叢登立，孟憲蘭，李鵬飛

（1.吉林大學藥學院，長春130021；2.通化盛吉信生物科技股份有限公司，通化134008；3.修正藥業(yè)集團股份有限公司，通化134008）

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,稱之為地熏、茈胡,《本草綱目》載“治陽氣下陷,平肝、膽、三焦,包絡(luò)相火以及頭痛、眩暈、目昏諸瘧及婦人熱入血室、經(jīng)水不調(diào)、小兒痘疹余熱、五疳羸熱”等。柴胡作為傳統(tǒng)中藥材具有疏散退熱,疏肝解郁,升舉陽氣作用。臨床常用于感冒發(fā)熱,寒熱往來,胸脅脹痛,月經(jīng)不調(diào),子宮脫垂,脫肛等病癥[1]。藥典2020版規(guī)定柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzoneri-folium Willd.的干燥根。近代對柴胡根研究較多,柴胡根中主要有效成分是柴胡皂苷[2],具有抗炎、保肝、對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)起作用等多種生物學活性[2],具有抗腫瘤作用,其對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用[3,4,5,6]。一直以來,柴胡根用于入藥,地上部分莖葉棄之不用,造成柴胡地上部分資源大量浪費,近年不斷有實驗研究發(fā)現(xiàn)柴胡地上部分莖、葉含有黃酮類等多種有效成分,具有解熱鎮(zhèn)痛、對心血管系統(tǒng)具有一定治療作用[4,6]。本文對柴胡地上部分莖葉總黃酮提取方法及莖葉總黃酮生物活性進行抗疲勞作用研究,為挖掘柴胡的藥用部位,更好地開發(fā)利用柴胡這一傳統(tǒng)中藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥材柴胡地上部分莖和葉(柴胡采自吉林省榆樹市大坡鎮(zhèn)柴胡種植基地,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學胡廣權(quán)教授鑒定為北柴胡),自然晾干。

1.1.2 實驗動物

健康昆明種小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量20.0～22.0g,由吉林大學實驗動物中心提供,動物合格證號：醫(yī)動字第（吉）2020-0001。

1.1.3 試劑

肝糖原、肌糖原、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、血乳酸（blood lactic acid,LAC）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；無水乙醇（AR）購自成都科隆化學品有限公司。

1.1.4 主要儀器

紫外可見分光光度計(日本日立HITACHI U-1900)；Eppendorf高速離心機(contrifuge5810R)；EL204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SIB-III型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 柴胡莖葉總黃酮提取

采用正交實驗對提取條件（溶劑濃度、浸泡時間、料液比、提取時間）進行優(yōu)化,以柴胡莖葉總黃酮提取率和浸膏得率為指標確定柴胡莖葉總黃酮提取方法。

稱取柴胡地上部分粗粉2.00g,置入1000mL燒瓶,并加入體積分數(shù)50%乙醇溶液200mL,室溫浸泡過夜,然后電熱套加熱回流60min,冷卻后減壓過濾,濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃以下減壓蒸干稱重得117mg,柴胡莖葉總黃酮提取率5.85%。同法制備柴胡莖葉總黃酮水溶液1.0g·mL-1備用。

1.2.2 實驗動物分組與用藥健康昆明種小鼠,雌雄各半隨機分為5組,每組10只：陰性對照組（蒸餾水）、陽性對照組（復方高山紅景天口服液）和3個不同劑量柴胡莖葉總黃酮水溶液組即低劑量組（濃度為0.25g·mL-1）；中劑量組（濃度為0.5g·mL-1）和高劑量組（濃度為1.0g·mL-1）。小鼠分籠飼養(yǎng),標準動物飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,3個給藥組按規(guī)定劑量每天分別灌胃。陽性對照組每天用復方高山紅景天口服液灌胃,每次灌胃量按小鼠體質(zhì)量以0.02g·mL-1灌胃,陰性對照組每天灌胃同量蒸餾水。實驗周期為4周。

1.2.3 運動小鼠肝糖原和肌糖原含量活力測定

各組最后1次給藥后20min,將小鼠尾部負荷2g的鉛塊,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水休息20min后,眼眶取血,肝素抗凝,立即脫頸椎處死。取肝臟和肌肉樣本各100mg,用生理鹽水2mL漂洗后濾紙吸干,按標本質(zhì)量（mg）：堿液體積（μL）=1：3（即肝臟、肌肉10mg與300μL堿水）加入試管中,每管勻漿3～5min,勻漿液以3000r·min-1離心10min,上清液置沸水浴煮20min,流水冷卻,加入蒸餾水定溶。按試劑盒要求加入試劑?；靹蚝笾梅兴兄?min,冷卻后于620nm波長,測定各管吸光度（A）值。

1.2.4 運動小鼠LDH活力及LAC、BUN含量測定

最后1次給藥20min后,將小鼠尾部負荷2g的鉛塊,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水后休息20min,眼眶取血1次。所得血液樣品加入0.3mL蛋白沉淀劑和肝素抗凝后輕輕顛倒混勻,靜置10min后,以3000r·min-1離心8min,分離血清。分別采用LAC、BUN、LDH相關(guān)試劑盒并按要求測定。

1.2.5 運動耐力測定

各組在最后1次給藥30min后,將小鼠放入水深30cm、水溫25.0℃±0.5℃的水中游泳,鼠尾部負荷2g的鉛塊,記錄小鼠自游泳開始至力竭死亡的時間（小鼠自游泳開始至沉入水中10 s不能浮出水面,且放在平面時無法完成翻正反射的連續(xù)游泳時間）。

1.2.6 運動小鼠SOD活力測定

各組在最后1次給藥30min后,將小鼠尾部負荷2g的鉛塊,放入25.0℃±0.5℃的水中游泳60min,出水后休息30min立即脫頸椎處死。取肝組織約200mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,試紙拭干,稱質(zhì)量,放入盛有組織塊質(zhì)量9倍的預冷的生理鹽水玻璃杯內(nèi)。盡快剪碎組織塊,并倒入勻漿管中進行勻漿。將制備好的10%勻漿用低溫離心機3500r·min-1離心10min。采用SOD試劑盒測定。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果分析

2.1 柴胡莖葉總黃酮提取條件優(yōu)化結(jié)果

柴胡莖葉總黃酮提取溶劑濃度為50%、提取前浸泡過夜、溶劑用量為藥材的10倍、最優(yōu)的提取時間為60min,柴胡地上部分總黃酮提取率及浸膏得率為最佳條件選擇指標。

2.2 柴胡莖葉總黃酮對運動小鼠肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影響

與陰性和陽性對照組比較,柴胡莖葉總黃酮提取物三個劑量組明顯提高運動后小鼠肝糖原、肌糖原水平和運動小鼠LDH活力,降低LAC及BUN含量水平（P＜0.01）。柴胡莖葉總黃酮三個劑量組明顯提高運動小鼠SOD活力（P＜0.05）。詳見表1。

表1 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠游泳后肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影響Table 1 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on liver glycogen,muscle glycogen,LDH,LAC,BUN and SOD after swimming in mice（n=10,±s）

表1 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠游泳后肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD的影響Table 1 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on liver glycogen,muscle glycogen,LDH,LAC,BUN and SOD after swimming in mice（n=10,±s）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with negative control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with positive control group.

GroupHepatic glycogen（WB/mg·g-1）LAC（cB/mmol·L-1）Negative control 13.22±0.103.36±0.052957±4376.81±0.26 Positive control25.66±0.296.57±0.934289±4835.99±0.12 Low dose34.35±0.27＊8.19±0.19＊4877±415＊4.92±0.15 Middle dose36.72±0.16＊△8.51±0.16＊4981±462＊＊△4.83±0.14 High dose42.89±0.21＊＊△8.95±0.12＊△△5116±512＊＊△4.79±0.12＊△Muscle glycogen（WB/mg·g-1）LDH（λB/U·L-1）BUN（cB/mmol·L-1）9.13±1.98 8.79±1.46 6.82±0.89＊7.66±1.50 7.25±1.78 SOD（λB/U·mg-1）363.66±27.63 370.17±33.87 453.96±36.11＊477.67±34.95＊△498.36±35.89＊△

2.3 柴胡莖葉總黃酮對小鼠運動耐力的影響

與陰性和陽性對照組比較,柴胡莖葉總黃酮提取物三個劑量組小鼠負重游泳時間明顯延長（P＜0.01）,表明柴胡莖葉總黃酮具有提高小鼠耐力作用。詳見表2。

表2 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠負重游泳時間的影響Table 2 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on swimming time of mice（n=10,±s t/min）

表2 柴胡莖葉總黃酮提取物對小鼠負重游泳時間的影響Table 2 Effect of Bupleurum stalk and leaf total flavonoids extract on swimming time of mice（n=10,±s t/min）

*P＜0.05,**P＜0.01 compared with negative control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with positive control group.

GroupLoaded swimming time Negative control96.67±1.07 Positive control115.46±1.15 Low dose129.25±1.19＊△Middle dose133.66±0.93＊△High dose137.49±1.02＊＊△△

3 討論

通過對比分析后確定柴胡莖葉提取所用溶劑和提取方法。柴胡莖葉總黃酮提取過程中對提取前浸泡時間、料液比和提取時間采用正交方法進行優(yōu)化設(shè)計,這幾個因子對柴胡地上部分總黃酮提取率及浸膏得率均有影響,但料液比和提取時間對其提取率和浸膏得率的影響較大。

運動小鼠給予柴胡莖葉總黃酮提取物三個劑量后均能使肝糖原、肌糖原、LDH、LAC、BUN和SOD含量發(fā)生變化,并延長小鼠負重游泳時間。在負重游泳實驗中,與陰性和陽性對照組比較,柴胡莖葉總黃酮提取物的3個劑量組都能提高運動小鼠運動耐力。肝糖原的作用是輸出葡萄糖來補充血糖的消耗,保持血糖的正常水平。血糖作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本燃料,是長時間骨骼肌可動用的必需燃料。糖是肌肉活動時能量的重要來源[7,8]。本研究表明柴胡莖葉總黃酮提取物具有抗疲勞作用,其作用機制可能是柴胡莖葉總黃酮提取物中某些成分促進了脂肪向糖的轉(zhuǎn)化、不斷補充運動后血糖的消耗,增加糖元的儲備、維持血糖的正常水平從而保護肌細胞膜完整性,保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)、運動肌等組織的糖供給,延緩運動性疲勞的產(chǎn)生[9,10]。