韓秀平，譚 娟，賀鈺梅△

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院 1.全科醫(yī)學(xué)科；2.中醫(yī)內(nèi)科,延安 716000）

糖尿病腎病是糖尿病最普遍、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。臨床上，糖尿病腎病以蛋白尿、肌酐水平高和不規(guī)則的腎小球?yàn)V過(guò)率為特點(diǎn)，最終將引發(fā)慢性腎功能衰竭[1]。目前，糖尿病腎病仍缺乏治愈方法。因此，有必要發(fā)展新的治療策略來(lái)緩解糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激是糖尿病發(fā)病機(jī)制的主要獨(dú)立參與因素[2]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）是評(píng)估氧化應(yīng)激的重要生理參數(shù)。SOD 催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫，是重要的抗氧化標(biāo)志物，機(jī)體MDA 水平越高，氧化應(yīng)激反應(yīng)越嚴(yán)重[3]。鐵皮石斛多糖是從我國(guó)傳統(tǒng)藥材鐵皮石斛莖中分離出來(lái)的主要活性成分，常用于治療肝炎、糖尿病、肥胖癥和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[4]。研究表明，鐵皮石斛多糖對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有顯著降血糖作用[5]，可緩解糖尿病大鼠氧化應(yīng)激、炎癥和肝臟脂質(zhì)積聚等癥狀[6]。然而，鐵皮石斛多糖是否抗糖尿病腎病仍不清楚。微小RNA（MicroRNA，miRNA/miR）是小的非編碼RNA分子，通過(guò)與編碼蛋白質(zhì)的mRNA 的3'非翻譯區(qū)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程。先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)暗示，包括miRNA在內(nèi)的非編碼RNA分子是調(diào)節(jié)高血糖癥的重要生物標(biāo)志物，并且它們與糖尿病性腎病有關(guān)[7]。根據(jù)最近的報(bào)道，miR-363 在糖尿病腎病中低表達(dá)[8]，白藜蘆醇可能通過(guò)上調(diào)miRNA mmu-miR-363-3p來(lái)改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝胰島素抵抗[9]。因此，miR-363可以用作糖尿病的候選生物標(biāo)志物或潛在治療靶點(diǎn)。然而，miR-363 在鐵皮石斛多糖介導(dǎo)的糖尿病腎病中的作用尚未見(jiàn)到深入研究的報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)利用高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 損傷，觀察鐵皮石斛多糖的保護(hù)作用，并結(jié)合miR-363，從細(xì)胞活性、凋亡和氧化應(yīng)激方面探討鐵皮石斛多糖的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞HK-2（美國(guó)ATCC）；鐵皮石斛多糖（SD9310，北京Solarbio）；miR-363 模擬物、miR-363抑制劑anti-miR-363、模擬物陰性對(duì)照miR-NC（上海GenePharma）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（CK-04，日本Dojindo）；B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗體（ab692，美國(guó)Abcam）；Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）抗體（ab77566，美國(guó)Abcam）；膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）-FITC/碘化丙錠（Propidium Iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（C1062L，上海碧云天）；SOD 檢測(cè)試劑盒（S0109，上海碧云天）；MDA檢測(cè)試劑盒（S0131S，上海碧云天）；PrimeScript RT試劑盒（RR047A，北京Takara）；Lipofectamine 2000 試劑（11668-019，美國(guó)Invitrogen）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞在達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中培養(yǎng)，其中包含10%胎牛血清，生長(zhǎng)的培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，含5%CO2。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將HK-2 細(xì)胞分為NG 組（正常糖，5 mmol/L 葡萄糖）、HG 組（高糖，30 mmol/L 葡萄糖[10]）、HG+鐵皮石斛多糖-L、M、H 組（30 mmol/L 葡萄糖+100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 鐵皮石斛多糖[11]）、HG+miR-NC組（30 mmol/L葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-NC）、HG+miR-363 組（30 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染miR-363 模擬物）、HG+鐵皮石斛多糖組（30 mmol/L 葡萄糖+400 μg/mL 鐵皮石斛多糖）、HG+鐵皮石斛多糖+anti-miR-363 組（30 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染anti-miR-363+400 μg/mL 鐵皮石斛多糖）。HK-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑操作說(shuō)明進(jìn)行，轉(zhuǎn)染6 h 后，以高糖或鐵皮石斛多糖處理，高糖、鐵皮石斛多糖作用時(shí)間為48 h。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率

各組HK-2細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）接種于96孔板，在DMEM中培養(yǎng)48 h。將10 μL CCK-8溶液與每孔細(xì)胞反應(yīng)2 h。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的細(xì)胞光密度（OD）值。存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率

將各組HK-2 細(xì)胞用PBS 洗滌，在結(jié)合緩沖液中重懸。將1×106個(gè)HK-2細(xì)胞分別與5μL Annexin V-FITC、5μL PI避光反應(yīng)，細(xì)胞染色后在BD Biosciences流式細(xì)胞儀上測(cè)量HK-2細(xì)胞的凋亡率。

1.6 Western blotting測(cè)定Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量

HK-2 細(xì)胞經(jīng)不同處理后，在RIPA 裂解液中進(jìn)行蛋白的抽提。將30 μg 變性蛋白進(jìn)行10% SDSPAGE、轉(zhuǎn)膜。膜在5%無(wú)脂牛奶中封閉后，在4 ℃下用Bax、Bcl-2 和對(duì)照GAPDH 一抗（均為1∶1 000 稀釋?zhuān)┓跤?2 h。隨后室溫下用HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000 稀釋?zhuān)┨幚? h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行處理，最后將其暴露于X射線膠片，通過(guò)掃描OD法評(píng)估Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)量。

1.7 試劑盒測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo)

收集不同處理的HK-2細(xì)胞上清液，按照SOD、MDA 檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明，進(jìn)行SOD 活性、MDA含量測(cè)定。

1.8 定量Real-time PCR測(cè)定miR-363的表達(dá)

HK-2 細(xì)胞使用TRIzol 提取總RNA，并使用上海奧析UV1901 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度和純度。使用PrimeScript RT 試劑盒通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA（50 ng/μL），并保存在-80 ℃冰箱。根據(jù)兩步法，使用ABI 7900HT 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)進(jìn)行PCR。U6用作miR-363的內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)使用2-ΔΔCt方法確定。

miR-363 引物，上游：5'-CCAATTGCACGGTATCCAT-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6引物，上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將每個(gè)實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)的數(shù)據(jù)在SPSS 22.0 軟件中進(jìn)行整理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性和凋亡的影響

高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞后，與NG組相比，HG組細(xì)胞存活率降低，凋亡率、Bax蛋白水平增加，Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+鐵皮石斛多糖-L組、HG+鐵皮石斛多糖-M組、HG+鐵皮石斛多糖-H組細(xì)胞存活率增加，凋亡率、Bax蛋白水平減少，Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且均呈濃度依賴(lài)性（表1，圖1）。

圖1 鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性和凋亡的影響

表1 鐵皮石斛多糖抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡，n=3

表1 鐵皮石斛多糖抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡，n=3

與NG 組相比，aP＜0.05；與HG 組相比，bP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-L 組相比，cP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-M組相比，dP＜0.05。

2.2 鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2氧化應(yīng)激的影響

與NG 組相比，HG 組HK-2 細(xì)胞的SOD 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+鐵皮石斛多糖-L組、HG+鐵皮石斛多糖-M組、HG+鐵皮石斛多糖-H 組HK-2 細(xì)胞的SOD 活性逐漸增加，MDA含量逐漸減少（P＜0.05），且均呈濃度依賴(lài)性（表2）。

表2 鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 中SOD 和MDA 表達(dá)的影響，n=3

表2 鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 中SOD 和MDA 表達(dá)的影響，n=3

與NG 組相比，aP＜0.05；與HG 組相比，bP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-L 組相比，cP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-M組相比，dP＜0.05。

2.3 鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 中miR-363表達(dá)的影響

與NG 組相比，HG 組HK-2 細(xì)胞的miR-363 表達(dá)降低（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+鐵皮石斛多糖-L組、HG+鐵皮石斛多糖-M組、HG+鐵皮石斛多糖-H 組HK-2 細(xì)胞的miR-363 表達(dá)逐漸增加（P＜0.05），且呈濃度依賴(lài)性（表3）。

表3 鐵皮石斛多糖促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HK-2中miR-363的表達(dá)，n=3

表3 鐵皮石斛多糖促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HK-2中miR-363的表達(dá)，n=3

與NG 組相比，aP＜0.05；與HG 組相比，bP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-L 組相比，cP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖-M組相比，dP＜0.05。

2.4 過(guò)表達(dá)miR-363對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

在HK-2 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-363 后，HG+miR-363組miR-363表達(dá)、細(xì)胞存活率比HG+miR-NC組高，凋亡率、Bax蛋白水平比HG+miR-NC組低，Bcl-2蛋白水平、SOD活性比HG+miR-NC組高，MDA含量比HG+miR-NC組低（P＜0.05）（表4，圖2）。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-363對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡的影響

表4 過(guò)表達(dá)miR-363對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，n=3

表4 過(guò)表達(dá)miR-363對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，n=3

與HG+miR-NC組相比，aP＜0.05。

2.5 抑制miR-363 對(duì)鐵皮石斛多糖作用的高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡及氧化應(yīng)激的影響

與HG組相比，HG+鐵皮石斛多糖組、HG+鐵皮石斛多糖+anti-miR-363 組miR-363 表達(dá)水平、細(xì)胞存活率增加，凋亡率、Bax蛋白水平減少，Bcl-2蛋白水平、SOD 活性升高，MDA 含量降低（P＜0.05）；并且HG+鐵皮石斛多糖+anti-miR-363 組miR-363 表達(dá)水平、細(xì)胞存活率低于HG+鐵皮石斛多糖組，凋亡率、Bax蛋白水平高于HG+鐵皮石斛多糖組，Bcl-2 蛋白水平、SOD 活性低于HG+鐵皮石斛多糖組，MDA含量高于HG+鐵皮石斛多糖組（表5，圖3）。

表5 抑制miR-363可逆轉(zhuǎn)鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡及氧化應(yīng)激的作用，n=3

表5 抑制miR-363可逆轉(zhuǎn)鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡及氧化應(yīng)激的作用，n=3

與HG組相比，aP＜0.05；與HG+鐵皮石斛多糖組相比，bP＜0.05。

圖3 抑制miR-363可逆轉(zhuǎn)鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡的影響

3 討論

腎小管細(xì)胞是糖尿病腎病的主要靶點(diǎn)，它在糖尿病腎病病理進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12]。早期糖尿病腎病出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡及氧化損傷現(xiàn)象[13]。因此，找到可以靶向腎小管上皮細(xì)胞凋亡及氧化損傷的有效藥物，將有助于阻斷糖尿病腎病進(jìn)程。本研究分析了鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率、凋亡和氧化應(yīng)激過(guò)程的影響，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖可以保護(hù)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞損傷，其可能成為糖尿病腎病的潛在治療藥物。并且，其機(jī)制與miR-363密切相關(guān)。

腎小管上皮細(xì)胞凋亡是糖尿病腎病的重要特征[14]。Bcl-2 家族是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)節(jié)因子，影響一系列參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的下游基因，包括促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2[15]。資料顯示，鐵皮石斛多糖可以增強(qiáng)高糖處理的人角膜上皮細(xì)胞活性、Bcl-2 水平，減弱其凋亡、Bax 水平[11]。鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、Bcl-2表達(dá)具有促進(jìn)作用，對(duì)Bax 表達(dá)具有抑制作用[16]。本研究中，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 鐵皮石斛多糖促進(jìn)高糖誘導(dǎo)后HK-2 細(xì)胞的存活率、Bcl-2水平，并抑制高糖引起的HK-2 細(xì)胞凋亡率、Bax 水平增加，說(shuō)明在高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞中，鐵皮石斛多糖可以增加細(xì)胞活性，減輕細(xì)胞凋亡，與前述研究相似。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展的關(guān)鍵因素[17]。腎小管上皮細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平升高與高糖環(huán)境有關(guān)，這可能導(dǎo)致腎功能障礙[18]。脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)物MDA水平升高可以用作氧化應(yīng)激的標(biāo)志，細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低表明體內(nèi)抗氧化能力降低[19]。鐵皮石斛多糖被報(bào)道可以增強(qiáng)2型糖尿病小鼠的抗氧化活性，提高SOD和過(guò)氧化氫酶活力[20]。在腎陰虛大鼠中，鐵皮石斛多糖通過(guò)提高SOD 活性，降低MDA 含量改善大鼠的抗氧化能力[21]。本研究中，高糖處理使HK-2 細(xì)胞抗氧化酶SOD 的活性降低，MDA 含量增加，導(dǎo)致HK-2 細(xì)胞的氧化應(yīng)激，與前人的研究[19]相符合。而不同濃度鐵皮石斛多糖的治療增加了高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞的SOD活性，并減少M(fèi)DA含量，可見(jiàn)鐵皮石斛多糖能夠減輕高糖所致的HK-2 細(xì)胞氧化應(yīng)激。因此，鐵皮石斛多糖通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞活性、凋亡和氧化應(yīng)激水平，對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

miR-363在2型糖尿病中發(fā)揮作用，是糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)后生物標(biāo)志物[22]，但其在糖尿病腎病中的詳細(xì)功能仍然未知。研究表明，在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1處理的HK-2 細(xì)胞中，miR-363-3p 的水平顯著降低，miR-363-3p對(duì)體外腎纖維化起保護(hù)作用[23]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠中，大鼠膀胱逼尿肌組織中miR-363 的表達(dá)降低，上調(diào)miR-363 導(dǎo)致大鼠逼尿肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)增加，加速細(xì)胞存活，同時(shí)降低細(xì)胞凋亡和Bax 的表達(dá)，從而改善2 型糖尿病大鼠的逼尿肌纖維化[24]。本研究中，高糖降低HK-2 細(xì)胞中miR-363 表達(dá)，這與彭睿等[8]觀察到的miR-363在糖尿病腎病表達(dá)下調(diào)一致，提示miR-363與糖尿病腎病進(jìn)展有關(guān)。本研究還檢測(cè)到與前述報(bào)告[23-24]類(lèi)似的結(jié)果，即過(guò)表達(dá)miR-363使高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的存活率、Bcl-2 水平增加，凋亡率、Bax 水平減少。同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-363 還增加了高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞SOD 活性，減少M(fèi)DA 含量，表現(xiàn)出其抗氧化能力。另外，不同濃度鐵皮石斛多糖促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的miR-363表達(dá)，并且鐵皮石斛多糖對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響被抑制miR-363所逆轉(zhuǎn)。說(shuō)明鐵皮石斛多糖保護(hù)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的功能是通過(guò)促進(jìn)miR-363表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖對(duì)糖尿病腎病產(chǎn)生潛在的保護(hù)作用，能增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞活性，減弱細(xì)胞凋亡，并改善氧化應(yīng)激，機(jī)制與上調(diào)miR-363表達(dá)有關(guān)。這為鐵皮石斛多糖治療糖尿病的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。