亓淑芬，夏紅旻，張樂青

（1. 陽谷縣人民醫(yī)院，山東 陽谷 252300；2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014）

健脾通便合劑由白術(shù)、黨參、木香、陳皮、桃仁、甘草六味中藥組成，具有健脾理氣，潤腸通便之功效，用于治療脾虛氣滯型便秘，癥見大便干結(jié)，欲便不出，腹中脹滿，食欲不振，腸鳴矢氣。白術(shù)味苦、甘，歸脾、胃經(jīng)，能益氣補脾、生津潤腸，助運之力強，可促進(jìn)腸道蠕動，通便[1]；黨參味甘、性平，歸脾、肺經(jīng)，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功效，用于脾肺氣虛、食少倦怠、咳嗽虛喘、氣血不足、面色萎黃、心悸氣短、津傷口渴、內(nèi)熱消渴等癥[2]；木香可行氣止痛，健脾消食[3]；陳皮主要有理氣、燥濕兩種功效，常用于脾胃不和、嘔吐、咳嗽、脹滿不食等[4]。為了更好地控制我院制劑健脾通便合劑的質(zhì)量，參照相關(guān)文獻(xiàn)，制定了木香和陳皮的薄層色譜（TLC）鑒別、pH值及相對密度測定法和橙皮苷含量測定的高效液相色譜法（HPLC），經(jīng)驗證，制定的方法準(zhǔn)確可靠，能有效控制健脾通便合劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；FA1204型天平（上海菁海儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 試藥

木香對照藥材（批號：120921-201204），橙皮苷對照品（批號：110721-201316，中國食品藥品檢定研究院）；健脾通便合劑（批號：20200411，20200413，20200415，陽谷縣人民醫(yī)院自制）；甲醇、醋酸均為色譜純，水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 性狀

本品為棕色液體；氣微，味微苦。

2.2 TLC鑒別

2.2.1 木香的TLC鑒別 取本品30 ml，加二氯甲烷提取2次，每次30 ml，每次提取30 min，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。另稱取木香對照藥材0.5 g，加二氯甲烷10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。按處方量稱取藥材（木香除外），加水3500 ml浸泡2 h，第一次煎煮60 min，過濾，濾渣再加水3500 ml煎煮60 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮至約1000 ml，靜置24 h，過濾，加水至1000 ml，攪勻，分裝，滅菌，即得缺木香的陰性溶液。取陰性溶液30 ml，加二氯甲烷提取2次，每次30 ml，每次提取30 min，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作為陰性對照溶液。吸取陰性對照溶液5 μl，供試品溶液5 μl，對照品溶液3 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-環(huán)已烷（5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.5 %香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果見圖1。

圖1 木香TLC鑒別

2.2.2 陳皮的TLC鑒別 取本品20 ml，置分液漏斗中，乙醚振搖提取兩次，每次20 ml，每次提取30 min，棄去乙醚液，水液用乙酸乙酯提取2次，每次30 ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 ml含2 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方量稱取藥材（陳皮除外），加水3500 ml浸泡2 h，第一次煎煮60 min，過濾，濾渣再加水3500 ml煎煮60 min，過濾，合并兩次濾液，濃縮至約1000 ml，靜置24 h，過濾，加水至1000 ml，攪勻，分裝，滅菌，即得缺陳皮的陰性溶液。取陰性溶液20 ml，置分液漏斗中，用乙醚振搖提取兩次，每次20 ml，每次提取30 min，棄去乙醚液，水液用乙酸乙酯提取2次，每次30 ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為陰性對照溶液。吸取陰性對照溶液3 μl，供試品溶液3 μl，對照品溶液6 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（10:1.7:1.3）為展開劑，展距3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）的上層溶液為展開劑，展距8 cm，取出，晾干，噴1 %三氯化鋁甲醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖2。

圖2 陳皮TLC鑒別

2.3 pH值

3批樣品參照pH值測定法[5]，依法檢查，結(jié)果3批樣品的pH值分別為5.13，5.16，5.19，pH平均值為5.16。

2.4 相對密度

3批樣品參照相對密度測定法[5]，依法檢查，結(jié)果3批樣品的相對密度分別為1.047，1.045，1.044，相對密度平均值為1.045。

2.5 橙皮苷含量測定

2.5.1 溶液制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h的橙皮苷對照品2.10 mg，加甲醇5 ml配制成濃度為420 μg/ml的溶液，作為對照品溶液。精密量取健脾通便合劑2 ml，過濾，取濾液作為供試品溶液。精密量取不含陳皮的陰性溶液2 ml，濾過，取濾液作為陰性對照溶液。

2.5.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-醋酸-水（35:4:61）；流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量5 μl，柱溫30 ℃，檢測波長為283 nm。

3 方法學(xué)考察

3.1 專屬性試驗

分別量取陰性對照溶液，對照品溶液，供試品溶液5 μl，按2.5.2項色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果，供試品溶液在對照品相同保留時間處有色譜峰流出，該色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好，陰性對照溶液在對應(yīng)保留時間無色譜峰，表明樣品中其他成分對橙皮苷的測定無干擾，本方法的專屬性好，詳見圖3～5。

圖3 陰性對照溶液HPLC圖譜

圖4 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液HPLC圖譜

圖5 供試品溶液HPLC圖譜

3.2 線性關(guān)系考察

精密稱取橙皮苷對照品適量，加甲醇配制成濃度分別為20，40，60，80，100 g/ml的對照品溶液，分別進(jìn)樣。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=448.32x-37.951（r=0.9996，n=5）。結(jié)果表明橙皮苷在20～100 g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 儀器精密度試驗

取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果，峰面積的RSD為0.76 %，表明儀器精密度良好。

3.4 溶液穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別在室溫條件下放置0，2，4，8，12，24 h時吸取供試品溶液，測定橙皮苷峰面積。結(jié)果，24 h內(nèi)峰面積無明顯變化，峰面積RSD為0.93 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗

取供試品6份，每份各2 ml，按2.5.1項下方法制成供試品溶液，按2.5.2項下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果橙皮苷的平均含量為0.3360 mg/ml，RSD為1.49 %，表明方法重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收試驗

取已知含量的樣品（橙皮苷含量為0.3361 mg/ml）6份，每份1 ml，分別精密加入橙皮苷對照品溶液（0.5560 mg/ml）1 ml，按2.5.1項下方法制備供試品溶液，按2.5.2項下色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表1。平均回收率為98.98 %，RSD為0.43 %，表明方法準(zhǔn)確度較好。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

3.7 樣品的含量測定

根據(jù)本文建立的含量測定方法測定3批樣品中橙皮苷含量，結(jié)果橙皮苷含量分別為0.3361，0.3359，0.3359 mg/ml。

4 討論

木香TLC鑒別中，分別采用環(huán)己烷-丙酮（10:3）[6]、環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1）搖勻靜置的上層溶液[7]、氯仿-環(huán)己烷（5:1）[3]為展開劑，斑點分離情況不佳。以二氯甲烷-環(huán)已烷（5:1）為展開劑時主斑點顯色清晰，各斑點間的分離度較好。

在陳皮的TLC鑒別中，分別選用氯仿-甲醇-丙酮（15:3.5:1.5）[8]、氯仿-甲醇為（8:1）[9]、丙酮-水（1:1）[10]為展開劑時分離效果不佳，斑點不清晰。以乙酸乙酯-甲醇-水（10:1.7:1.3）為展開劑，展距3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）的上層溶液為展開劑展開時主斑點顯色清晰，陰性無干擾。

橙皮苷含量測定中，分別考察了乙腈-0.5 %醋酸（25:75）[11]，乙腈-0.1 %磷酸溶液（22:78）[12]，甲醇-醋酸-水（35:5:60）[13]系統(tǒng)，前兩者分離效果均不佳，色譜峰不能完全分離開。改用流動相為甲醇-醋酸-水（35:4:61）時，色譜峰峰形較好，出峰時間較快，陰性無干擾，分離度高于其他條件。