賀艷飛 郭小旭 姚培學(xué) 歐陽瑤

外泌體(Exosomes)是由細胞產(chǎn)生的具有生物活性的納米級載體，普遍存在于大多數(shù)體液中。外泌體中富含的微小RNA(microRNA，miRNA)稱為外泌體miRNA，它是一種多功能非編碼RNA，對基因調(diào)節(jié)至關(guān)重要。外泌體miRNA在細胞間物質(zhì)和信號轉(zhuǎn)遞中至關(guān)重要，參與炎癥、細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，從而可能調(diào)節(jié)多種病理過程。外泌體已被視為當(dāng)前研究的熱點。最近的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA在肺部疾病的發(fā)病機理中具有重要意義。本文旨在綜述有關(guān)外泌體miRNA在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)、哮喘、特發(fā)性肺纖維化(IPF)和肺結(jié)核等常見肺部疾病中的研究進展。

外泌體MicroRNA的概述及生物學(xué)特性

一、外泌體的概述

外泌體由晚期內(nèi)體即多囊泡體(multivesicular body，MVB)產(chǎn)生的直徑在30～150 nm的具有雙層脂質(zhì)膜的載體[1]。外泌體由大部分細胞分泌，普遍分布于血漿、血清、痰液和母乳等體液中[2]，其表面表達CD63、CD81、CD9等標(biāo)記蛋白。其可調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，也參與腫瘤的發(fā)病機理中[3]。也有報道，其在組織再生、靶向治療、人工外泌體模擬或作為生物標(biāo)記物中的潛力[4]。在呼吸系統(tǒng)疾病方面也取得了類似的進展。研究表明，外泌體在肺癌、慢阻肺、哮喘、肺結(jié)核和間質(zhì)性肺病等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，可以從支氣管肺泡灌洗液(BALF)、唾液和痰等生物液中分離外泌體[6]。體液中外泌體含量的穩(wěn)定性歸因于其雙層膜結(jié)構(gòu)，并保護了它們作為潛在的生物標(biāo)記物。外泌體已被作為診斷腫瘤等疾病的生物標(biāo)記物及治療工具[7]。但在肺部疾病中，外泌體的研究正處于初始階段。Prado等[8]報道，哮喘小鼠的BALF衍生外泌體的給藥、抑制了IgE反應(yīng)和氣道炎癥。因此，外泌體可能是治療過敏性疾病的候選方式。另一種有望的診療策略是利用外泌體進行氣道炎癥治療，即利用人間充質(zhì)干細胞(MSC)分泌的外泌體。

在實驗小鼠中，人MSC釋放的外泌體系統(tǒng)給藥可改善嗜酸性和中性粒細胞氣道過敏性反應(yīng)[9]。MSC衍生外泌體通過增加外周血中IL-10和TGFβ1表達而具有抗炎作用[10]。目前正在研究，以確定在哮喘或慢阻肺患者中使用MSC的療效性和安全性。利用外泌體進行藥物傳遞具有一定的優(yōu)勢，低免疫原性和毒性的人工外泌體，可以傳遞如miRNA等生物成分給靶細胞。

二、外泌體MicroRNA的概述

miRNA是一種由內(nèi)源性基因編碼的18～22個核苷酸序列構(gòu)成的多功能非編碼RNA，作用于靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達[11]。miRNA是基因表達網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)細胞增殖、死亡、激活細胞遷移、增強免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)血管生成等。細胞內(nèi)異常的miRNA可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的傳遞受損。miRNA作為腫瘤、糖尿病和脂質(zhì)紊亂等多種疾病潛在的無創(chuàng)生物標(biāo)志物[12]。miRNA表達譜，有望作為多種疾病有前景的生物標(biāo)志物，miRNA的檢測可以使用miRNA微陣列、面板型miRNA QPCR板等各種技術(shù)[13]。

外泌體包括miRNA、蛋白質(zhì)、信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)及脂質(zhì)等信號物質(zhì)，經(jīng)自分泌和旁分泌靶向作用于鄰近或遠端細胞，進行細胞之間的信息交換從而調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)功能，在細胞動態(tài)平衡和調(diào)節(jié)生物行為過程中至關(guān)重要[14]。其中富含的miRNA稱為外泌體miRNA。近年報道集中在外泌體miRNA的功能上。Valadi等[15]報道，外泌體含有miRNA的存在，外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)使miRNA免受體液中的酶溶解而維持其穩(wěn)定性，還可攜帶并遞送miRNA至靶細胞進而影響細胞的生物行為和病理生理的發(fā)展，其參與炎癥、細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，從而可能調(diào)節(jié)多種病理過程。外泌體中包括多種RNA，但富含miRNA，其占總RNA的76.2%，以miRNA為主要生物活性物質(zhì)，外泌體中的miRNA的數(shù)量和類型不是隨機分配的，而是由細胞選擇性的分為外泌體內(nèi)含物。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA在慢阻肺、哮喘、IPF等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中具有重要意義[16]，且它們具有非免疫原性和快速提取的特點，因此，外泌體miRNA有希望作為肺部疾病的一種新的診斷和治療的生物標(biāo)志物。

外泌體MicroRNA與慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺病( Chronic Obstructive Pulmonary Disease，簡稱慢阻肺)是以氣道慢性炎癥引起的氣流受限為特點的慢性疾病。支氣管和肺泡上皮細胞作為宿主免疫防御的第一線構(gòu)成部分，當(dāng)受到刺激時，可分泌含有特定miRNA的外泌體分泌到細胞外環(huán)境中，通過激活靜止干細胞和上皮細胞、并恢復(fù)其細胞周期從而促進上皮損傷的修復(fù)[17]。此外，受到損傷細胞分泌的外泌體miRNA通過引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)清除有害應(yīng)激原及促進組織修復(fù)來維持局部微環(huán)境的動態(tài)平衡，從而參與慢阻肺的發(fā)生發(fā)展[18]。據(jù)報道，吸煙者和非吸煙者的BALF中外泌體miRNA 的表達存在差異。Ezzie等[19]對比了健康吸煙者和慢阻肺患者的肺內(nèi)外泌體miRNA水平，在慢阻肺患者的肺中主要觀察到miR-223和miR-1274a的表達增加，提示外泌體miRNA在慢阻肺和非慢阻肺的吸煙者的肺中水平不同，另一項研究側(cè)重于特定的外泌體miRNA在慢阻肺發(fā)生發(fā)展中的作用，Conickx等[20]報道，與非吸煙者比較，無氣流限制的吸煙者和慢阻肺患者肺中的miR- 218-5p水平顯著降低；香煙煙霧誘導(dǎo)的小鼠和人支氣管上皮細胞(HBE)中的miR-218-5p的表達也減少，重要的是，miR-218-5p的表達與氣道阻塞密切相關(guān)。此外，miR-218-5p在人和鼠肺中的細胞定位顯示BE中miR-218-5p的最高表達。用miR-218-5p模擬物或抑制劑進行的動物實驗表明，miR-218-5p對香煙煙霧引起的氣道炎癥有保護作用[20]。BE與成纖維細胞的異常通訊對于氣道重塑至關(guān)重要，最近報道，外泌體miRNA通過調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可促進慢阻肺的發(fā)展。Xu等[21]報道，香煙煙霧可以修飾外泌體miRNA，香煙煙霧刺激的HBE分泌的外泌體miR-21水平高于對照組，且HBE衍生的外泌體miR-21可作為成纖維細胞分化的介質(zhì)；在慢阻肺小鼠模型中，miR-21的表達減少減輕了煙霧刺激的氣道重塑，吸煙者和慢阻肺患者的血清中miR-21表達顯著升高，與FEV1/FVC呈負相關(guān)[21]。Fujita等[22]研究表明，外泌體miR-210可能經(jīng)自噬途徑參與肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，慢阻肺和健康吸煙者的BALF中包括miR-338-3p、miR-204-5p 和 miR-618等23種外泌體miRNA的水平發(fā)生變化。這些差異表達的外泌體 miRNA 與TNFα、NF-κβ 和 MAPK 信號傳導(dǎo)等相關(guān)[23]，表明它們對慢阻肺中持續(xù)的炎癥反應(yīng)有影響。因此，外泌體miRNA有望作為慢阻肺診斷和治療的手段。

外泌體MicroRNA與支氣管哮喘

支氣管哮喘(bronchial asthma，哮喘)是氣道受到非特異性刺激引起的一類氣道炎性疾病，多種細胞如嗜酸性粒細胞等參與發(fā)病。氣道高反應(yīng)性(AHR)、氣道炎癥和氣道重塑是其發(fā)病機理的主要因素[24]。證據(jù)表明，哮喘相關(guān)細胞(如嗜酸性粒細胞)釋放的外泌體miRNA可以充當(dāng)細胞間信息交換的介質(zhì)，從而促進氣道炎癥、AHR和氣道重塑的發(fā)展。據(jù)報道，與健康人相比，哮喘患者的嗜酸性粒細胞中的MVB可釋放更多外泌體miRNA[25]。另一項報道，哮喘患者的嗜酸性細胞來源的外泌體miRNA可促進小氣道上皮細胞的凋亡和支氣管平滑肌細胞的增生，這是造成氣道重塑的重要因素[26]。在某些情況下，盡管相同的外泌體miRNA可能在組織中減少，但氣道相關(guān)體液中的外泌體miRNA增加。在家塵螨(HDM)刺激的哮喘小鼠模型中，與空白組比較，模型組的BALF中外泌體miRNA明顯升高。這些外泌體miRNA上調(diào)了31個基因的表達，包括IL-13和IL-5Ra，它們分別是miR-346和miR-574-5p的推測靶點[14]。因此，當(dāng)特定的miRNA被外泌體攜帶并傳遞時，細胞內(nèi)基因被積極調(diào)控。Maes等[27]報道，與健康受試者相比，重度哮喘患者痰中三種外泌體miRNA(miR-629-3p，miR-223-3p 和 miR-142-3p)水平升高，miR-223-3p和miR-142-3p的表達與氣道阻塞(FEV1 / FVC)相關(guān)。HBE中 miR-629-3p 的上調(diào)誘導(dǎo)了促炎細胞因子IL-8的表達，表明該外泌體miRNA可能與嗜中性哮喘的炎癥表型有關(guān)。Collison等[28]報道，在哮喘小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)miR145參與氣道平滑肌細胞的增殖和上皮細胞炎癥的發(fā)生；抑制miR-145表達時可減輕嗜酸性炎癥、粘液高分泌和AHR。因此，外泌體miRNA在哮喘的發(fā)病機制中具有重要意義，進一步研究有望將外泌體miRNA作為生物標(biāo)記物候選物，可以鑒別哮喘及其類型，從而提高未來診斷和治療的有效性。

外泌體MicroRNA與特發(fā)性肺纖維化

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)是一種不可逆的、漸進性的、原因不清的肺部疾病，可在診斷后2～3年內(nèi)導(dǎo)致死亡，IPF的特征是由纖維化“瘢痕”形成引起肺結(jié)構(gòu)進行性和不可逆轉(zhuǎn)的破壞，最終導(dǎo)致器官破壞和呼吸衰竭而死亡[29]。在環(huán)境壓力的影響下，源自肺免疫細胞的外泌體的數(shù)量會急劇增加，其組成也會發(fā)生變化(如miRNA)。幾項研究表明，這些改變的外泌體miRNA與炎癥和纖維化相關(guān)的肺部疾病的進展有關(guān)。Yao等[30]發(fā)現(xiàn)，在IPF大鼠模型中，M2巨噬細胞來源的外泌體過表達 miR-328可促使肺間質(zhì)成纖維細胞的增殖，并通過調(diào)節(jié)家族序列相似性13成員A(FAM13A)基因而促進肺纖維化的進展。Njock等[6]已發(fā)現(xiàn)3個miRNA(miR-142-3p，miR-33a-5p，let-7d-5p)在IPF患者的痰源性外泌體中與健康受試者相比異常表達。有趣的是，miR-142-3p與單位肺泡容積的彌散量(DLCO/VA)呈負相關(guān)，這表明痰中的外泌體miRNA與肺纖維化的程度有關(guān)。外泌體miR-29c具有保持上皮完整性，促進損傷的修復(fù)，并減少纖維化的作用，動物實驗表明，與健康小鼠相比，IPF小鼠模型中II型肺泡上皮細胞中的外泌體miR-29c減少[31]。因此，外泌體中包括有益的 miRNA(如 miR-29c)可能是針對IPF的新型靶向治療模式。外泌體miRNA有希望作為IPF診斷、治療和嚴重程度評估的生物標(biāo)記物。

外泌體MicroRNA與肺結(jié)核

肺結(jié)核(Pulmonary Tuberculosis，PTB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的呼吸系統(tǒng)感染且具有傳染性的疾病。如果不被宿主的免疫防御系統(tǒng)清除，感染人體的Mtb會在宿主細胞(尤其是巨噬細胞)中存活[32]。因此，Mtb與宿主免疫細胞(如巨噬細胞)之間的相互作用可能會影響結(jié)核病(TB)的發(fā)生與發(fā)展。感染了Mtb 的巨噬細胞可以將特定外泌體miRNA釋放到細胞外。研究證明，被牛分枝桿菌卡介苗感染的單核細胞衍生巨噬細胞能夠釋放特定的外泌體miRNA，包括 miR-1224、miR-1293、miR-425、miR- 4467、miR-4732、miR-484、miR-5094、miR-6848、miR- 6849、miR-4488 和 miR-96[33]。Alipoor等[34]從11種表達量最高的外泌體 miRNA 中選擇3種外泌體miRNA(miR-484/miR-425 和 miR-96)作為診斷生物標(biāo)志物，以評估其對PTB的診斷價值。ROC曲線分析表明，血清外泌體 miR-484、miR-425和miR-96的AUC值分別為 0.72、0.66和0.62，并且通過涂片陽性程度發(fā)現(xiàn)三種血清外泌體miRNA與結(jié)核感染的程度密切相關(guān)?？紤]到這些表達不同的外泌體miRNA可能成為肺結(jié)核診斷的生物標(biāo)記物，需進一步的研究以闡明這些外泌體miRNA參與肺結(jié)核的發(fā)病機制，從而開發(fā)診斷和治療該病的新靶點。

展 望

外泌體miRNA介導(dǎo)細胞間通訊，成為研究熱點，越來越多的研究表明外泌體miRNA在肺部疾病(如慢阻肺、哮喘、IPF和肺結(jié)核)中的表達異常，在其發(fā)病機理中具有重要意義。本文主要闡述了外泌體miRNA在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用。探討了其作為生物標(biāo)志物的潛力，可能在臨床上用作診斷和管理肺部疾病的生物標(biāo)志物及治療手段。對慢阻肺、哮喘、IPF和肺結(jié)核等肺部疾病中的外泌體miRNA的研究尚處于起步階段，需要進一步的研究外泌體miRNA介導(dǎo)肺部疾病的發(fā)病機理，并揭示它們在疾病進展中扮演的角色。未來關(guān)于外泌體miRNA對呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制的貢獻的研究將為其在該領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供前景。