、4CL的表達，也激活了茉莉酸信號途徑基因LOX的表達。上述研究表明不同刺吸式口器害蟲為害不同寄主植物后，SA和JA介導的防御反應卻顯著不同。本研究結果表明，二斑葉螨為害后抗螨木薯C1115和感螨木薯BRA900后水楊酸信號途徑基因PAL2、4CL3、WRKY7和NPR3均能夠被顯著誘導，而抗、感木薯中，茉莉酸信號途徑基因JAR1、LOX2和OPR11的表達量在為害早期（1 d）均較為害前顯著提高。然而隨著為害時間的延長，上述3個基因的表達量雖然在抗螨木薯C1115中逐漸降低，但依然維持在顯著高于螨害前的水平，而在感螨木薯BRA900中這3個基因的表達量降低至顯著低于螨害前的水平，一方面說明二斑葉螨可能采取了和煙粉虱相同的為害策略，即通過誘導水楊酸途徑，抑制茉莉酸途徑達到為害感螨木薯的目的，而抗螨木薯的茉莉酸途徑均能被誘導產(chǎn)生防御反應免于受害。

本研究從轉錄組分析、水楊酸、茉莉酸途徑關鍵差異表達基因的qPCR驗證角度初步解析了抗、感木薯品種存在抗性差異的可能原因，但僅從基因表達層面仍不能充分闡明木薯的抗螨性機理，后續(xù)研究可采用多組學聯(lián)合分析的深入探討基因-蛋白-代謝物的共表達調(diào)控網(wǎng)絡，挖掘并驗證關鍵抗蟲基因的功能，以期系統(tǒng)全面闡明木薯品種的抗螨性機理。

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責任編輯：黃東杰