楊再俊 鄭家瑞 潘鵬程 潘寅濤 高彬 李云洲

摘 要：番茄是現(xiàn)代蔬菜的支柱產(chǎn)業(yè)，也是脫貧攻堅的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，為了滿足番茄生產(chǎn)種對抗病抗逆性的需求，挖掘利用抗病資源育種越來越被關(guān)注，本研究利用已明確的番茄根結(jié)線蟲抗性基因Mi，抗PVY病毒病基因Pvr4，抗番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）基因Ty-1/Ty-3，對貴州本土16個番茄種質(zhì)資源進行分子標記篩選。結(jié)果表明：通過三對根結(jié)線蟲抗性分子標記REXF1/REXR2、PM3Fb/PM3Rb和Mi23F/Mi23R對16個番茄種質(zhì)資源進行檢測，結(jié)果顯示所有材料均含Mi基因，但是通過PMiF3/PMiR3對其檢測，結(jié)果顯示只有GZ09、GZ14、GZ10、GZ13等4個番茄材料含有Mi基因，而其他品種均不含Mi基因;另外，本研究通過Pvr4/Pvr7-F和Pvr4/Pvr7-R引物對16個番茄種質(zhì)資源的馬鈴薯Y病毒（PVY）抗性分子標記進行檢測，結(jié)果只有GZ04、GZ07和GZ06三個番茄材料含有Pvr4基因;用TYLCV抗性分子標記引物qR180/qF180擴增 16 個番茄材料，結(jié)果顯示，GZ02、GZ19、GZ04、GZ07、GZ01、GZ08、GZ09、GZ03、GZ16、GZ05、GZ13、GZ18、GZ11等13個番茄品種含有抗性基因Ty1/Ty3。綜合分析三種抗病分子標記，確定GZ04、GZ07和GZ06為三個優(yōu)異抗病材料，可用于將來的番茄抗病育種，本研究初步明確了貴州大學(xué)16個番茄種質(zhì)資源的抗性分子標記，為番茄抗病育種提供材料選擇，為貴州省‘紅酸湯產(chǎn)業(yè)奠定材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄;抗性基因;分子標記;種質(zhì)資源

中圖分類號：S641.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2021）06-0030-07

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.06.004

Abstract：Tomato is a pillar industry of modern vegetables and an advantageous industry for poverty alleviation.In order to meet the demand for disease and stress resistance in tomato production，more and more attention has been paid to the exploitation and utilization of resistance resources for breeding.This study used theresistance gene Mi of tomato root-knot nematode resistance gene Mi，the resistance gene Pvr4 of PVY virus disease，and resistance gene Ty-1/Ty-3 of tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）to identify the resistance molecular marker about 16 tomato germplasm resources from Guizhou.Sixteen tomato germplasm resources were tested by three pairs of root-knot nematode resistance molecular markers ?REXF1/REXR2，PM3Fb/PM3Rb ?and Mi23F/Mi23R.The results showed that all materials contained Mi genes.When these materials were tested by PMiF3/PMiR3，the test results showed that only 4 tomato materials，such as GZ09，GZ14，GZ10，GZ13，contained Mi genes.In addition，this study used Pvr4/Pvr7-F and Pvr4/Pvr7-R primers to detect the potato virus Y（PVY）resistance molecular markers of 16 tomato germplasm resources.Only three tomato materials（GZ04，GZ07 and GZ06）contained Pvr4 gene.Sixteen tomato materials were amplified with TYLCV resistance molecular marker primer qR180/qF180.Thirteen tomato varieties contained the resistance gene Ty1/Ty3，such as GZ02，GZ19，GZ04，GZ07，GZ01，GZ08，GZ09，GZ03，GZ16，GZ05，GZ13，GZ18，GZ11，etc.GZ04，GZ07 and GZ06 were determined to be the excellent materials by comparing the three resistance molecular markers，which can be used for resistant breeding in tomato.This study has preliminarily clarified the resistance molecular markers of 16 tomato germplasm resources from Guizhou University，which provides material selection for tomato resistance breeding，and lays a material foundation for the "red and sour soup" industry in Guizhou Province.

Keywords：tomato;resistance gene;molecular marker;germplasm resources

番茄（Solanum lycopersicum L.），屬于茄科（Solanaceae）蔬菜作物，因其經(jīng)濟價值高，已成為現(xiàn)代蔬菜的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，更是脫貧攻堅的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。目前，中國番茄產(chǎn)量排名世界第一，在我國乃至地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮重要作用。另外，番茄也是貴州省特色‘紅酸湯的基本原料，在貴州省番茄的產(chǎn)量和種植面積呈穩(wěn)步增長趨勢[1]。番茄在貴州省種植歷史悠久，其中野生番茄具有較高的抗逆性和抗病性[2]，但經(jīng)過育種工作者的長期定向選育，很多野生番茄中攜帶的優(yōu)異基因丟失[3]，如番茄裂果[4]、長花柱表型不穩(wěn)定[5]。目前，栽培番茄生產(chǎn)過程中面臨嚴重的病蟲害威脅，日益增長的病害成為番茄生產(chǎn)的一大威脅，病害嚴重影響了番茄的產(chǎn)量與質(zhì)量。當(dāng)前對我國番茄產(chǎn)生為害的主要病害有番茄黃化曲葉病毒?。═omato Yellow Leaf Curl Virus，TYLCV）、番茄斑萎毒病（Tomato Spotted Wilt Virus，TSWV）、番茄早疫病、番茄灰霉病、番茄葉霉病、番茄根結(jié)線蟲病、番茄青枯病、番茄枯萎病、番茄細菌性髓部壞死病等[6-10]。因此，針對番茄生產(chǎn)中的主要病害，進行對番茄抗病種質(zhì)的篩選、創(chuàng)制和優(yōu)質(zhì)多抗番茄品種的選育對于當(dāng)前番茄抗病、抗逆育種是必要的選擇。

與傳統(tǒng)雜交育種相比，高效分子標記輔助育種技術(shù)有很多優(yōu)勢，如縮短育種時間，快速檢測抗病基因、成本低等。目前關(guān)于番茄抗性基因或分子標記有很多，如番茄黃化曲葉病毒抗性分子標記有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4、Ty-5、Ty-6[11-20]，其中，Ty-1/Ty-3是一對等位基因，Verlaan等[18]發(fā)現(xiàn)Ty-1/Ty-3定位于6號染色體的同一區(qū)域，該區(qū)域有R170、R180和R190三個基因，通過VIGS沉默R180，植株抗性消失，該結(jié)果表明R180是Ty-1/Ty-3抗性標記的關(guān)鍵基因。番茄抗根結(jié)線蟲（Root-Knot Nematodes）基因Mi-1;抗馬鈴薯Y病毒（PYV）基因/分子標記主要有va、va1、va2、lF4E-pvr2、Pvr4/Pvr7 [21-22]。正是得益于分子標記輔助育種技術(shù)的快速發(fā)展，我國番茄育種事業(yè)才取得快速發(fā)展，如侯富恩等[23]利用與Ty-1、Ty-2、Ty-3連鎖的分子標記P6-6、T0302、P6-25篩選出同時含有‘TY1-2和‘TY1-3的聚合單株，通過抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)該單株均含有Ty-1和Ty-2、Ty-1和Ty-3抗病基因;劉夢姣等[24]通過田間抗性表型結(jié)合分子標記輔助育種技術(shù)，篩選櫻桃番茄抗晚疫病材料，確定了TL32、TL101兩個番茄材料不僅對晚疫病有良好抗性，而且還抗TYLCV（攜帶Ty-2抗性基因）;孟凡娟等[25]采用群體分離分析法（Bulk segregation analysis，BSA）和隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)篩選與抗病基因連鎖的分子標記研究番茄抗葉霉病和感葉霉病親本組合（03036×03748）的 F2分離群體，結(jié)果確定該番茄特異性葉霉病抗性基因Cf6。Arnedo-Andrés等[26]利用BSA發(fā)現(xiàn)與Pvr4基因相關(guān)的RAPD分子標記。Devran等[27]將番茄6號染色體上抗根結(jié)線蟲的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標記序列轉(zhuǎn)化為KASP基因分型試驗，使用共顯性序列特征擴增區(qū)（ sequence characterized amplified regions， SCAR）引物對Mi23F/Mi23R特異性的擴增番茄品種Mi基因部分，結(jié)果表明，KASP法適用于番茄育種中大群體的高通量篩選。

為了滿足番茄生產(chǎn)對抗病、抗逆品種的需求，加速番茄育種，本試驗采用分子標記輔助育種手段，對貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院番茄種質(zhì)資源庫中16個本土材料，進行抗病分子標記篩選，為番茄高聚合抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料均為來自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室（表1），材料于2019年4-10月在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院本科教學(xué)實習(xí)基地進行。

1.2 抗性基因的分子標記檢測

1.2.1 總DNA的提取

參照TIANGEN公司植物組DNA提取試劑盒（型號：DP180123）說明書進行提取番茄總DNA，DNA 樣品于 -20 ?℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗根結(jié)線蟲基因的分子標記檢測

番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因CAPS引物REXF1/REXR2序列見表2。PCR反應(yīng)體系20 ?μL，包括1.0 ?μL gDNA模板，正反向引物各1.0 ?μL，10 ? μL 2×Taq Master Mix（Novoprotein Scientific Inc.），7 ?μL ddH2O共20 ?μL。反應(yīng)程序為：預(yù)變性94 ?℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 0.5 min，延伸72 ℃ 1 min，35個循環(huán)。72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因引物對組合PM3Fb/PM3Rb和PMiF3/PMiR3[28]的序列見表2，反應(yīng)程序參照REXF1/REXR2[28]檢測體系，退火溫度分別為54 ?℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因SCAR引物Mi23F/Mi23R序列見表2。反應(yīng)程序參照REXF1/REXR2檢測體系，退火溫度分別為56 ?℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 抗PVY病毒病基因的分子標記檢測

抗 PVY Pvr4位點的 CAPS 標記引物對PM3Fb/PM3Rb序列見表2。反應(yīng)程序參照REXF1/REXR2檢測體系，退火溫度分別為 55 ?℃。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 抗黃化曲葉病毒基因的檢測

抗黃化曲葉病毒Ty1/Ty3基因引物對qF180/qR180[18]序列見表2。反應(yīng)程序參照REXF1/REXR2檢測體系，退火溫度分別為 56 ?℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗根結(jié)線蟲基因的檢測

2.1.1 CAPS 法檢測Mi基因

采用引物REXF1/REXR2擴增各番茄品種基因組 DNA 的 REX-1 位點，結(jié)果顯示：所有供試番茄品種都能擴增出 1 條約 740 bp 的特異條帶。表明供試的所有番茄品種均含有Mi基因（圖 1）。

2.1.2 引物對組合PM3Fb/PM3Rb檢測Mi基因

用引物對PM3Fb/PM3Rb 擴增 16 個番茄品種的基因組 DNA，結(jié)果顯示：GZ09、GZ14、GZ10、GZ13等4個番茄品種能擴增出一條550 bp的特異條帶，其余12個番茄品種不能擴增出條帶。表明只有GZ09、GZ14、GZ10、GZ13等4個番茄品種含有Mi基因（見圖2）。

2.1.3 引物對組合PMiF3/PMiR3檢測 Mi基因

用引物對PMiF3/PMiR3擴增 16 個番茄品種的基因組 DNA，結(jié)果顯示：僅GZ14能擴增出550 bp和350 bp兩條條帶，顯示為Mi/mi雜合基因型，GZ10和GZ13能擴增出550 bp的條帶，其余13個番茄品種均能擴增出350 bp的條帶，顯示為Mi/Mi純合基因型。表明除GZ10、GZ13和GZ14其余13個番茄材料均含有純和的Mi基因（見圖3）。

2.1.4 SCAR 標記檢測 Mi基因

用引物對Mi23F/Mi23R擴增 16 個番茄品種的基因組 DNA，結(jié)果顯示：所有供試番茄品種都能擴增出1條380 bp的特異性條帶，表明它們?yōu)镸i/Mi純合基因型，即含有Mi基因（見圖4）。

2.2 引物對Pvr4/Pvr7-F和Pvr4/Pvr7-R檢測Pvr4基因

用引物對Pvr4/Pvr7-F和Pvr4/Pvr7-R擴增 16 個番茄品種的基因組 DNA，結(jié)果顯示：GZ04、GZ07和GZ06等3個品種能擴增出一條444 bp的獨立條帶，GZ19、GZ08、GZ14、GZ10、GZ16、GZ13、GZ18、GZ11等品種擴增出雜合條帶，其余品種均未能擴增出條帶。表明GZ04、GZ07和GZ06含有Pvr4基因，GZ19、GZ08、GZ14、GZ10、GZ16、GZ13、GZ18、GZ11等品種可能含有Pvr4基因，而其余品種均不含Pvr4基因（見圖5）。

2.3 引物對qF180/qR180檢測Ty1/Ty3基因

用引物對qR180/qF180擴增 16 個番茄品種的基因組 DNA，結(jié)果顯示：GZ02、GZ19、GZ04、GZ07、GZ01、GZ08、GZ09、GZ03、GZ16、GZ05、GZ13、GZ18、GZ11等13個番茄品種能擴增出特異性條帶，表明其含有抗性基因Ty1/Ty3;而GZ14、GZ10、GZ06等三個品均不能擴增出特異性條帶，表明其不含抗性基因（見圖6）。

3 結(jié)論與討論

為了明確貴州大學(xué)番茄種質(zhì)資源中16個本土番茄資源的抗性情況，本試驗采用分子標記輔助育種手段，結(jié)果顯示16個本土材料基本覆蓋目前抗病育種所需要的基因資源，可根據(jù)目標抗性進行配合育種。

由Mi基因調(diào)控的寄主抗性在許多商業(yè)番茄品種中都存在，并且對最常見的熱帶根結(jié)線蟲（南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica ）和沙蠶根結(jié)線蟲（Radix nodus Nematodae）有效。這種抗性有一些缺點，如缺乏對其他常見根結(jié)線蟲物種，如北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla）和象耳豆根結(jié)線蟲（Meloidogyne enterolobii）線蟲的活性，南方根結(jié)線蟲（M.incognita）抗性破壞小種的廣泛出現(xiàn)，以及據(jù)報道的Mi基因的熱特性[29]。本試驗在番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因的檢測中，利用三對引物REXF1/REXR2、PMiF3/PMiR3、Mi23F/Mi23R進行檢測結(jié)果基本一致，所有參試番茄品種均含有Mi基因;但在PM3Fb/PM3Rb檢測Mi基因的結(jié)果與以上三對引物的結(jié)果不一致，可能該基因?qū)Σ煌N類的根結(jié)線蟲抗性不同，其檢測出的結(jié)果中，只有GZ09、GZ14、GZ10、GZ13等4個番茄品種含有Mi基因，而其他品種均不含Mi基因。同樣檢測番茄抗根結(jié)線蟲Mi基因的引物出現(xiàn)的不同結(jié)果，即PM3Fb/PM3Rb檢測Mi基因的結(jié)果與其他三對引物的檢測結(jié)果有差異，這種差異可能是由于不同抗性基因?qū)Σ煌N類的根結(jié)線蟲的抗性不同造成的，這與戴均濤等[28]進行的方法比較結(jié)果一致;不同的是，引物對PM3Fb/PM3Rb檢測Mi基因的結(jié)果不含Mi基因的番茄品種，而本試驗中PM3Fb/PM3Rb檢測Mi基因的結(jié)果中仍然有含Mi基因的番茄品種，可能是品種的不同引起的結(jié)果差異，也可能是分子標記中存在的假陽性引起的差異。在將來的抗根結(jié)線蟲研究中，要明確與Mi基因?qū)?yīng)的根結(jié)線蟲種類。另外可以利用QTL定位技術(shù)精確定位抗性基因[30]，也可以通過基因編輯技術(shù)定向改變植株性狀[31]，另外為了提高番茄抗病育種效率可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或RNA干擾（RNAi）技術(shù)干擾病毒基因保守片段[32]。

本研究發(fā)現(xiàn)部分材料（GZ04、GZ07和GZ06）含有抗PVY基因Pvr4，而Hu等[33]發(fā)現(xiàn)番茄Tm-2（2）基因可以抵抗多種病毒，如TMV，ToMV，PVX和PVY，而這些材料是否含有Tm-2（2）基因，仍需進一步研究。GZ19、GZ08、GZ14、GZ10、GZ16、GZ13、GZ18、GZ11等品種出現(xiàn)了擴增雜合條帶的情況，可能含有Pvr4基因，推測其原因，可能是退火溫度略有不同，也可能是番茄品種的差異性。

抗TYLCV檢測結(jié)果表明GZ02、GZ19、GZ04、GZ07、GZ01、GZ08、GZ09、GZ03、GZ16、GZ05、GZ13、GZ18、GZ11等13個番茄品種含有抗性基因Ty1/Ty3。結(jié)合Pvr4抗性番茄種質(zhì)，表明GZ04、GZ07和GZ06 3個品種含有抗根結(jié)線蟲基因Mi，可以應(yīng)用于番茄抗根結(jié)線蟲育種，同時兼?zhèn)淇筆VY病毒病Pvr4抗性基因、抗根結(jié)線蟲Mi基因和抗黃化曲葉病毒Ty1/Ty3基因，在后續(xù)的育種工作中應(yīng)重視對GZ04、GZ07和GZ06這3個番茄品種的開發(fā)與利用。

本試驗利用 6 對與抗根結(jié)線蟲基因、抗PVY病毒病基因以及抗TYLCV基因緊密連鎖的分子標記，對 16個番茄品種開展了抗性基因的分子檢測，明確了16個本土番茄材料的抗性分子標記，為番茄抗病育種提供了材料基礎(chǔ)。

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