姜玉玲，梁巧蘭，魏列新，孟秀鵬，藺 珂，岳 陽(yáng)

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

蘭州百合Lilium davidiiDuch是百合科百合屬多年生草本球根植物，是全國(guó)唯一食用性甜百合[1-3]，具有較高的食用和藥用價(jià)值。由于其轄域分布，種植結(jié)構(gòu)單一化，復(fù)種指數(shù)大，重茬現(xiàn)象普遍等原因，造成百合病害發(fā)生日益嚴(yán)重[4,5]。其中，由尖孢鐮孢菌引起的百合鱗莖腐爛病是百合生產(chǎn)栽培和貯存期發(fā)生嚴(yán)重的病害之一，造成植株枯萎，鱗莖腐爛[6]，田間發(fā)病率高達(dá)21.50%～30.60%，鱗莖軟化腐爛，平均感染率在50%以上，嚴(yán)重時(shí)感染率可達(dá)100%。如果將發(fā)病鱗莖作為種球播種會(huì)影響其發(fā)芽率，造成缺苗斷垅，影響百合的生產(chǎn)。在甘肅省定西市臨洮縣百合種植基地發(fā)現(xiàn)百合鱗莖腐爛病，從帶病鱗片上分離純化獲得了具有強(qiáng)致病性鱗莖腐爛病菌，經(jīng)致病性測(cè)定、形態(tài)特征觀察及rDNA-ITS序列分析將其鑒定為尖孢鐮孢菌F. oxysporum（GenBank登錄號(hào)：MT824577.1）。

目前，多種化學(xué)藥劑可防治尖孢鐮孢菌引起的植物枯萎病[7]。其中，多菌靈、代森錳鋅、百菌清、福美雙、苯醚甲環(huán)唑、己唑醇、噁霉靈、烯唑醇、氟硅唑、咯菌腈等藥劑對(duì)百合枯萎病病原菌尖孢鐮孢菌表現(xiàn)出較高的活性和防效[8-16]；代森錳鋅+甲基托布津、多菌靈+代森錳鋅和多菌靈+甲基托布津、多菌靈+福美雙+綠精靈和多菌靈+福美雙+ 21%過氧乙酸等化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配劑均對(duì)百合枯萎病防效較好[16,17]，但是化學(xué)農(nóng)藥由于殘留污染及病原菌易產(chǎn)生抗藥性等問題，限制了其在百合病害防治中的應(yīng)用[18]。篩選生物藥劑有效防治百合病害已成為發(fā)展百合產(chǎn)業(yè)、提高百合品質(zhì)的有效舉措，據(jù)報(bào)道，尖孢鐮孢菌引起的植物枯萎病常見的生防藥劑主要包括生防真菌、生防細(xì)菌、植物源和放線菌等[7]。尖孢鐮孢菌非致病性菌株如 Fo47和CS-20、毛殼菌屬、叢生菌根（AM）、芽胞桿菌屬Bacillusspp.[19-22]等生防真菌，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis和解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens等生防細(xì)菌[23,24]；大蒜鱗莖粗提液、紫莖澤蘭提取液及其與沼液混合液等植物源農(nóng)藥[23,25]，放線菌發(fā)酵液[24]及申嗪霉素、中生菌素等抗生素類殺菌劑均可有效防治尖孢鐮孢菌引起的百合枯萎病。

生物農(nóng)藥由于防效慢，受環(huán)境因素限制等問題，影響其在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用。由此，通過將不同作用機(jī)理的生物農(nóng)藥或與化學(xué)農(nóng)藥混配來(lái)提高生物農(nóng)藥的速效性，拓寬防治譜，實(shí)現(xiàn)多種病害的有效兼治，并且還可降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量、減輕環(huán)境污染；延緩病原菌對(duì)化學(xué)藥劑抗藥性的產(chǎn)生[25,26]。本試驗(yàn)通過幾種生物源農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的抑菌作用及活性的測(cè)定，并與化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行比較，旨在篩選出對(duì)蘭州百合貯存期鱗莖腐爛病防效較好的生物農(nóng)藥及其混配劑，研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)百合貯存期鱗莖腐爛病和預(yù)防帶病種球播種后枯萎病的發(fā)生具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：引起蘭州百合鱗莖腐爛病病原菌尖孢鐮孢菌F. oxysporum，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱中。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉14 g，去離子水1 L。供試藥劑見表1。

表1 供試藥劑Table 1 Tested fungicides

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的抑菌活性測(cè)定 病原菌活化：挑取保存于4 ℃冰箱中的尖孢鐮孢菌，接種于PDA培養(yǎng)基中央進(jìn)行菌種活化，并置于25 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，備用。

在超凈工作臺(tái)上用滅菌水將12種供試藥劑（表1）分別配制成相應(yīng)濃度母液，取1 mL母液加入到滅菌冷卻至45 ℃的49 mL PDA培養(yǎng)基中，充分混勻，使其達(dá)到表1中各藥劑的推薦濃度，將每個(gè)藥劑處理分別倒入4個(gè)滅菌培養(yǎng)皿（90 mm）中制成含毒培養(yǎng)基平板，以分別加入1 mL百菌清母液和無(wú)菌水制備的PDA平板為化學(xué)藥劑對(duì)照和空白對(duì)照。將上述培養(yǎng)4 d的病原菌，用打孔器從菌落邊緣打成直徑5 mm的菌餅，菌絲朝下接入含毒PDA平板和對(duì)照平板中央，置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4次，4 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并按下式計(jì)算藥劑抑菌率。抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.2 生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的活性比較 采用生長(zhǎng)速率法[27]，將抑菌率在60%以上的藥劑稀釋成5個(gè)系列濃度，3億 CFU/克哈茨木霉 WP濃度分別為 1.00×106、2.50×105、6.25×104、1.56×104和 3.91×103孢子/mL，2億CFU/克綠色木霉WP濃度分別為8.33×105、4.17×105、2.08×105、1.04×105和5.21×104孢子/mL，0.1億CFU/g多粘芽胞桿菌FG濃度分別為3.33×104、8.33×103、2.08×103、5.21×102和1.30×102孢子/mL，0.3%丁子香酚SL濃度分別為4000、2000、1000、500和250 μg/mL，5%香芹酚AS濃度分別為3333、1666.50、833.25、416.63和208.31 μg/mL，1%申嗪霉素SC濃度分別為1000、500、250、125和62.5 μg/mL，75%百菌清WP濃度分別為3333、416.63、52.08、6.51和0.81 μg/mL，然后按1.2.1中方法制成含毒培養(yǎng)基，接菌，置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4次，4 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，測(cè)定不同藥劑不同濃度的抑菌率，然后以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑菌率的幾率值為縱坐標(biāo)，求出毒力回歸方程和EC50，比較各藥劑的活性大小。

1.2.3 生物農(nóng)藥混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌的協(xié)同增效作用測(cè)定 采用 Horsfall[28]和王小藝等[29]方法測(cè)定混配藥劑的最佳混配比例，即在單劑活性測(cè)定的基礎(chǔ)上，將3億CFU/克哈茨木霉WP、2億CFU/克綠色木霉WP、0.1億CFU/g多粘類芽胞桿菌FG、0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、1%申嗪霉素SC和75%百菌清WP 7種藥劑分別按照1.2.2中測(cè)得的各藥劑的有效中濃度，擴(kuò)大50倍配制母液，以體積比0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0不同配比進(jìn)行二元混配。采用菌絲生長(zhǎng)速率法，將以上不同配比的混配劑按照1.2.1方法分別配成含毒培養(yǎng)基平板，并接菌，置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)4次，以加入等量無(wú)菌水為空白對(duì)照，4 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，測(cè)得實(shí)際抑菌率，按照以下公式計(jì)算各混劑預(yù)期抑制率和毒效比率，根據(jù)毒效比率＞1為增效作用，毒效比率＝1為相加作用，毒效比率＜1為拮抗作用的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行混配劑協(xié)同增效作用評(píng)價(jià)[30,31]?；靹╊A(yù)期抑制率（%）＝（A藥劑EC50值實(shí)際抑制率×A藥劑所占比例＋B藥劑EC50值實(shí)際抑制率×B藥劑所占比例）×100，毒效比率（%）＝實(shí)際抑制率/混劑預(yù)期抑制率×100。

將上述配比中毒效比率大于1的混配劑，采用Sun和John[32]的共毒系數(shù)法（co-toxicity coefficient，CTC）對(duì)它們的增效作用進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。按照上述方法將毒效比率大于1的混配劑配制成母液，稀釋成5個(gè)濃度梯度，按照1.2.2中的方法測(cè)定各個(gè)混劑的抑制率, 求出毒力回歸方程和EC50，以A藥劑作為標(biāo)準(zhǔn)藥劑，按下式分別計(jì)算各單劑、混劑的毒力指數(shù)、混劑的理論毒力指數(shù)及共毒系數(shù)。毒力指數(shù)（TI）＝標(biāo)準(zhǔn)殺菌劑EC50/單劑EC50×100，混配實(shí)測(cè)毒力指數(shù)（ATI）＝標(biāo)準(zhǔn)殺菌劑EC50/混配劑EC50×100，混配理論毒力指數(shù)（TTI）＝A藥劑毒力指數(shù)×A藥劑在混配中的含量（%）＋B藥劑毒力指數(shù)×B藥劑在混配中的含量（%），共毒系數(shù)（CTC）＝混配實(shí)測(cè)毒力指數(shù)/混配理論毒力指數(shù)×100，共毒系數(shù)CTC大于120為增效作用，在80～120之間為相加作用，＜80為拮抗作用。

1.2.4 混配劑對(duì)鱗莖腐爛病的室內(nèi)防效測(cè)定 根據(jù)毒效比率和共毒系數(shù)法將1.2.3中篩選出具有明顯協(xié)同增效作用的混配劑，采用離體鱗片法測(cè)定不同混配劑及其單劑對(duì)尖孢鐮孢菌引起的百合鱗莖腐爛病的防治效果，選取大小一致且健康百合鱗片，放入75%酒精中滅菌1 min、經(jīng)無(wú)菌水清洗晾干；根據(jù)單劑的有效中濃度配制母液以不同體積比配制具有增效作用的混配劑藥液，備用。

保護(hù)作用防治效果測(cè)定：將上述滅菌處理的百合鱗片分別浸入20 mL的混配劑及單劑的藥液中3 min，取出后用濾紙吸去多余藥液，待藥液稍干后放入滅菌培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿底部墊有經(jīng)滅菌水浸濕的海綿，上覆一層濾紙），中間用吸水的脫脂棉球保濕，每皿4片，在每個(gè)鱗片中間接入直徑5 mm的菌餅，每個(gè)處理重復(fù)3次，以混配劑處理后的百合鱗片為處理組，以生物農(nóng)藥單劑、百菌清和滅菌水浸泡處理的百合鱗片作為生物藥劑對(duì)照、化學(xué)藥劑對(duì)照和空白對(duì)照，然后置于氣候箱中，（25±1）℃、黑暗條件下培養(yǎng)4 d后，十字交叉法測(cè)量病斑直徑，并按下式計(jì)算防治效果。防治效果（%）＝（對(duì)照病斑直徑－處理病斑直徑）/（對(duì)照病斑直徑－菌餅直徑）×100。

治療作用防治效果測(cè)定：分別在滅菌處理的百合鱗片中間接入直徑5 mm的菌餅，然后置于氣候箱中，每皿4片，每個(gè)處理重復(fù)3次，黑暗條件下培養(yǎng)36 h，去掉菌餅，進(jìn)行藥液處理，參照上述方法設(shè)置處理組和對(duì)照組進(jìn)行治療作用測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 Excel和SPSS軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的抑菌作用

通過試驗(yàn)結(jié)果表明，幾種生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌均有不同程度的抑菌作用，且菌落直徑和抑菌率之間均存在極顯著差異。其中，香芹酚抑菌作用最好，抑菌率為97.96%，比百菌清高9.18%；多粘類芽胞桿菌抑菌作用次之，抑菌率為86.12%，比百菌清低2.66%；丁子香酚、申嗪霉素、哈茨木霉和綠色木霉抑菌率均在60%以上，其他生物農(nóng)藥的抑菌率均在50%以下（表2）。綜上，篩選出3億CFU/g哈茨木霉WP、2億CFU/克綠色木霉WP、0.1億CFU/g多粘類芽胞桿菌FG、0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、1%申嗪霉素SC 6種抑菌率在60%以上的生物農(nóng)藥供進(jìn)一步篩選。

表2 生物農(nóng)藥和百菌清對(duì)尖孢鐮孢菌的抑制作用（4 d）Table 2 Inhibition of biological Fungicides and chlorothalonil on F. oxysporum (4 d)

活性比較結(jié)果表明，6種生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌活性有一定差異（表3）。其中多粘類芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮孢菌的活性最好，EC50值為85.95 μg/mL，但比百菌清的EC50值高81.67 μg/mL，香芹酚對(duì)尖孢鐮孢菌的活性最差，EC50值為1080.69 μg/mL，其他生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的EC50介于這二者之間。

表3 生物農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的室內(nèi)毒力測(cè)定Table 3 Laboratory Toxicity Determination of Biological Fungicides to F. oxysporum

2.2 生物農(nóng)藥混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌的協(xié)同增效作用

2.2.1 幾種混配劑不同比例的毒效比率 通過混配劑毒效比率測(cè)定，結(jié)果表明不同配比下的混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌抑菌活性不同。其中多粘類芽胞桿菌與申嗪霉素在9:1和8:2、多粘類芽胞桿菌與丁子香酚在9:1、8:2、7:3、6:4、5:5和4:6、多粘類芽胞桿菌與百菌清在8:2和丁子香酚與百菌清在4:6的混配比例下，毒效比率均大于1，表現(xiàn)為增效作用，多粘類芽胞桿菌與百菌清在9:1的混配下，毒效比率等于1，表現(xiàn)為相加作用，其他混配劑在不同混配比例下，毒效比率均小于1。綜上，初步篩選出10種毒效比率大于1的增效配比，進(jìn)一步篩選出具有協(xié)同增效作用混配劑（表4）。

表4 不同混配劑的毒效比率Table 4 Toxicity ratio of different mixtures

2.2.2 幾種混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌的協(xié)同增效作用 共毒系數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，生物農(nóng)藥多粘類芽胞桿菌與丁子香酚以9:1和8:2混配和生物農(nóng)藥多粘類芽胞桿菌、丁子香酚分別與化學(xué)藥劑百菌清以8:2、4:6混配后均表現(xiàn)為增效作用，EC50值和CTC分別為26.92 μg/mL、79.26 μg/mL、347.88、129.73和4.05 μg/mL、0.95 μg/mL、440.60、641.66，這4種混配劑的EC50值均小于多粘類芽胞桿菌、丁子香酚和百菌清單劑的EC50值。表明這4種混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌的抑制活性明顯好于單劑。其他各混配劑在不同配比下表現(xiàn)為相加或拮抗作用（表5）。綜上，篩選出4種具有協(xié)同增效作用的混配劑，用于對(duì)尖孢鐮孢菌引起的百合鱗莖腐爛病的防治效果評(píng)價(jià)。

表5 混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌的協(xié)同增效作用Table 5 Synergistic effect of mixtures on F. oxysporum

2.3 混配劑對(duì)百合鱗莖腐爛病離體防效

4種混配劑對(duì)百合鱗莖腐爛病均有不同程度的防治效果，各混配劑的防效均高于61%，且混配劑的防效明顯高于單劑，生物農(nóng)藥混配劑多·?。?:1、8:2）對(duì)百合鱗莖腐爛病的保護(hù)作用和治療作用防效分別為77.33%、66.00%、70.59%、61.76%，與多粘類芽胞桿菌和丁子香酚相比防效平均分別提高了28.69%，43.82%；多·百和丁·百（8:2、4:6）對(duì)百合鱗莖腐爛病的保護(hù)作用和治療作用防效分別為82.22%、84.56%，73.53%、76.47%，與多粘類芽胞桿菌、丁子香酚和百菌清相比防效平均分別提高了38.97%，54.10%，9.82%，與多·丁（9:1和8:2）相比防效評(píng)價(jià)提高了5.24%和15.32%，混配劑與單劑防效之間存在極顯著差異；且各單劑及混配劑的保護(hù)作用均高于其治療作用（表6，圖1）。

表6 混配劑對(duì)鱗莖腐爛病的防治效果Table 6 Control effect of mixtures on bulb rot

圖1 混配劑對(duì)百合鱗莖腐爛病的防治效果Fig. 1 The control effect of mixtures on lily bulb rot

3 討論

在百合枯萎病防治中，多菌靈、代森錳鋅、百菌清、福美雙、苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)藥劑常被采用[9]，但由于化學(xué)藥劑的不科學(xué)合理使用，使得病原菌產(chǎn)生抗藥性，防效逐年降低，殘留污染嚴(yán)重，嚴(yán)重影響百合的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，篩選出防效較好的生物農(nóng)藥及其混配劑對(duì)防治百合病害，延緩病原菌抗藥性產(chǎn)生，促進(jìn)百合產(chǎn)業(yè)綠色無(wú)公害發(fā)展具有重要意義。

據(jù)報(bào)道，生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥混配施用，既能減少化學(xué)農(nóng)藥的用量，又能發(fā)揮化學(xué)農(nóng)藥防治速度快和效果穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還保持了微生物農(nóng)藥在植物根、葉周圍定殖、分泌抗生素、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等特點(diǎn)，改善植物源殺菌劑持效期短和速效性差的問題[33-35]。生防細(xì)菌NJ13與丙環(huán)唑和苯醚甲環(huán)唑、生防芽胞桿菌Bacillusspp.與甲基硫菌靈、芽胞桿菌與咪鮮胺、枯草芽胞桿菌與吡唑醚菌酯、枯草芽胞桿菌與戊唑醇、刀孢蠟蚧菌與百菌清等生物農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥混配后對(duì)人參鐮刀菌根腐病菌Fusarium solani、香蕉枯萎病菌F. oxysporumf. sp.cubense、茄腐鐮刀菌Fusarium solani、草莓枯萎病F. oxysporum均表現(xiàn)出增效作用，抑菌率達(dá)70%以上[36-39]，同時(shí)與單劑相比有的混配劑對(duì)病害的防治效果提高[40,41]；另外，擬康氏木霉與枯草芽胞桿菌和放線菌與細(xì)菌、綠色木霉與芽胞桿菌、非致病尖孢鐮孢菌 Fo47與惡臭假單胞Pseudomonas putidaWCS35等生物農(nóng)藥之間混配后可有效地防治由黃瓜枯萎病菌F. oxysporum、西瓜枯萎病菌F.oxysporumf. sp.niveum、亞麻枯萎病菌F. oxysporumf. sp.lini[42-45]等病原菌引起的枯萎病，防治效果均在71%以上。本研究也篩選出了對(duì)尖孢鐮孢菌抑菌率在69%以上且作用機(jī)理不同的香芹酚、丁子香酚、申嗪霉素、多粘類芽胞桿菌、哈茨木霉、綠色木霉6種生物農(nóng)藥，通過將6種生物農(nóng)藥之間及其與化學(xué)農(nóng)藥百菌清進(jìn)行二元混配，初步篩出10種毒效比率大于1的混配劑，通過共毒系數(shù)法進(jìn)一步進(jìn)行協(xié)同增效作用評(píng)價(jià)，獲得了具有協(xié)同增效作用的多·丁（9:1）、多·丁（8:2）、多·百（6:4）和丁·百（4:6）4種配伍性較好混配劑；這4種混配劑對(duì)尖孢鐮孢菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)由該病原菌引起的百合鱗莖腐爛病的防效均在61.76%以上，其防效均優(yōu)于生物農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥單劑的防效；而且各混配劑及單劑在發(fā)病前施藥的保護(hù)作用防治效果明顯高于發(fā)病后施藥的治療作用防治效果；這不僅對(duì)降低化學(xué)農(nóng)藥使用量、減輕污染，提高防病效果具有重要意義，而且也有利于延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生，為進(jìn)一步研究開發(fā)防治百合鱗莖腐爛病的混配劑提供理論依據(jù)；同時(shí)可指導(dǎo)抑菌率較高的、但與化學(xué)藥劑百菌清配伍性較差的生物農(nóng)藥單劑香芹酚、申嗪霉素、哈茨木霉、綠色木霉及4種混配劑在百合病害防治中的科學(xué)合理使用。

但是，本研究?jī)H對(duì)丁子香酚、多粘類芽胞桿菌與百菌清的配伍性、4種混配劑的室內(nèi)離體防效進(jìn)行了測(cè)定，而對(duì)其他生物農(nóng)藥、化學(xué)農(nóng)藥對(duì)尖孢鐮孢菌的抑菌活性及與這幾種生物農(nóng)藥以及其他化學(xué)藥劑之間的配伍性、協(xié)同增效作用，這4種混配劑對(duì)百合貯存期及種球播種前的防治效果及持效期等問題尚未涉及，還有待進(jìn)一步研究。