徐瑞波，高廣琦，白曉曄，李偉程，張和平*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特010018 3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 內(nèi)蒙古乳業(yè)生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特010018）

人體腸道是大量活細菌的天然棲息地[1]，有超過500 種細菌[2]。研究證實，腸道中生長的正常微生物是腸道的生物屏障[3]。乳酸桿菌是人類結(jié)腸中的常駐菌群，是腸道中的優(yōu)勢細菌[4]。大多數(shù)乳酸菌具有益生功能，被歸類為益生菌[5]。益生菌是一種有益于宿主的細菌，可以促進腸道菌群的生態(tài)平衡[6]，有助于增強腸道免疫功能[7]，維持腸道膽固醇平衡[7]以及減輕抗生素副作用等功效[8]。

人體攝入的益生菌通常在腸道中定植。為了檢測益生菌在腸道中的存活和定植，通常使用傳統(tǒng)識別方法和分子生物學鑒定方法。傳統(tǒng)的識別方法[9]包括形態(tài)學識別以及生理生化識別[10]。分子生物學鑒定方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和熒光原位雜交[11]。熒光原位雜交是一種非放射性的原位雜交技術(shù)，結(jié)合了熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測方法，可以快速、準確地鑒定樣品中的靶細胞。目前，熒光原位雜交技術(shù)已廣泛用于靶細菌的靶標識別[12]。通過基因組測序，菌株水平特異性探針的開發(fā)可以更準確地定性檢測宿主中的菌株，為益生菌的開發(fā)提供更多的研究證據(jù)。近年來，已開發(fā)出在側(cè)鏈上官能化而無熒光團的D-氨基酸（DAA）的類似物（熒光D-氨基酸，F(xiàn)DAA），用于細菌肽聚糖的代謝標記。此外，F(xiàn)DAA 被用于體內(nèi)微生物標記[13]，用于熒光跟蹤和評估移植微生物的生存能力。

目前，本實驗室已開發(fā)出幾種可食用的益生菌菌株，其中鼠李糖乳桿菌Probio-M9 是從健康母乳中分離得到的[14]，具有優(yōu)異的胃腸液耐受性和良好的膽汁鹽耐受性，具有作為益生菌的基本條件，可以改善腸道菌群的多樣性并增強免疫力。為了研究特定菌株在宿主腸中的定植和精確定位，使用熒光原位雜交定位鼠李糖乳桿菌Probio-M9。基于鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的整個基因組序列設(shè)計了菌株特異性探針，并對該探針進行熒光原位雜交測試，以評估和驗證該探針與鼠李糖乳桿菌雜交的特異性和有效性。此外，通過與FDAA 探針雙重測試，在攝入鼠李糖乳桿菌Probio-M9 后大鼠的腸道內(nèi)鑒定到活的鼠李糖乳桿菌Probio-M9，進而定位宿主中的益生菌。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株的培養(yǎng)

本研究中使用的細菌菌株均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供，具體信息見表1。

表1 試驗菌株信息Table 1 Information of main strains in the experiment

1.2 儀器與試劑

LSM 900 共焦顯微鏡，卡爾蔡司（上海）管理有限公司；LC-JSY-1 恒溫干式金屬浴高溫加熱振蕩器，湖南力辰儀器科技有限公司。

本研究所有菌株所用培養(yǎng)基為MRS 培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沒有羧基保護基的FDAA 購自中國多肽公司（中國杭州）；帶有羧基保護基的FDAA 探針是由 Scilight Biotechnology（中國北京）定制合成的。

1.3 大鼠

10 周大的Wastar SPF 雌性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（中國北京）。所有大鼠均在具有12 h 光照/黑暗周期的溫度控制（24℃）的動物設(shè)施中飼養(yǎng)，并接受標準飲食，可以自由享用清潔水。每天早晨更換飼料和水以保持新鮮。每組大鼠單籠飼養(yǎng)。

1.4 鼠李糖乳桿菌種水平特異性探針（Probe-16S）設(shè)計

根據(jù)現(xiàn)有的乳桿菌的基因組信息，篩選鼠李糖乳桿菌基因組的特定片段，根據(jù)鼠李糖乳桿菌的16S 序列設(shè)計了特異性探針[15]（5’-CGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACC-3’），并在5’端用6-羧基熒光素（6-FAM）熒光基團修飾。雜交優(yōu)化后，使用鼠李糖乳桿菌的15 個代表性菌株和乳桿菌相關(guān)屬的15 個代表性菌株和乳桿菌相關(guān)屬的15 個代表性菌株測試了探針16S 的特異性（表1）。

1.5 鼠李糖桿菌Probio-M9 菌株水平特異性探針（Probe-SP）設(shè)計

根據(jù)現(xiàn)有乳酸桿菌的基因組信息，首先篩選鼠李糖乳桿菌基因組的特定片段，然后將鼠李糖乳桿菌不同菌株的基因組與Probio-M9 菌株的基因組進行比較和分析，以篩選特異性基因組片段?；谠撈危O(shè)計了Probio-M9 菌株的水平特異性探針（5'-CCAACTGACGCCTTCACTTCG）。使用鼠李糖乳桿菌的15 個代表性菌株和來自乳桿菌的相關(guān)屬的15 個代表性菌株測試探針-SP 的特異性（表1）。

1.6 熒光原位雜交（FISH）方法

將要標記的細菌細胞用PBS 洗滌2 次，重懸于500 μL PBS 中，加入等體積的無水乙醇，并在-20 ℃過夜。將細菌溶液以12 000×g離心3 min，除去上清液。然后在37 ℃下用100 μL 工作液（使用Tris-HCl pH 6.5 配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的工作液）處理細胞10 min，離心去除上清液，用PBS洗滌，加入500 μL 雜交緩沖液以及5 μL 探針儲備溶液，46 ℃搖動4 h 雜交，并通過離心除去上清液。加入500 μL 的雜交緩沖液，48 ℃搖動15 min洗滌混合物，通過離心去除上清液[16-17]。

1.7 特異性Probe-SP 探針體外試驗驗證

為了測試Probe-SP 在復(fù)雜樣品中的雜交效果，將培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株與大鼠糞便混合，并分別用Probe-16S 和Probe-SP 進行FISH 測試。

1.8 特異性Probe-SP 探針體內(nèi)試驗驗證

為了測試Probe-SP 在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下能否特異性雜交到Probio-M9，將12 只Wistar 大鼠分成2 組，分為鼠李糖乳桿菌Probio-M9 組和對照組（n=6）。鼠李糖桿菌Probio-M9 組每天服用Probio-M9（4×109CFU），對照組每天服用生理鹽水。在灌胃第14 天，每組隨機選擇3 只大鼠口服FDAA。灌胃15 d 后處死大鼠，取小腸、盲腸、結(jié)腸和大鼠各部分的內(nèi)容物。使用Probe-SP 對收集的腸組織和內(nèi)容物進行FISH 試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性探針的熒光原位雜交試驗條件優(yōu)化

通過比較鼠李糖乳桿菌Probio-M9 和其它鼠李糖乳桿菌的基因組，篩選鼠李糖乳桿菌Probio-M9的特異性序列，并設(shè)計了Probe-SP。特異性探針Probe-SP 和特異性探針Probe-16S 用于與15個鼠李糖乳桿菌菌株和15 個其它乳酸桿菌菌株雜交。試驗結(jié)果表明特異性探針Probe-SP 僅與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 雜交（表1 和圖1），而探針Probe-16S 可與其它鼠李糖乳桿菌雜交。特異性探針Probe-SP 和探針Probe-16S 都不能與其它乳酸桿菌菌株雜交，證明特異性探針Probe-SP 具有特異性。

圖1 特異探針Probe-SP 對鼠李糖桿菌Probio-M9 的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.1 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP

探索了一系列條件后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)溶菌酶處理的細胞具有更好的雜交效果，最佳雜交條件為46 ℃處理4 h。

2.2 特異性Probe-SP 探針體外試驗驗證結(jié)果

在大鼠糞便中觀察到特異性的培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌Probio-M9 菌株雜交（圖2），表明Probe-SP適用于檢測和定量復(fù)雜樣品中的乳酸桿菌物種。

圖2 特異探針Probe-SP 對鼠李糖桿菌Probio-M9在大鼠糞便中的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.2 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP in rat feces

2.3 特異性Probe-SP 探針體內(nèi)試驗驗證結(jié)果

從圖3 和4 中可以看出，綠色熒光標記代表鼠李糖乳桿菌Probio-M9，紅色熒光標記代表活菌，紅色和綠色熒光標記代表鼠李糖乳桿菌M9，結(jié)果表明，該方法可以鑒別復(fù)雜樣品中的鼠李糖乳桿菌Probio-M9，為今后益生菌在腸道菌落的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

圖3 特異探針Probe-SP 和FDAA 探針對鼠李糖桿菌Probio-M9 在大鼠小腸內(nèi)容物中的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.3 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP and FDAA Probe in rat small intestine contents

圖4 特異探針Probe-SP 和FDAA 探針對鼠李糖桿菌Probio-M9 在大鼠盲腸內(nèi)容物中的熒光顯微鏡結(jié)果Fig.4 Fluorescence microscopy results of L.rhamnosus Probio-M9 by specific Probe-SP and FDAA Probe in rat cecum contents

3 結(jié)論

本研究針對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 和其它相關(guān)物種的基因組序列，分別設(shè)計了種水平特異性探針（Probe-16S）和菌株水平特異性熒光原位雜交探針（Probe-SP），并通過對15 株鼠李糖乳桿菌菌株和15 株其它益生菌進行探針特異性的驗證；同時結(jié)合熒光D-氨基酸（FDAA）代謝探針，在大鼠的腸道中檢測到鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的活細胞。本方法在在攝入鼠李糖乳桿菌Probio-M9菌株后可利用該探針檢測及定位宿主腸道內(nèi)的鼠李糖乳桿菌Probio-M9，為以后開發(fā)和利用Probio-M9 提供更多的理論依據(jù)。