趙國文 賈瑞宗 郭靜遠(yuǎn) 郭安平

摘 ?要：火龍果屬于仙人掌科量天尺屬，是具有重要經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價(jià)值的熱帶水果之一，其果實(shí)富含花青素和甜菜紅素。在果實(shí)成熟后期甜菜紅素的大量積累引起紅心火龍果果實(shí)轉(zhuǎn)色的現(xiàn)象。果肉色澤是評(píng)價(jià)火龍果果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，然而其果實(shí)轉(zhuǎn)色背后的基因表達(dá)調(diào)控模式并不清晰。深入研究火龍果果實(shí)發(fā)育過程中果肉顏色調(diào)控的分子機(jī)理有助于豐富火龍果品質(zhì)形成的理論基礎(chǔ)。本研究以‘美紅一號(hào)’紅心火龍果為實(shí)驗(yàn)材料，采集果實(shí)發(fā)育過程中9個(gè)不同時(shí)期的樣品，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)共識(shí)別了96種差異表達(dá)的基因，最后分析發(fā)現(xiàn)15個(gè)與色素代謝通路相關(guān)的基因在果實(shí)發(fā)育不同階段顯著差異表達(dá)。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在與結(jié)合活性、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)的功能分類上，且與色素代謝都有重要聯(lián)系;KEGG代謝途徑富集結(jié)果顯示，次生代謝物合成途徑、氨基酸和核酸代謝途徑、酪氨酸代謝途徑富集基因較多。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)15個(gè)與色素相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗(yàn)證，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。生理分析和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，紅皮紅肉火龍果發(fā)育過程中伴隨大量甜菜色素的合成，且甜菜色素合成途徑中DODA基因逐漸上調(diào)，在果實(shí)轉(zhuǎn)色其中在P4時(shí)期明顯的上升趨勢，其它關(guān)鍵基因表達(dá)逐漸下調(diào)。本研究發(fā)掘火龍果中與果實(shí)轉(zhuǎn)色相關(guān)的相關(guān)基因，為后續(xù)火龍果遺傳改良提供了重要的目標(biāo)基因和遺傳基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：火龍果;果實(shí)轉(zhuǎn)色;轉(zhuǎn)錄組測序;基因挖掘;

中圖分類號(hào)：S667.9 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Pitaya belongs to the genus of Cactaceae and is one of the tropical fruits with important economic and nutri-tional value. Its fruits are rich in anthocyanins and betaine. In the late stage of fruit maturity， the accumulation of beta red pigment causes the phenomenon of red-hearted dragon fruit fruit color change. The color of the pulp is one of the important indicators to evaluate the quality of the dragon fruit. However， the gene expression regulation mode behind the color change of the fruit is unclear. In-depth study of the molecular mechanism of the color regulation of the pitaya fruit during the development of the dragon fruit will help to enrich the theoretical basis for the formation of pitaya quality. In this study， ‘Meihong No. 1’ red-hearted dragon fruit was used as the experimental material. Nine samples from different stages of fruit development were collected. A total of 96 differentially expressed genes were identified through comparative transcriptomics. Finally， 15 genes were found to be related to pigments. Genes related to metabolic pathways were significantly differentially expressed at different stages of fruit development. GO functional enrichment analysis found that differentially expressed genes were mainly enriched in functional classifications related to binding activity， catalytic activity， transport activity and structural molecule activity， and were importantly related to pigment metabolism. The results of KEGG metabolic pathway enrichment showed that there were many enriched genes in the biometabolite synthesis pathway， amino acid and nucleic acid metabolism pathway， and tyrosine metabolism pathway. Real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to verify 15 the differentially expressed genes related to pigments， and the results were consistent with the results of transcriptome analysis. The results of physiological analysis and transcriptome analysis showed that the development of red skin and red flesh dragon fruit was accompanied by the synthesis of a large number of beet pigments， and the DODA gene in the beet pigment synthesis pathway was gradually up-regulated. During the fruit color change， there was an obvious upward trend in the P4 period. The expression of key genes is gradually down-regulated. This study explored the related genes related to fruit color change in dragon fruit， and provided an important target gene and genetic basis for subsequent genetic improvement of dragon fruit.

Keywords： dragon fruit; fruit color conversion; transcriptome sequencing; gene mining

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.0012

火龍果起源中美洲熱帶雨林地區(qū)，為仙人掌科量天尺屬，果實(shí)外形獨(dú)特，香甜多汁，含有花青素和蛋白質(zhì)等多種成分，營養(yǎng)價(jià)值較高深受消費(fèi)者的喜愛[1-3]?；瘕埞a(chǎn)地在中美洲的墨西哥、古巴等地區(qū)[4]，在我國火龍果的種植主要在南方的廣西、福建、云南、海南等地進(jìn)行種植[5]，為當(dāng)?shù)毓r(nóng)帶來了良好的經(jīng)濟(jì)收益。紅皮紅肉（Hylocereus costaricensis）品種是一種新的改良品種[6]，其果實(shí)呈近圓形，鱗片粗短，反卷似“蓮花座”，是火龍果的主要栽培品種[7]。目前，火龍果研究不僅在種植栽培、生物學(xué)特性、儲(chǔ)藏保鮮等方面進(jìn)行;同時(shí)也在火龍果分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、色素提取[8-10]和植物病害[11-12]等方面取得了一定的進(jìn)展。但火龍果基因組序列尚未報(bào)道，其分子生物學(xué)的研究仍受到較大限制。

火龍果根據(jù)其果皮果肉顏色分為紅皮白肉、紅皮紅肉和黃皮白肉3種[13]。市場上常見的品種是紅皮紅肉和紅皮白肉，紅皮紅肉更受到消費(fèi)者喜愛。目前，火龍果色素生物合成途徑已基本明確，代謝途徑中的關(guān)鍵酶也已克隆分離，但對(duì)色素合成基因表達(dá)模式調(diào)控的研究還十分有限。因此，本研究以‘美紅一號(hào)’紅皮紅肉火龍果為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和后續(xù)分析，比較研究同一品種火龍果果肉在不同時(shí)期中基因的差異表達(dá)情況，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的基因功能和代謝通路富集分析，篩選出差異表達(dá)基因，進(jìn)一步對(duì)紅肉火龍果中色素的代謝差異進(jìn)行初步分析。通過對(duì)篩選出的基因開展功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可以為甜菜色素合成代謝提供可靠信息。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

‘美紅一號(hào)’紅心火龍果（Hylocereus cos-taricensis）的P0：小花蕾;P1：中花蕾;P2：大花苞;P3：開花期;P4：膨大期;P5：破色期;P6：著色期;P7：果皮開始轉(zhuǎn)色期;P8：果實(shí)完全成熟期9個(gè)發(fā)育時(shí)期的果肉樣品的和根、莖、花、果皮和果肉5個(gè)不同組織的樣品。實(shí)驗(yàn)材料來自海南省昌江市火龍果種植基地，現(xiàn)場取樣并用液氮進(jìn)行速凍處理，每個(gè)個(gè)體設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總共42份樣品，存于–80 ℃冰箱。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA提取與檢測 ?將火龍果果實(shí)9個(gè)不同發(fā)育時(shí)期果肉組織和不同組織部位樣品寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基于IlluminaHiSeqTM2000的轉(zhuǎn)錄組測序。樣品放入含有液氮的研缽成粉末，轉(zhuǎn)入放有裂解液的EP管中，采用CTAB法提取RNA[14]。取適量樣品進(jìn)行檢測，于–80 ℃保存。RNA提取流程與檢測均委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 ?文庫構(gòu)建和測序 ?使用SMRT Link的Iso-Seq protocol進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄本分析，將最終得到的高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)分析。火龍果果肉樣品在PacBio Sequel平臺(tái)上測序，建立PacBio IsO-Seq文庫，獲得原始聚合酶read序列，去除read序列，使用SMRT分析套件進(jìn)行reads of insert（ROI）、分類、聚類和校正，最終得到高質(zhì)量的全長共有序列。將每個(gè)庫的高質(zhì)量全長序列組合在一起，在沒有參考基因組的情況下，使用LoRDEC軟件利用Illumina二代數(shù)據(jù)對(duì)一致的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行糾錯(cuò)，去除聚集和糾錯(cuò)的轉(zhuǎn)錄本。在PacBio RS sequel測序平臺(tái)是基于單分子實(shí)時(shí)（SMRT）的測序技術(shù)，環(huán)狀測序得到polymerase read。polymerase read中含有很多無效數(shù)據(jù)會(huì)對(duì)后續(xù)分析帶來嚴(yán)重干擾，如測序接頭序列，建庫長度的偏差，以及測序錯(cuò)誤、低質(zhì)量堿基、未測出的堿基等情況，因此需通過一些手段將上述無效數(shù)據(jù)過濾掉，以保證分析的正常進(jìn)行。最終得到有效的subreads插入片段。

1.2.3 ?內(nèi)參基因的選擇 ?內(nèi)參基因在各種組織和細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)恒定，常作為檢測基因表達(dá)水平變化的參考。其作用是校正上樣量和上樣過程中的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過檢測每個(gè)樣品的內(nèi)參量，可用于校正上樣誤差，使定量結(jié)果更加可靠。一般應(yīng)選擇在加工因子條件下表達(dá)不發(fā)生變化的基因作為內(nèi)參。本研究選擇TBP2作為內(nèi)參基因（表1）。

1.2.4 ?轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理 ?測序后，對(duì)得到的所有原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行分析，過濾后得到clean data，然后去除無效的低質(zhì)量序列。進(jìn)行PacBio測序數(shù)據(jù)評(píng)估，最終得到有效的subreads inserts。使用SMRT Link的Iso-Seq protocol進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄本分析，并使用最終的高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行后續(xù)分析。基于Swissprot、Nr、KOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，對(duì)所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋，包括表達(dá)注釋和功能注釋，最終富集分析。

1.2.5 ?差異分析 ?用TPM方法計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。對(duì)于沒有生物學(xué)重復(fù)的樣本，先用TMM對(duì)read計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后用DEGseq進(jìn)行差異分析。為了獲得顯著差異的基因，設(shè)置篩選條件為：qValue<0.05和倍數(shù)差異|FoldChange|>2。顯著差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的GO和Pathway富集分析。

1.2.6 ?qRT-PCR驗(yàn)證 ?選擇火龍果TBP2基因作為內(nèi)參基因，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫，篩選出甜菜途徑中色素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、高表達(dá)基因和關(guān)鍵酶等15個(gè)unigenes進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證篩選。引物設(shè)計(jì)使用引物5.0（表1），使用TB Green（TliRNaseH Plus）（Takara）試劑盒，將樣品放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Mx3000P，Stratagene，美國）中完成反應(yīng)，為防止技術(shù)失誤，每個(gè)反應(yīng)做3次重復(fù)，結(jié)果用相對(duì)定量法分析（2–CT）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?轉(zhuǎn)錄組測序及質(zhì)量評(píng)估

為了解析火龍果果肉著色機(jī)制，以紅心火龍果‘美紅一號(hào)’為研究對(duì)象，采集了果實(shí)9個(gè)不同發(fā)育時(shí)期（P0：小花蕾;P1：中花蕾;P2：大花苞;P3：開花期;P4：膨大期;P5破色期;P6：著色期;P7：果皮開始轉(zhuǎn)色期;P8：果實(shí)完全成熟期）的果肉樣品，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。利用CTAB法提取高質(zhì)量RNA后構(gòu)建插入片段為21 317 bp的cDNA文庫（3次生物學(xué)重復(fù)），并利用PacBio RS sequel測序平臺(tái)是基于單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。使用Trimmomatic對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads;質(zhì)控后得到24 275條高質(zhì)量reads，平均每個(gè)樣品的長度為2381.01。質(zhì)量評(píng)估顯示用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析的數(shù)據(jù)質(zhì)量Q30大于91.93%（表2），表明這批轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量值較高，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析需求。

對(duì)PacBio測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。使用SMRT Link的Iso-Seq protocol進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄本分析，使用LoRDEC軟件利用Illumina二代數(shù)據(jù)對(duì)一致性轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行錯(cuò)誤校正。其中去除reads長度小于35 nt的reads本身及其配對(duì)reads，且Q30均高于（91%），從整體上看，低質(zhì)量（Quality<30）的堿基比例較低，說明測序質(zhì)量較好。

2.2 ?基因功能注釋結(jié)果

為了預(yù)測unigenes序列的功能信息，將24 275條unigenes序列分別在NR、SwissProt、KEGG和KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)（圖1）。根據(jù)NCBI Blast+，全長轉(zhuǎn)錄本模型與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比篩選后總共有4626條序列能夠匹配到數(shù)據(jù)庫中，占全部unigenes序列19%。其中，NR數(shù)據(jù)庫4485條，Swissprot數(shù)據(jù)庫4078條，KOG數(shù)據(jù)庫3047條，KEGG數(shù)據(jù)庫1592條，四大數(shù)據(jù)庫同時(shí)注釋1358條序列。

在NR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行物種比較分析（圖2），共比較了132個(gè)物種。前五名是：甜菜2441條（Beta vulgaris subsp. Vulgaris：54.51%）、菠菜1062條（Spinacia oleracea：23.72%）、非洲冰草71條（Mesembryanthemum crystallinum：1.59%）和葡萄69（Vitis vinifera：1.54%）、桐油樹50（Jatropha curcas：1.12%）。可以看出，火龍果和甜菜在基因序列上具有高度的同源性。KOG數(shù)據(jù)庫中基因同源物的比較分析（圖3），通過24個(gè)類別的比較，發(fā)現(xiàn)413個(gè)基因與一般功能預(yù)測相關(guān)，406個(gè)基因與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分子伴侶相關(guān)十大類顯示這些蛋白質(zhì)主要與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)加工和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，與次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因共115個(gè)。

KEGG數(shù)據(jù)庫共注釋了2844個(gè)轉(zhuǎn)錄本。按代謝途徑可分為5個(gè)分支，細(xì)胞過程297個(gè)、環(huán)境信息處理（environmental information processing）256個(gè)、遺傳信息處理（genetic information processing）597個(gè)、代謝（metabolism）1273個(gè)、有機(jī)系統(tǒng)（organismal systems）421個(gè)碳水化合物代謝（274）和能量代謝（能量代謝）是代謝途徑中涉及最多的途徑，其次是概覽圖（246）。在KEGG代謝途徑分析中（圖4），更多的基因富集在次級(jí)代謝物合成途徑、氨基酸和核酸代謝途徑、酪氨酸代謝途徑中。

GO（gene ontology）功能注釋分析（圖5）富集了所有樣本的生物過程（biological process）、細(xì)胞成分（cellular component）和分子功能（molecular functon）三類基因，其中富集了更多的基因在細(xì)胞成分中，但分子功能較少。在生物過程中，2391個(gè)基因在代謝過程中富集，2674個(gè)基因在細(xì)胞過程中富集，1071個(gè)基因在生物調(diào)控和刺激反應(yīng)中富集。這些過程與色素代謝密切相關(guān)。在細(xì)胞成分上，可以看出，細(xì)胞器或細(xì)胞器部分、細(xì)胞器或細(xì)胞器部分、膜或膜部分這3種類型的細(xì)胞或細(xì)胞器部分富含更多的基因;在分子功能方面，催化活性功能富集2040個(gè)基因，結(jié)合功能富集2416個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)活性富集290個(gè)基因。此外，一些基因富含蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性。執(zhí)行GO（基因本體）分析（圖5）。在分子功能方面，4個(gè)部分明顯富集到更多的基因，即結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)構(gòu)分子活性和色素代謝。

2.3 ?果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期果肉組織代謝物含量與顏色變化

上述化合物中對(duì)火龍果果肉的顏色有影響的物質(zhì)有花青苷含量、類胡蘿卜素、類黃酮和甜菜色素，這些化合物都在火龍果不同的發(fā)育時(shí)期，其含量都有明顯差異（圖7），可以看出花色苷在P4和P5要明顯高于其他發(fā)育時(shí)間，類胡蘿卜素在P7的含量要明顯高于其他發(fā)育時(shí)期。類黃酮在P4和P7的含量也要高于其他發(fā)育時(shí)期。甜菜色素在火龍果的P3～P6時(shí)期的含量較低，P7時(shí)期含量表達(dá)開始上調(diào)，P8時(shí)期含量最高。綜上所述，火龍果果肉的顏色直觀地由其所含的化學(xué)物質(zhì)決定，不同的發(fā)育時(shí)期，火龍果果肉中的維生素C和甜菜色素均較高，導(dǎo)致果肉的顏色也在不同發(fā)育時(shí)期有差異（圖6）。

2.4 ?果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期果肉組織間差異表達(dá)基因（Differently expressed genes，DEGs）

以qValue<0.05，|FoldChange|>2為標(biāo)準(zhǔn)，在9個(gè)樣品中（表3），進(jìn)行了成對(duì)比較篩選?？梢钥闯觯晃锓N在不同時(shí)期中幼花幼果期（P0、P1、P2、P3）與成熟期（P6、P7、P8）比較的差異基因。結(jié)合果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期化合物測定結(jié)果得出，在果實(shí)轉(zhuǎn)色期（P4 vs P5）基因差異變化明顯。在P4 vs P5果實(shí)轉(zhuǎn)色期中，共有1408個(gè)基因顯著表達(dá)，其中304個(gè)上調(diào)，1104個(gè)下調(diào)。DEG由GO（GeneOntology）分析。在分子功能上，富集到更多基因是在催化活性、連接、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、核酸與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性、色素代謝等方面。在KEGG代謝途徑分析中，更多的基因富集在次級(jí)代謝物合成途徑、氨基酸和核酸代謝途徑、酪氨酸代謝途徑中。

2.5 ?差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

通過轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果分析，提取P0～P8全部發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)量繪制熱圖。根據(jù)（圖8）中結(jié)果來看，這些基因在P0～P3時(shí)期表達(dá)量都較低，P4期果實(shí)中不同基因的表達(dá)量差異較大，P5～P8期基因普遍高表達(dá)。具體來說，HuCHI、HuNCED 450、HuABA2、HubHLH143和HubHLH在果實(shí)的整個(gè)發(fā)育后期P6～P8表達(dá)量開始上升;HuPPHL1、HuPPH1、HuPPH2、HuBADH2在果實(shí)發(fā)育后期P6～P7中表達(dá)量高;HuCPH-2在P4期高表達(dá)后又開始逐漸下降;HuAt4g31390在P7～P8期中表達(dá)量陡然增加;HuMYB44在果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)量較高，到了后期表達(dá)量則下降，HuNCED421隨著果實(shí)發(fā)育不斷成熟，該基因的表達(dá)量在P5和P6時(shí)期出現(xiàn)高表達(dá)，果實(shí)成熟期又逐漸下降;HuDODA則隨著時(shí)間累積，表達(dá)量一直增加。

為了轉(zhuǎn)錄組測序和分析結(jié)果的可靠性，進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，使用熒光定量PCR對(duì)15個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證（圖9）。在P0～P8九個(gè)發(fā)育時(shí)期，這些基因均表現(xiàn)出不同程度的表達(dá)變化。其中HuBVRB_9g2在P4期表達(dá)量較高;HuNCED421在P6期出現(xiàn)了高表達(dá);HuPPH1和HuPPH2在P6期出現(xiàn)高表達(dá)后，表達(dá)量又開始下降;HuDODA和HubHLH基因隨著果實(shí)的發(fā)育表達(dá)量表現(xiàn)出明顯上升趨勢，尤其在P4時(shí)期表達(dá)量顯著升高;HuABA2在P6～P8期表達(dá)量陡然增高。15個(gè)關(guān)鍵基因在9個(gè)發(fā)育時(shí)期的熒光定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，表明本研究分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。P4時(shí)期是果實(shí)轉(zhuǎn)色前的關(guān)鍵時(shí)期，因此，找到火龍果果肉轉(zhuǎn)色前后表達(dá)量顯著升高的基因?qū)ρ芯抗忸伾纬傻姆肿訖C(jī)制具有重要意義。

3 ?討論

果肉的顏色變化是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要各種基因、酶和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。還有許多外部環(huán)境影響，如溫度、光線和其他自然因素。甜菜色素的合成前體在酪氨酸和其他酶的催化下形成甜菜醛氨酸（betalammic acid），其中共軛雙鍵形成發(fā)色團(tuán)[15]。另一方面，在細(xì)胞色素P450（CytP450）的催化下形成環(huán)多巴（cyclo-dopa）。環(huán)多巴自發(fā)形成甜菜堿。β苷元在GT等催化下與甜菜醛結(jié)合形成甜菜堿）[15-16]，儲(chǔ)存于液泡中[17]（圖10）。

本研究基于定量分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，DODA轉(zhuǎn)錄本HuDODA的結(jié)果呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。在甜菜色素的生物合成途徑中，多巴（dopa）在4，5-多巴雌二醇雙加氧酶等酶的催化下形成甜菜醛氨酸，其中共軛雙鍵形成發(fā)色基團(tuán)，而后通過自發(fā)反應(yīng)形成甜菜色素[18]。1個(gè)HuCHI與黃酮類生物合成有關(guān);3個(gè)（HuNCED450、HuABA2和HuNCED421）與類胡蘿卜素生物合成有關(guān);1個(gè)HuBADH2與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝有關(guān);1個(gè)（HuDODA）與DODA雙加氧（DOD）甜菜生物合成相關(guān)，DODA是甜菜色素代謝途徑中形成發(fā)色基團(tuán)的關(guān)鍵酶，也是最有可能與甜菜色素關(guān)鍵基因表達(dá)相關(guān)的關(guān)鍵酶[16];3個(gè)（HuMYB44、HubHLH143和HubHLH）與色素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，4個(gè)（HuCPH-2、HuPPH1、HuAt4g31390和HuPPH2）卟啉與葉綠素代謝相關(guān);2個(gè)（HuPPHL1和HuBVRB_9g2）預(yù)測蛋白類。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)代謝通路中發(fā)現(xiàn)（圖10），3個(gè)關(guān)鍵酶的只有DODA表達(dá)一直處于上調(diào)趨勢，并且該基因可能在果實(shí)臨近采收時(shí)期高表達(dá)，其可能參與果實(shí)品質(zhì)形成過程。

甜菜色素是一種水溶性天然植物色素，種類比較少。目前，已鑒定出75種甜菜色素。在不同pH下，植株呈現(xiàn)紅、紫、黃、白等顏色，是火龍果顏色的重要組成部分[19-22]。據(jù)報(bào)道，在甜菜中，甜菜色素的合成需要4種酶的參與：酪氨酸酶[23-24]、4，5-DOPA雙加氧酶[25]、細(xì)胞色素P450和葡萄糖堿基轉(zhuǎn)移酶[26]，火龍果中甜菜色素合成的分子調(diào)控機(jī)制尚未明確。

所有樣品的GO分析顯示，更多的基因富含催化活性、連接、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、核酸和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性，這表明色素的代謝需要多種酶和調(diào)節(jié)因子。對(duì)9個(gè)樣品進(jìn)行配對(duì)篩選，發(fā)現(xiàn)同一品種不同時(shí)期（P8VSP1）（P6VSP1）的差異表達(dá)基因較多，說明火龍果肉的色素差異較大。與果實(shí)的發(fā)育階段有關(guān)。在果實(shí)的生長發(fā)育過程中，一些與顏色相關(guān)的關(guān)鍵基因可能會(huì)繼續(xù)發(fā)揮促進(jìn)甜菜色素合成的作用。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)富集的酶與酶活性密切相關(guān)。同時(shí)，代謝途徑和酪氨酸代謝途徑中富含的酶較多。甜菜色素合成的第一個(gè)底物是L-酪氨酸合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物[27-28]，發(fā)育過程中可能存在與果實(shí)顏色發(fā)育相關(guān)的基因。趙思軍的研究表明苯丙氨酸是酪氨酸合成的前體[29]。黃酮和黃酮醇的合成與黃酮色素的合成密切相關(guān)?；瘕埞麑?shí)顏色的成分較為復(fù)雜，不僅包括甜菜色素，還可能含有花青素等黃酮醇色素，但據(jù)報(bào)道，花青素和甜菜色素不能共存[30]。郭攀陽等[31]對(duì)2個(gè)不同品種火龍果的果肉顏色進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過DEGs分析發(fā)現(xiàn)，同一品種不同時(shí)期火龍果的差異比同一時(shí)期不同品種間的更大。因此可以從中挑選差異倍數(shù)較高的，在P8樣本中表達(dá)較為顯著的基因進(jìn)行深入研究。

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