羅維曉 徐振上 劉新利

摘要 D-乳酸脫氫酶是乳酸脫氫酶根據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分的重要的一類工具酶。從不同微生物中提取的D-乳酸脫氫酶的來源、基因工程以及固定化等方面綜述了D-乳酸脫氫酶的研究進(jìn)展，以期為獲取優(yōu)質(zhì)的診斷用D-乳酸脫氫酶提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 D-乳酸脫氫酶;來源;基因工程;酶固定化

中圖分類號(hào) Q 936? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）23-0011-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.003

Research Progress of D-lactate Dehydrogenase for Diagnosis

LUO Wei-xiao，XU Zhen-shang，LIU Xin-li

（School of Bioengineering，Qilu University of Technology / State Key Laboratory of Bio-based Materials and Green Paper Making，Jinan，Shandong 250353）

Abstract D-lactate dehydrogenases （D-LDHs） are an important class of enzymes that differentiate lactate dehydrogenases according to their structure. In this paper， the source， genetic engineering and immobilization of D-lactate dehydrogenase extracted from different microorganisms were summarized in the research progress of D-lactate dehydrogenase， in order to provide theoretical guidance for obtaining high-quality diagnostic D-lactate dehydrogenase.

Key words D-lactate dehydrogenase;Source;Genetic engineering;Enzyme immobilization

作者簡(jiǎn)介 羅維曉（1990—），男，山東濟(jì)南人，工程師，碩士，從事診斷酶研究。通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物活性代謝產(chǎn)物研究。

收稿日期 2021-03-18

D-乳酸脫氫酶以氧化型輔酶Ⅰ（NAD+）/還原型輔酶Ⅰ（NADH）作為輔酶，可以可逆催化氧化乳酸生成丙酮酸，根據(jù)這一反應(yīng)原理D-乳酸脫氫酶在分析其他酶和生物制品中廣泛應(yīng)用，在臨床診斷中D-乳酸脫氫酶作為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[1]、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶[2]、同型半胱氨酸[3]、鉀離子酶法[4]等診斷項(xiàng)目中的關(guān)鍵工具酶，用于人體各項(xiàng)疾病的輔助診斷。

決定試劑性能的關(guān)鍵是工具酶的質(zhì)量，而工具酶的生產(chǎn)工藝又是決定其質(zhì)量和產(chǎn)率的關(guān)鍵因素，由于診斷酶試劑自身的復(fù)雜性，作為診斷工具酶應(yīng)該具備對(duì)底物專一性高、酶自身熱穩(wěn)定性好、酸堿耐受范圍寬、比活性高、有害雜酶含量低等要求[5]，為了能夠提高工具酶的質(zhì)量，首先需要選育高產(chǎn)菌株，探索最優(yōu)化的發(fā)酵工藝和后提取純化技術(shù)，以提高酶的產(chǎn)率，保證原酶質(zhì)量。目前隨著基因工程菌技術(shù)的不斷成熟，通過基因改造，能夠大大提高目的酶的產(chǎn)量以及改善酶的性質(zhì)。另外為了進(jìn)一步提高酶的性能以及拓展工具酶在一些特定領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用，通過酶固定化技術(shù)來達(dá)到特定的效果，也是工具酶后期研究的不可或缺的一部分[6]。對(duì)于乳酸脫氫酶的研究，國內(nèi)外多數(shù)以如何提高其下游產(chǎn)物乳酸或苯乳酸的報(bào)道較多，黃艷娜等[7-8]針對(duì)該問題進(jìn)行了詳細(xì)的報(bào)道，對(duì)于單純?cè)\斷用乳酸脫氫酶的國內(nèi)研究相對(duì)較少[9]，尤其是針對(duì)D-乳酸脫氫酶的研究則更少[10]，筆者將從D-乳酸脫氫酶的來源、基因工程以及固定化修飾方面綜述了D-乳酸脫氫酶的研究進(jìn)展。

1 D-乳酸脫氫酶的來源

乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenases，LDHs）按照催化生成乳酸構(gòu)型不同，可將乳酸脫氫酶分為 D-乳酸脫氫酶（D-LDH）和 L-乳酸脫氫酶（L-LDH），分別催化丙酮酸生成有光學(xué)純度的D-乳酸和 L-乳酸[11-12]。乳酸脫氫酶廣泛存在于微生物和動(dòng)物各種組織之中，不同來源的乳酸脫氫酶性質(zhì)差異較大[13-16]，從動(dòng)物的心肌、肝、腎、骨骼肌或肺等組織器官中獲取的乳酸脫氫酶主要是L-乳酸脫氫酶，只有少許無脊椎動(dòng)物具有D-乳酸脫氫酶[17];從微生物體內(nèi)獲取的乳酸脫氫酶既包含L型的乳酸脫氫酶又包含D型的乳酸脫氫酶，能夠獲取乳酸脫氫酶的微生物主要有芽孢桿菌、嗜熱菌和乳酸菌等[18-21]。

國外不同菌種中提取D-乳酸脫氫酶的研究相對(duì)較早，1972年P(guān)urohit等[17]從異水霉菌雄性雜交菌株中分離得到了D（-）-乳酸脫氫酶，系統(tǒng)介紹D-LDH 進(jìn)行分離純化的方法步驟，并對(duì)其性質(zhì)和變構(gòu)特性進(jìn)行了深入研究，并經(jīng)過6個(gè)步驟提純后得到的酶活性比456.99 U/mg。Busto等[22]對(duì)大腸桿菌中D（-）-乳酸脫氫酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)原位研究的D（-）-乳酸脫氫酶與體外研究的D（-）-乳酸脫氫酶的動(dòng)力學(xué)特性有顯著差異，為大腸桿菌產(chǎn)D（-）-乳酸脫氫酶在不同條件的應(yīng)用提供了依據(jù)。Ma等[23]從土壤中分離出stutzeri假單胞菌，并對(duì)其產(chǎn)生的L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶活性進(jìn)行了研究，檢測(cè)到2種立體特異性NAD-independent乳酸脫氫酶（iLDH）的活性，表明stutzeri SDM中存在2種獨(dú)立的酶，為從假單胞菌中獲取D-乳酸脫氫酶提供了可能性。Satomura等[24]從7株tokodaii磺隆菌中發(fā)現(xiàn)了嗜熱嗜酸酶S.tokodaii染料連接的D -乳酸脫氫酶，這是一種新型的FAD型D-乳酸脫氫酶，經(jīng)過測(cè)量酶的分子質(zhì)量約為93 kD，是由相同亞基組成的同源二聚體，分子質(zhì)量約為48 kD，并確定了其基因序列。同年Mourier等[25] 研究了羧酸對(duì)酵母線粒體D -乳酸脫氫酶的動(dòng)力學(xué)激活，證明了以D-乳酸為底物的磷酸化或非磷酸化條件下，羧酸可以刺激線粒體呼吸速率，并對(duì)這種調(diào)節(jié)的生理學(xué)意義進(jìn)行了討論。前期對(duì)于D-乳酸脫氫酶的研究則主要以提高酶的產(chǎn)量以及提純工藝的研究[26]，隨著市場(chǎng)對(duì)于診斷用D-乳酸脫氫酶的需求的增加，Kim等[26]對(duì)簡(jiǎn)氏乳桿菌D-乳酸脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，獲取了一種耐高溫的D-乳酸脫氫酶，熱穩(wěn)定性高達(dá)54.5 ℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于當(dāng)時(shí)市售的D-乳酸脫氫酶（42.7 ℃），也正是由于穩(wěn)定性的提高，更有利于D-LDH在體外診斷試劑中的應(yīng)用。

2 酶的工程菌改造

在正常的生物細(xì)胞中，由于其內(nèi)在活動(dòng)機(jī)制原因，生物體內(nèi)酶活性以及酶產(chǎn)量十分有限?；蚬こ痰膽?yīng)用可以對(duì)已知酶的性質(zhì)進(jìn)行分析，改變酶的性能，擴(kuò)大酶的適用范圍以及增強(qiáng)酶的活性，以達(dá)到提高酶產(chǎn)量的目的。自從Bernard等[27]首次報(bào)道了克隆L.bulgaricus基因組中D-乳酸脫氫酶基因（ldhD）的完整序列以來，D-乳酸脫氫酶的基因改造研究眾多，而針對(duì)D-乳酸脫氫酶基因工程的菌株研究目前主要集中在乳酸桿菌、大腸桿菌等工程菌，李劍等[28]通過構(gòu)建基因文庫從Lactobacillus sp.MD21菌株中篩選到一個(gè)新的編碼D-LDH的基因ldhD，并對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，通過乳酸桿菌L-乳酸脫氫酶基因（ldhL）缺失方法，獲取高純度的D-LDH。但大多數(shù)將其他菌種的D-乳酸脫氫酶的基因在大腸桿菌中表達(dá)，在20世紀(jì)90年代初有學(xué)者將編碼Lactobacillysplanta-rum[29]、Lactobacillusbulgaricus[27]和Lactobacillushelveticus[30]的D-LDH的基因ldhD導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行了克隆表達(dá); Arai等[31]對(duì)戊糖乳桿菌JCM1558（ATCC 8041）乳酸脫氫酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，用天冬氨酸替換第 101 位的脯氨酸（P101N），P101N 表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，對(duì)苯丙酮酸催化活性相對(duì)較高，經(jīng)過提取得到的酶活比達(dá)到480 U/mg;Yang等[32]構(gòu)建了D-LDH 重組大腸桿菌菌株，使 D-LDH 酶活提高了10倍以上，并分析了相關(guān)途徑中碳原子的代謝流向。黃艷燕等[33]利用PCR的方法從鼠李糖乳桿菌基因組DNA中擴(kuò)增到D-（+）-乳酸脫氫酶基因ldhD，并連接到載體pSE380上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pSE-ldhD，將重組質(zhì)粒pSE-ldhD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明ldhD在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為37 kD，測(cè)得重組菌株的D-乳酸脫氫酶活力為5.4 U/mL。Mu等[34]克隆了嗜酸小球菌DSM 20284的D-乳酸脫氫酶基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，重組酶經(jīng)鎳親和層析純化，在30 ℃和pH 5.5的條件下，苯丙酮酸（PPA）轉(zhuǎn)化為3-苯乳酸的效率最高，PPA和丙酮酸的活性比分別為140和422 U/mg。宋嘉寧等[35]以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因組DNA為模板，克隆出 D-乳酸脫氫酶基因ldhD，將其連接到表達(dá)載體 pET-22b（+）質(zhì)粒上，構(gòu)建 pET-22b（+）-ldhD 重組質(zhì)粒，檢測(cè)結(jié)果100%正確;將重組質(zhì)粒 pET-22b（+）-ldhD 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21（DE3）中，通過氨芐霉素抗性平板篩選，構(gòu)建大腸桿菌 BL21（DE3）-pET-22b（+）-ldhD基因工程菌。Jun等[20]篩選了3株不同的延森氏乳桿菌D-LDH，通過基因組挖掘，在大腸桿菌中表達(dá)，其中D-LDHs（D-LDH3）顯示最佳反應(yīng)溫度（50 ℃），擁有非常強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。蔡昱萌等[36]通過克隆詹氏乳桿菌的 D-乳酸脫氫酶，將其進(jìn)行體外表達(dá)，最適溫度為45 ℃，具有更好的耐熱性和更高的催化活力。Huang等[37]通過基因工程將D-LDHs基因（ldb0101、ldb0813、ldb1010、ldb1147和ldb2021）被克隆并過表達(dá)來自pUC18誘導(dǎo)載體的大腸桿菌JM109，并對(duì)得到的菌株進(jìn)行數(shù)值比較，提高了乳酸脫氫酶的含量和產(chǎn)乳酸的能力。Nakano等[38]為了提高S.laevolacticus D-LDH的活性，采用定點(diǎn)誘變的方法取代靠近底物結(jié)合位點(diǎn)或活性中心的部分氨基酸殘基，研究發(fā)現(xiàn)S.laevolacticus D-LDH的Ala234是一個(gè)重要的氨基酸殘基，對(duì)催化活性有積極的影響，雙突變體D-LDH T75L/A234S比野生型D-LDH提高了6.8倍?；蚬こ谈脑旌蟮腄-乳酸脫氫酶基因多數(shù)在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，大腸桿菌作為基因工程受體菌具有易于培養(yǎng)、遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水平高、表達(dá)系統(tǒng)成熟完善等優(yōu)勢(shì)，但是ldhD序列過量表達(dá) D-LDH 會(huì)抑制重組大腸桿菌生長[39] 。

3 乳酸脫氫酶的固定化

酶固定化方法是指將游離酶固定在載體上，使其不能自由移動(dòng)的方法。游離的乳酸脫氫酶在實(shí)際應(yīng)用中存在著耐酸堿性弱、耐熱性不強(qiáng)、性質(zhì)較不穩(wěn)定等局限性，固定化酶能有效提高酶催化過程的性能，有效克服這些局限性。固定化酶的特性由固定化載體和固定化方法決定[40]，常見的固定方法包括吸附法[6]、包埋法[41]、共價(jià)結(jié)合法[42]、交聯(lián)法[43]等。余沖等[44]對(duì)酶不同的固定化載體的選擇和不同固定化方法進(jìn)行了報(bào)道，并就各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)比較，還重點(diǎn)介紹了酶定向固定化、多酶共固技術(shù)等新型酶固定化方法[45-47]。陳海欣等[48]則對(duì)傳統(tǒng)的固定方法和固定載體選擇進(jìn)行對(duì)比分析的同時(shí)，提出了金屬-有機(jī)框架材料（MOFs）和共價(jià)有機(jī)框架材料（COFs）作為新型載體應(yīng)用到酶的固定化中。

目前對(duì)于乳酸脫氫酶的固定方法有傳統(tǒng)方法也有創(chuàng)新方法。傳統(tǒng)方法中包埋法具有方法簡(jiǎn)便操作、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，早在1988年李慧賢等[49]用 CNBr 活化的 Sepharose 4B 進(jìn)行了包埋固定化，通過該方法使得用于診斷的乳酸脫氫酶自身穩(wěn)定性和保存液穩(wěn)定性方面有很大的提高，但酶活力回收相對(duì)較低。吸附法具有反應(yīng)條件溫和、載體廉價(jià)易得等優(yōu)勢(shì)，丁良等[50]利用 X射線微區(qū)分法，對(duì)采用吸附法合成出的以大孔吸附樹脂為載體的固定化乳酸脫氫酶進(jìn)行分析，確定該方法的可行性，該方法從定量的角度來研究載體的表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與酶活性的關(guān)系，并確定酶活性最高的結(jié)構(gòu);姚莉麗[51]以啤酒酵母菌為乳酸脫氫酶（LDH）制備的菌種來源，建立了以納米級(jí)磁性殼聚糖微球（magnetic chitosan microspheres，M-CS）為載體固定化乳酸脫氫酶的方法同樣取得了較好的效果，證明了物理法用于乳酸脫氫酶固定的可行性。

交聯(lián)法得到的固定化酶具有不易脫落的優(yōu)勢(shì)，覃建軍等[52]以磁性殼聚糖作為載體，戊二醛作為交聯(lián)劑，對(duì)乳酸脫氫酶（LDH）進(jìn)行固定化，得出最適條件為戊二醛濃度6%、 pH 7.5、酶的偶聯(lián)時(shí)間2 h;并對(duì)固定化酶進(jìn)行性能驗(yàn)證，在室溫下與底物重復(fù)反應(yīng)6次后，活力仍保留60%以上，說明固定化酶具有較好的熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和復(fù)用性。

隨著D-乳酸脫氫酶新的固定方法和載體新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，在乳酸脫氫酶固定化方面同樣進(jìn)行了新的探索，徐俊等[53]使用異硫氰酸醋作為載體同時(shí)將醇脫氫酶、乳酸脫氫酶和輔酶 I進(jìn)行固定，實(shí)現(xiàn)了多重酶的共固定化，得到的固定化三元全酶系統(tǒng)的輔酶再生能力為相應(yīng)游離酶系統(tǒng)的4倍。庹潯等[54]以十六烷基三甲基溴化銨（CATB）-辛烷-己醇反膠束體系對(duì)乳酸脫氫酶（LDH）進(jìn)行固定化，采用反膠束法對(duì)乳酸脫氫酶進(jìn)行固定，使得固定化LDH具有較好的熱穩(wěn)定;柳暢先等[55]對(duì)反膠束體系中的催化動(dòng)力學(xué)研究，進(jìn)一步確認(rèn)了該方法可以有效地提高LDH的熱穩(wěn)定性。Zaboli等[56]提出在原始碳納米管和羧基功能化碳納米管上固定D-乳酸脫氫酶診斷酶的試驗(yàn)，并對(duì)分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了模擬研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過該方法固定的D-乳酸脫氫酶熱穩(wěn)定性有較大提升，該方法可以用于工業(yè)化。關(guān)于新型載體，Ma等[57]又提出了使用雙壁碳納米管摻雜海藻酸凝膠生物復(fù)合材料的方法固定化乳酸脫氫酶，該方法旨在降低泄漏量、提高酶的活性，使用該方法固定化形成的復(fù)合材料的LDH泄漏量顯著降低了61.7%。

4 展望

隨著體外診斷行業(yè)的高速發(fā)展，診斷用酶的需求量越來越大，目前國內(nèi)大多數(shù)的診斷用酶均依賴進(jìn)口，乳酸脫氫酶作為一種非常重要的診斷工具酶，在體外診斷領(lǐng)域中應(yīng)用非常廣泛，該領(lǐng)域內(nèi)L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶均有應(yīng)用，其中以D-乳酸脫氫酶應(yīng)用居多，由于通過微生物發(fā)酵的方法獲取的D-LDH的酶類純度更高，更加易于操作，因此商業(yè)化產(chǎn)品中多數(shù)采用該方法進(jìn)行提取;而L-乳酸脫氫酶多從哺乳動(dòng)物組織器官中提取，提取要求和工藝更加復(fù)雜。此外通過微生物獲取的D-LDH僅需要2～8 ℃甚至常溫即可實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定儲(chǔ)存，而從動(dòng)、植物體內(nèi)提取的L-乳酸脫氫酶則需要在-20 ℃或者更低的溫度進(jìn)行儲(chǔ)存，這實(shí)際對(duì)酶類的應(yīng)用范圍起到了很大限制。

診斷用酶在使用過程中往往與其他物料混合在一起進(jìn)行使用或儲(chǔ)存，多數(shù)情況下，其他物料的添加會(huì)顯著降低酶類的穩(wěn)定性，因此這要求診斷酶需要有更高的穩(wěn)定性[58]。

因此為獲取優(yōu)質(zhì)的診斷用酶，國外的商品化診斷酶基本上都通過工程菌株來獲取。進(jìn)口的D-乳酸脫氫酶中無論從酶的純度還是酶的穩(wěn)定性方面均有明顯的優(yōu)勢(shì)，還有部分日美企業(yè)為了提高酶的性能采用固定修飾的方法對(duì)獲取的酶進(jìn)行固定化，尤其是一些新的酶修飾和固定化技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)于酶后期性能的提升起到不可忽視的作用，目前國內(nèi)診斷用酶依然對(duì)進(jìn)口依賴較大，關(guān)鍵原材料卡脖子情況時(shí)有發(fā)生，因此國內(nèi)對(duì)于診斷用酶的研究和進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化依然有巨大的發(fā)展空間。

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