邱明珠，付曉宇，曾也婷，劉慶宏，齊興峰，李 敏，余英豪，曲利娟，鄭智勇

膜性腎病是導致成人腎病綜合征(nephrotic syndrome, NS)的常見病理類型[1]，根據(jù)病因分類：特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)占70%～80%，其余為繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy, SMN)及不典型膜性腎病(atypical membranous nephropathy, AMN)[2]。IMN的病程具有異質(zhì)性，當前的研究重點是早期發(fā)現(xiàn)預后不良患者并給予積極治療。近年，關(guān)于IMN疾病進展預測指標報道較多[3-8]，但缺乏早期階段具有預測價值的病理指標。本文著重探討IMN的臨床病理學特征，分析其與預后的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年6月～2017年9月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院病理科腎穿刺標本中確診的79例IMN，對照組SMN 29例(狼瘡性腎炎Ⅴ型20例，乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎膜性腎病型9例)，正常對照組15例(外傷性腎切除標本正常腎組織)。腎小球數(shù)目≥8個，均有完整的臨床資料，包括患者性別、年齡、發(fā)病至腎穿刺時的病程、臨床診斷、血壓、24 h尿蛋白、鏡下血尿、血清白蛋白(sALB)、血清肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)、血清學IgG及估計腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)。本實驗經(jīng)解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 方法標本均行HE、PAS、PASM-Masson染色，免疫組化檢測指標有PLA2R、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、C3d、C4d、C1q、HBsAg、HBcAg，采用透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)觀察(HITACHI，型號HT7700)；隨機抽取5例PLA2R/IgG4的多角形蛋白塊(polygonal protein blocks co-expressed by PLA2R/IgG4, PPBCPI)行鼠抗IgG4/兔抗WT1免疫組化雙標檢測?？贵w：PLA2R(SIGMA公司)、IgG(DAKO公司)、IgG2(EPITMICS公司)、IgG3(Abcam公司)、IgG4(福州邁新公司)、IgG1、WT1(北京中杉金橋公司)；免疫組化EliVision試劑盒和免疫組化雙標試劑盒(KIT-8801/8802)，均購自福州邁新公司。

1.3 病理診斷標準按2016年ISN/RPS增生性腎小球腎炎病理分型[9]及Ehrenreich-Churg膜性腎病分期標準診斷。腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial lesions, TIL)按病變范圍評分：≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、>50%為3分。本組IMN定義為：腎小球基膜上免疫復合物IgG呈細顆粒狀沉積伴基膜增厚，排除繼發(fā)性因素，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性感染、惡性腫瘤或藥物等。PPBCPI陽性定義：出現(xiàn)于腎小球小葉間的多突起蛋白塊，并同時表達PLA2R與IgG4；PPBCPI數(shù)量≥1個判為陽性。根據(jù)是否存在PPBCPI，將IMN分為：PPBCPI陽性的IMN為PPBCPI-IMN組，而PPBCPI陰性者為非PPBCPI-IMN組。

1.4 病理評分標準免疫組化PPBCPI評分：腎小球中PPBCPI陽性的平均數(shù)目，無為0分，1～5個為1分，6～10個為2分，>10個為3分。TEM足細胞病變評分：(1)根據(jù)預實驗觀察結(jié)果，設(shè)定病變明顯的四項指標為線粒體腫脹、空泡變性、脂滴及細胞膜破損；無病變?yōu)殛幮?，有病變?yōu)殛栃浴?2)自噬溶酶體計數(shù)[10]：按每個病例5～10個足細胞自噬溶酶體的平均數(shù)目計數(shù)。

1.5 療效及隨訪本組臨床治療方案：糖皮質(zhì)激素+免疫抑制劑+對癥治療，根據(jù)2012年改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)指南進行判斷。(1)完全緩解：24 h尿蛋白<0.3 g，sALB>35 g/L及sCr正常(<133.0 μmol/L)。(2)部分緩解：24 h尿蛋白0.3～3.5 g，sCr水平穩(wěn)定(波動范圍<15%)。(3)無效：治療后未達上述指標。(4)復發(fā)：完全或部分緩解至少1個月后，24 h尿蛋白>3.5 g。腎活檢后按月記錄隨訪時間，通過門診、電話等方式進行追蹤隨訪，以eGFR降低>30%或進入終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)或患者死亡為終點，隨訪截至2020年9月5日。

2 結(jié)果

2.1 IMN與SMN免疫病理對比79例IMN免疫病理表現(xiàn)為腎小球毛細血管襻臟層上皮下免疫復合物呈細顆粒沉積伴基膜增厚，而29例SMN還伴系膜區(qū)免疫沉積及系膜細胞、內(nèi)皮細胞增生等。IMN組血管襻上PLA2R、IgG4的陽性率均高于SMN組(93.67%vs22.41%、69.62%vs27.59%)，而血管襻IgG1、系膜區(qū)IgA及C1q陽性率均低于SMN組(59.49%vs86.21%、16.46%vs48.28%、45.57%vs92.31%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組間IgG、IgG2、IgG3、IgM、C3d、C4d的陽性率，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。正常對照組除了腎小球系膜區(qū)有少量IgM和C3d沉積外，無IgG、IgA、C4d、C1q等沉積，無血管襻陽性。

2.2 PPBCPI免疫病理特點與足細胞的關(guān)系PASM-Masson染顯示，55例IMN(69.62%)腎組織除了免疫復合物沉積于增厚的腎小球基膜外，腎小球小葉之間可見少量紅染的PPBCPI(圖1)。PLA2R標記PPBCPI呈強陽性，腎小球毛細血管襻弱陽性(圖2)。IgG亞型標記腎小球小葉間的PPBCPI陽性，血管襻為弱陽性，如IgG1(圖3)及IgG4(圖4)，而IgM、IgA、C3d、C4d及C1q標記該物質(zhì)均陰性。SMN組及正常對照組無PPBCPI特征。79例IMN分為55例PPBCPI-IMN(69.62%)和24例非PPBCPI-IMN(30.38%) 。55例PPBCPI-IMN組中的PPBCPI不同程度表達IgG及亞型，IgG4的陽性率與陽性強度最高(表1)。

①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩

表1 PPBCPI-IMN中PPBCPI免疫表型

PPBCPI-IMN免疫組化雙染(IgG4/WT-1)顯示，疏松的PPBCPI(IgG4陽性紅色)位于腎小球小葉間，不與足細胞(WT-1核陽性)直接相連；部分足細胞胞質(zhì)呈IgG4弱陽性(圖5、6)。

2.3 TEM觀察足細胞病變TEM檢查顯示，79例IMN中53例標本可見腎小球(3～6個)，其中34例PPBCPI-IMN，19例非PPBCPI-IMN。兩組TEM下均可見足突融合及微絨毛變性；PPBCPI-IMN的足細胞線粒體腫脹(圖7)、空泡變性、脂滴及細胞膜破損(圖8)的病變陽性率明顯高于非PPBCPI-IMN(圖9)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。兩組間自噬溶酶體數(shù)量的比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表2)。正常對照組15例，均無足突融合、線粒體腫脹、空泡變性、脂滴、細胞膜破損等病變(圖10)。

表2 PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN的足細胞病變比較

2.4 IMN臨床資料的基線特征79例IMN患者，男性56例(70.89%)，女性23例(29.11%)，平均年齡52歲；膜性早期組53例，中晚期組26例，TIL平均0.52分。PPBCPI-IMN組Ⅰ期39例(70.91%)，非PPBCPI-IMN組Ⅰ期14例(58.33%)。PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN 組間主要臨床病理資料統(tǒng)計分析顯示，PPBCPI-IMN組NS的發(fā)生率高于非PPBCPI-IMN(90.91%vs70.83%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)；而其他指標無統(tǒng)計學差異。

表3 IMN臨床資料的基線特征

2.5 生存分析79例IMN中有2例失訪，其余77例隨訪12～75個月，截至2020年9月5日，25例IMN出現(xiàn)腎功能不全且eGFR降低>30%，其中2例進入ESRD，4例肺栓塞死亡。IMN患者3、5年腎臟無瘤生存率(即不出現(xiàn)eGFR降低>30%或ESRD或死亡)分別為90.91%與72.73%(圖11)。比較PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN兩組的療效，前者的治療緩解率低于后者(55.8%vs82.6%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036)。腎臟生存分析顯示，PPBCPI-IMN疾病進展的風險高于非PPBCPI-IMN(Log-rank：P=0.002，圖12)。79例IMN肺栓塞的發(fā)生率為5.06%；PPBCPI-IMN組肺栓塞的發(fā)生率為7.27%(4例)，非PPBCPI-IMN組肺栓塞的發(fā)生率為0，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.308)。

圖11 IMN腎臟無瘤生存率(Kaplan-Meier曲線)

圖12 PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN的生存分析(Kaplan-Meier曲線)

2.6 IMN多因素分析多因素Cox比例風險回歸預后分析顯示，本組中獨立影響IMN疾病進展的變量：病理分期(HR=5.257，P=0.043)、eGFR(HR=0.855，P=0.002)、PPBCPI(HR=1.516，P=0.009，表4)。PPBCPI預測腎臟進展的ROC曲線面積為0.675(P=0.021)，敏感度為95.0%，特異性為40.0%(P=0.021，圖13)。

表4 IMN腎臟的多因素Cox風險分析

圖13 PPBCPI預測腎臟進展的ROC曲線

3 討論

近年，足細胞自身抗原PLA2R、1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing7A, THSD7A)的發(fā)現(xiàn)與深入分析，對確診IMN起關(guān)鍵作用[11-12]。多數(shù)研究顯示，IMN中PLA2R占70%以上，而THSD7A占3%～5%，還有其他一些新抗原[13]。PLA2R聯(lián)合IgG4高特異性(96.4%)識別IMN，PLA2R與IgG4在腎小球毛細血管襻上共表達是IMN的免疫病理診斷依據(jù)[14-17]。IMN的病程具有異質(zhì)性，約1/3的患者可自發(fā)緩解，約1/3的患者10年后可進展為ESRD。單克隆抗體(如利妥昔單抗)被推薦用于IMN的治療，特別對于易發(fā)展為ESRD的高?；颊?，美國腎臟病學會推薦進行一線治療[18]，對臨床醫(yī)師盡早發(fā)現(xiàn)高?；颊咛岢隽烁叩囊蟆?/p>

本實驗發(fā)現(xiàn)IMN除了腎小球毛細血管襻上PLA2R與IgG4共表達外，69.62%的病例于腎小球小葉間還存在PPBCPI免疫病理特征，查閱文獻未見類似報道，本文為首次報道。本實驗免疫組化雙染結(jié)果顯示，PPBCPI-IMN的足細胞胞質(zhì)和PPBCPI均呈IgG4陽性，其中足細胞胞質(zhì)表達較弱，PPBCPI表達較強；推測PPBCPI物質(zhì)可能是IMN自身抗體攻擊損傷足細胞胞體及足突后，退變、脫落、融合形成的蛋白團塊。PPBCPI免疫表型顯示PLA2R、IgG及其亞型不同程度陽性，顯示其共表達的特點；而IgA、IgM、C3d、C4d和C1q均陰性，提示無激活補體系統(tǒng)。Meyer-Schwesinger等[19]在IMN轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)足細胞損傷；本實驗TEM顯示PPBCPI-IMN足細胞的線粒體腫脹、空泡變性、脂滴及細胞膜破損陽性率高于非PPBCPI-IMN，差異具有統(tǒng)計學意義。PPBCPI-IMN與非PPBCPI-IMN之間存在足細胞超微結(jié)構(gòu)病變的差異，可能是特異性抗體與足細胞結(jié)合后引起的細胞膜和細胞器損害不同所致，而其機制有待進一步分析。

臨床病理資料分析顯示，PPBCPI-IMN組的NS出現(xiàn)率高于非PPBCPI-IMN組(90.91%vs70.83%)，差異有統(tǒng)計學意義。NS是IMN主要的臨床表現(xiàn)，也是導致腎功能損害的重要因素。因此，出現(xiàn)NS往往提示其預后不良。對于IMN具有NS且易發(fā)展為ESRD的高危患者，美國腎臟病學會推薦利妥昔單抗作為一線治療，但我國此應(yīng)用尚處于起步階段，本組未采用該治療方案，具有PPBCPI特征的IMN患者對其治療反應(yīng)有待進一步分析。此外，IMN組肺栓塞的發(fā)生率為5.06%，與文獻報道相近[20]。

本組77例IMN隨訪12～75個月，其3、5年腎臟無進展生存率分別為90.91%、72.73%，與文獻報道相近。PPBCPI-IMN組的治療緩解率低于非PPBCPI-IMN組(55.8%vs82.6%)，差異有統(tǒng)計學意義。兩組腎臟無進展生存率比較，PPBCPI-IMN疾病進展的風險高于非PPBCPI-IMN(Log-rank：P=0.002)。一些研究認為，持續(xù)性高蛋白尿、血清PLA2R抗體滴度高、eGFR降低、病理分期晚以及嚴重的TIL等是IMN的獨立危險因子[5-10]，但早期階段具有預測價值的病理指標缺乏。本實驗多因素分析顯示PPBCPI為IMN疾病進展的獨立影響變量，其ROC曲線下面積為0.675，敏感性為95.0%，特異性為40.0%。PPBCPI-IMN組中以早期病例為主(70.91%)，即出現(xiàn)PPBCPI的IMN病例大多數(shù)為疾病早期階段，提示PPBCPI可作為IMN早期階段的獨立預后指標。本實驗ROC曲線特異性較低，存在一定的局限性，有待大樣本數(shù)據(jù)或多中心研究進一步證實。

綜上所述，IMN部分患者腎小球小葉間存在PPBCPI免疫病理特征，大多數(shù)為早期病例，多因素分析顯示其為IMN疾病進展的獨立影響變量。因此，PPBCPI可作為IMN疾病早期階段的獨立預后指標。具有PPBCPI病理特征的IMN患者其腎臟疾病進展風險較高，可采取積極的治療方案或者單克隆抗體治療。