＊黎菲 韓柱 孟信剛

（景德鎮(zhèn)學院 生物與環(huán)境工程學院 江西 333000）

沼澤紅假單胞菌（Rhodop seudomonas palustris）以其無毒、耐受性強、易人工培養(yǎng)、蛋白質含量高、繁殖快、有機物去除率高、低成本等優(yōu)點被人們重視，而且沼澤紅假單胞菌還屬于我國農(nóng)業(yè)部允許使用的飼料級微生物之一[1-4]，因此作為餌料添加劑被廣泛的應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。然而關于沼澤紅假單胞菌在生物脫氮及污水處理方面的研究則較少[5-7]。因此，開展沼澤紅假單胞菌對氨氮去除效果影響因素探究，研究沼澤紅假單胞菌菌株對不同濃度初始氨氮含量的氨氮廢水、不同pH的氨氮廢水以及不同溫度的氨氮廢水中氨氮的降解能力，對該菌株在生物脫氮的開發(fā)上具有重要意義[8]。本文通過正交設計實驗室室內模擬實驗，控制影響沼澤紅假單胞菌氨氮降解效率的因素，判斷沼澤紅假單胞菌菌株處理含氨氮廢水的最佳條件，可為菌株投入實際污水處理應用提供數(shù)據(jù)參考。

1.實驗材料和方法

(1)實驗材料與設備

①實驗菌種：沼澤紅假單胞菌甘油管（Rhodop seudanonas palustris）菌種編號CICC23812（其他編號CGMCC1.2352），購于北京保藏生物中心。

②儀器設備：立式壓力蒸汽滅菌鍋LS-100HD、雙層大容量全溫搖床、V-5000可見分光光度計、PHS-2F pH計、SJCJ-2F超凈工作臺、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

③菌種活化培養(yǎng)：酵母提取物2.5g、蛋白胨5g、氯化鈉（NaCl）5g、蒸餾水0.5L，混勻后，調pH為7左右，121℃滅菌25min。

④模擬氨氮廢水的配制：準備提前烘干2h的氯化銨（0.0764g、0.1529g、0.2293g、0.3057g、0.3821g）、七水合硫酸鎂0.1025g、三水合乙酸鈉0.564g、磷酸氫二鉀0.09g、蒸餾水1L，通過控制加入氯化銨的量得到氨氮含量約為20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的氨氮廢水[9]。

(2)實驗方法

①菌種的活化：A.培養(yǎng)基的配制稱取酵母提取物2.5g、蛋白胨5g、氯化鈉（NaCl）5g于燒杯中，加入蒸餾水0.5L，混勻后，調pH為7左右。轉移至3個250mL的錐形瓶中，用封口膜和棉線繩包好錐形瓶，將包好的錐形瓶放入高壓滅菌鍋，121℃滅菌25min。將冷卻后的培養(yǎng)基轉移至2-8℃的冰箱中冷藏保存。B.接種按照1:100的接種比例將甘油菌接種至配置的菌種活化培養(yǎng)液中使之液體厭氧，放置于25-30℃的光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)好的菌種可以直接放在陽臺光照保存。

②廢水中氨氮含量的測定方法：均采用現(xiàn)行水質氨氮的測定——納氏試劑分光光度法（HJ 535-2009）[10]。

取8個50mL的容量瓶，按表1加入氨氮工作標準溶液，稀釋，定容至刻度線，混勻，再加入配制好的酒石酸鉀鈉溶液以及納氏試劑（碘化汞-碘化鉀-氫氧化鈉），混勻。先將分光光度計預熱20min，將配制好的容量瓶室溫靜置顯色10min，在波長420nm處，選用10mm比色皿，以蒸餾水做參比，測定吸光度。以空白矯正后的吸光度為縱坐標，其對應的氨氮含量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線。

表1 標準曲線繪制方案

③正交實驗優(yōu)化氨氮降解條件：選取三個對沼澤紅假單胞菌CICC23812降解氨氮效果可能有影響的因素：溫度、pH、初始氨氮濃度。深入研究這三個因素對該菌株降解氨氮能力的影響。實驗中的各因素選取5個實驗水平，每個實驗水平做三組平行實驗，取平均值得到實驗結果。因素水平表見表2。pH通過加入鹽酸或氫氧化鈉進行調節(jié)，利用pH計進行測定。溫度通過恒溫水浴鍋控制。

表2 因素水平表

④接種：0.5mL的菌液與9mL的模擬氨氮廢水混合加入10mL的螺口管。

⑤測定接種后混合液中氨氮含量：由于培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)液中加入了有機氮源（蛋白胨），故菌株再生長繁殖過程中會消耗有機氮源產(chǎn)生氨氮，因此需要測量菌液中的氨氮濃度，計算得到菌液與模擬氨氮廢水混合而成的混合液中的氨氮含量。使用納氏試劑分光光度法測量得到菌液中氨氮的含量為76.05mg/L。

⑥接菌后廢水的培養(yǎng)：將接種菌液后的混合液放于對應的溫度條件下，光照液體厭氧培養(yǎng)5h后測定培養(yǎng)后水樣的氨氮濃度。

⑦氨氮降解率計算公式：氨氮降解率（%）=（初始氨氮濃度-5h后的氨氮濃度）/初始氨氮濃度×100[7]。

2.結果與分析

(1)標準曲線

根據(jù)氨氮含量的測定方法：水質氨氮的測定——納氏試劑分光光度法，測得各組吸光度見表3。得到以空白矯正后的吸光度為縱坐標，其對應的氨氮含量（μg）為橫坐標的標準曲線（圖1）。趨勢線方程為y=0.004x+0.0039，R2為0.991。

表3 標準曲線吸光度

圖1 氨氮含量標準曲線

(2)正交實驗結果

實驗選取沼澤紅假單胞菌降解氨氮過程中的影響因素pH、初始氨氮濃度、溫度三因素來設計正交實驗，正交設計結果見表4。

表4 正交實驗結果

續(xù)表

由表4可知最優(yōu)組合為A5B5C5，由此確定沼澤紅假單胞菌CICC23812最優(yōu)降解氨氮條件為：pH值為9、初始氨氮濃度為103.05mg/L、溫度為45℃。此外存在9組實驗的氨氮降解率出現(xiàn)負值（分別為實驗1、2、6、7、11、12、16、17、21），基于張曉波等[11]研究者的研究結果，初步判斷可能是由于菌液培養(yǎng)時間未達到菌種說明書中推薦的5-7天，因此菌液中活菌數(shù)量較少且含有大量未被菌株利用的有機氮源（蛋白胨），由于有機氮降解時的釋氨作用，菌體對氨氮的降解效果受到明顯抑制，氨氮積累明顯，甚至出現(xiàn)處理后廢水中氨氮的濃度高于處理前的現(xiàn)象。

(3)方差分析表

由方差結果來看（表5），初始氨氮濃度對該菌株降解氨氮能力的影響是顯著的（p＜0.05），這表明相對于其他2個因素，初始氨氮濃度是影響該菌株降解氨氮能力的主要因素。

表5 方差分析表

3.結論

本文通過設計正交實驗探究沼澤紅假單胞菌菌株對氨氮的去除效果，對影響該菌株降解效果三個外部環(huán)境因素進行了初步分析。研究結果顯示，沼澤紅假單胞菌降解氨氮能力最優(yōu)的條件為：pH值為9、初始氨氮濃度為103.05mg/L、溫度為45℃。且該菌株在25-45℃，pH5.0-9.0環(huán)境條件下均能去除廢水中的氨氮。此外當體系中含有較高濃度的有機氮源時，菌體去除氨氮的能力下降，氨氮積累明顯，甚至出現(xiàn)處理后廢水中氨氮的濃度高于處理前的現(xiàn)象。并且在本次實驗中相較于溫度、pH而言初始氨氮濃度是影響該菌株降解氨氮能力的主要因素。研究結果還表明該菌株對復雜環(huán)境有較強的適應能力，對環(huán)境變化的敏感性較差，可用于復雜的污水處理方法中，也可用于處理高濃度氨氮含量的廢水，故該菌株在實際生產(chǎn)應用中的使用范圍較廣。