楊珍珠，潘秭琪，遲 海*，陶樂仁

（1 上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院 上海200093 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 3 大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧大連116023）

益生菌是一類具有改善宿主新陳代謝，增強(qiáng)免疫力，調(diào)節(jié)腸道菌群作用的活體微生物，當(dāng)宿主攝入一定量益生菌時可以對宿主發(fā)揮有益作用[1]。由于乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）被普遍認(rèn)定為安全的微生物，同時其具有在低pH 值條件下存活、黏附能力強(qiáng)、產(chǎn)抑菌物質(zhì)等特性，因此大多數(shù)乳酸菌常被看作益生菌[2]。其中，嗜熱球菌、乳球菌、腸球菌、乳桿菌等都是當(dāng)前研究較廣、商業(yè)化集中的菌種[3-6]。

乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生許多抑菌物質(zhì)，其中由乳酸菌核糖體合成產(chǎn)生的一類抑菌肽，命名為細(xì)菌素，對其親緣較近的細(xì)菌有高效的抑制作用。也有部分細(xì)菌素具有廣譜抑菌活性，可抑制食品腐敗菌和致病菌[7]。與其它抑菌物質(zhì)不同，細(xì)菌素的抑菌作用具有特異性，對它的靶細(xì)菌具有高效的殺滅作用[8]。此外，細(xì)菌素具有熱和酸堿耐受，在體內(nèi)易降解、安全、無殘留的特點[9]。篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，分析其潛在的益生特性，對于預(yù)防和治療某些特定致病菌引起的腸道疾病具有重大的意義。

本研究以羊奶源中提取乳酸菌為指標(biāo)菌，以3 種常見的食源性致病菌【單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）】為指示菌，篩選具有抑制上述食源性致病菌活性的乳酸菌，并對其進(jìn)行分子、生化等特性分析。同時，通過模擬胃腸液的耐受性、聚集性試驗，探討羊奶源中篩選出的乳酸菌的益生特性，旨在對產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌的益生性能進(jìn)行評價，為微生態(tài)制劑開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

單增李斯特菌LFM2813、金黃色葡萄球菌LFM3263、蠟樣芽孢桿菌LFM2805、乳酸乳球菌LFM2122（Lactococcus lactisLFM2122）、大腸埃希氏菌LFM3704（Escherichia coliLFM3704），由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

鮮羊奶購于陜西渭南；腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI），美國BD 公司；MRS 培養(yǎng)基、兔血清平板，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；M17 培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，甘油、礦物油、鹽酸、多黏菌素B、牛膽鹽、氯霉素、胰蛋白酶、胃蛋白酶、乳糖，國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖，美國Invitrogen 公司；瓊脂粉、硫酸鏈霉素、氨芐青霉素、β-半乳糖苷酶試劑盒，北京索萊寶公司；呋喃妥因、萘啶酮酸，生工（上海）生物工程股份有限公司；DNA 提取試劑盒、Taq 酶，Takara 公司；API 50CH 細(xì)菌糖代謝試劑盒，法國梅里埃公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII 立式滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；MIR-153 恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋（SANYO）電機(jī)公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；水平電泳槽及成像系統(tǒng)，美國Bio-rad 公司；DK-524 水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TG16WS 高速離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；PHS-2F pH 計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；普通PCR 儀，美國thermo 公司；XY300C 電子天平，常州市幸運電子設(shè)備有限公司；QT-2 旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；Power Wave XS 酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 乳酸菌篩選 無菌條件下將25 mL 鮮羊奶溶解于225 mL 生理鹽水中，均質(zhì)后靜置30 min，進(jìn)行梯度稀釋，將100 μL 樣品涂布在預(yù)先添加多黏菌素B（0.5 g/mL）的MRS 和LM17（M17 培養(yǎng)基中加入0.5%的乳糖）培養(yǎng)基上，30 ℃無氧條件下培養(yǎng)48 h 后選取培養(yǎng)基中的單菌落接種至LM17液體培養(yǎng)基中，厭氧條件下30 ℃過夜培養(yǎng)。通過革蘭氏染色，過氧化氫酶反應(yīng)和pH 值測定對乳酸菌進(jìn)一步篩選，將篩選出的菌株劃線并在體積分?jǐn)?shù)13%甘油中保存。

1.4.2 抑菌活性測定 以3 種食源性致病菌（單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌）為指示菌株，以篩選出的乳酸菌為指標(biāo)菌，根據(jù)瓊脂擴(kuò)散法，參考遲海等[10]的方法，篩選具有抑菌活性的乳酸菌。

1.4.3 抑菌穩(wěn)定性測定 將有抑菌活性的指標(biāo)菌在30 ℃下培養(yǎng)過夜后，10 000 r/min 條件下離心30 min，收集上清液，利用0.22 μm 膜去除殘留的細(xì)菌，將上清液置于100 ℃水浴10 min，參考Chi等[11]的方法，利用96 孔板微量稀釋法，測定指標(biāo)菌的抑菌情況。

將指標(biāo)菌在30 ℃過夜培養(yǎng)后，根據(jù)瓊脂擴(kuò)散法，參考遲海等[10]的方法，判斷酶試劑（20 μg/mL的蛋白酶K 和1 mg/mL 的胰蛋白酶）對抑菌物質(zhì)活性的影響。

1.4.4 基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及菌種鑒定使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒對有抑菌活性的指標(biāo)菌的DNA 進(jìn)行提取，以提取的細(xì)菌基因組DNA 為模板，以12F：5'- AGGGTTGCGCTCGTTG-3' 和15R：5'-TACGGGAGGCAGCCAG-3' 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃、2 min；94 ℃、30 s，50 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個循環(huán)；72 ℃、5 min。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4.5 基因組重復(fù)序列PCR 基因組重復(fù)序列PCR（Repetitive extragenic palindromic PCR，rep-PCR）參考Silva 等[12]的方法，以具有抑菌活性的指標(biāo)菌的基因組學(xué)DNA 為模版，以BOX：5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′為引物，使用Taq 酶試劑，建立20 μL 擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠下電泳并在UV 燈下觀察電泳結(jié)果。

1.4.6 溶血性試驗 參照Nayak 等[13]的方法對具有抑菌活性的指標(biāo)菌進(jìn)行溶血性分析。將指標(biāo)菌在兔血清平板上劃線，以蠟樣芽孢桿菌為對照，30℃下培養(yǎng)24 h 后觀察。

1.4.7 對抗生素的耐受性測定 參考Nallala 等[14]的方法，采用瓊脂擴(kuò)散法對有抑菌活性的指標(biāo)菌的耐藥性進(jìn)行測定。

1.4.8 糖代謝能力的測定 參考遲海等[10]的方法對指標(biāo)菌的糖代謝能力進(jìn)行測定。

1.4.9 對膽鹽耐受能力的測定 將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛膽鹽（0，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%）加入BHI 液體培養(yǎng)基中后滅菌，指標(biāo)菌按4%的接種量接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，30 ℃有氧條件下過夜培養(yǎng)后測定OD600nm。參考賈麗艷等[15]的方法判斷具有抑菌活性的指標(biāo)菌的膽鹽耐受能力。

1.4.10 對模擬胃腸液耐受能力的測定 參考劉海天等[16]的方法對篩選的指標(biāo)菌進(jìn)行模擬胃腸液耐受能力的測定。將指標(biāo)菌接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜后于3 500 r/min 條件下離心15 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌兩次，徹底除去培養(yǎng)基后保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 mL pH 值為2.5，3.0，3.5 的無菌生理鹽水（含1%的胃蛋白酶）模擬人工胃液。取100 mL 0.68%的無菌KH2PO4溶液（含1%胰蛋白酶）模擬人工腸液。將制備好的細(xì)菌用人工胃腸液重懸，37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h 測其培養(yǎng)液OD600nm值。

1.4.11 抑菌性質(zhì)鑒別 用70%飽和硫酸銨沉淀對有抑菌活性的指標(biāo)菌的細(xì)菌素進(jìn)行粗提。參考Chi 等[11]的方法，用96 孔板微量稀釋法，測定細(xì)菌素粗提物對單增李斯特菌的抑菌性質(zhì)，并繪制OD600nm-t的生長曲線。

1.4.12 細(xì)菌的自聚集和共聚集性分析 參考

1.4.10 節(jié)的方法收集具有抑菌活性的指標(biāo)菌、單增李斯特菌、大腸埃希氏菌，用磷酸緩沖液（PBS，pH 6.8）重懸，使細(xì)菌濃度為108CFU/mL。參照孫群等[17]和Reuben 等[18]的方法評價具有抑菌活性的指標(biāo)菌的自聚集性和共聚集性。

1.4.13 β-半乳糖苷酶活性測定 采用β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒進(jìn)行活性測定，β-半乳糖苷酶的活力用U/104細(xì)胞表示。

1.4.14 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并通過Origin 2018 作圖。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定后所得序列在NCBI 中的BLAST 檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

乳酸菌具有革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶反應(yīng)陰性、產(chǎn)酸的特點。從羊奶中共篩選出46 株符合上述特征的乳酸菌，并將全部的乳酸菌作為指標(biāo)菌，篩選可以抑制單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的乳酸菌，發(fā)現(xiàn)3 株潛在產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌（命名為DH9003、DH9011、DH9012）可以抑制上述食源性致病菌。

2.2 乳酸菌的抑菌穩(wěn)定性測定

由于乳酸菌具有產(chǎn)有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)的特性。細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性強(qiáng)，易被蛋白酶分解的性質(zhì)，根據(jù)這一特性可對指示菌的抑菌物質(zhì)進(jìn)行驗證。表1 是在分別經(jīng)過熱和酶處理后的細(xì)菌素的抑菌穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，經(jīng)熱處理后的細(xì)菌素都保留抑菌活性。然而，蛋白酶處理后的細(xì)菌素抑菌活性喪失。這一結(jié)果驗證了篩選的3 株乳酸菌產(chǎn)的抑菌物質(zhì)具有細(xì)菌素的基本特性。

表1 不同處理后乳酸菌細(xì)菌素的抑菌穩(wěn)定性情況Table 1 Antibacterial stability of bacteriocins produced by LAB via different treatments

2.3 產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌的鑒定結(jié)果

通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)乳酸菌DH9003 為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），乳酸菌DH9011 為乳酸乳球菌（L.lactis），乳酸菌DH9012 為糞腸球菌，且上述乳酸菌鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對相似度都達(dá)到99%以上。

2.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌基因組重復(fù)序列差異分析

為了確定同一種屬的細(xì)菌基因型是否一致，本試驗通過利用特殊引物即BOX 對篩選出的乳酸菌的DNA 進(jìn)行基因組重復(fù)序列PCR 擴(kuò)增，確定其相應(yīng)的基因圖譜，以便進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。圖1為3 株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌的rep-PCR 電泳圖。結(jié)果顯示，2 株糞腸球菌PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物不同，且與乳酸乳球菌PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物存在較大差異，這說明3株乳酸菌的基因同源性較低。

圖1 3 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌rep-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of rep-PCR products of three bacteriocin producing lactic acid bacteria

2.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的抑菌性質(zhì)

圖2 分別是DH9003、DH9011、DH9012 對單增李斯特菌的抑菌生長曲線。結(jié)果顯示，3 株乳酸菌細(xì)菌素的添加量為MIC50、4MIC50時，都能對單增李斯特菌產(chǎn)生一定程度的抑制作用，然而隨著時間的延長，單增李斯特菌重新生長。這說明低質(zhì)量濃度（MIC50和4MIC50）細(xì)菌素可以阻止單增李斯特菌生長。當(dāng)乳酸菌DH9003 和DH9012 細(xì)菌素的質(zhì)量濃度達(dá)到16MIC50時單增李斯特菌不生長，這說明高質(zhì)量濃度條件下DH9003 和DH9012 產(chǎn)生的細(xì)菌素可以對單增李斯特菌完全抑制。

圖2 不同質(zhì)量濃度的3 株乳酸菌細(xì)菌素對單增李斯特菌的抑菌生長曲線Fig.2 Bacteriostatic growth curve of bacteriocin produced by three lactic acid bacteria on L.monocytogens at different mass concentrations

2.6 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的益生特性分析

3 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的糖代謝能力如表2所示。同其它乳酸菌的糖代謝能力相似，3 株乳酸菌可以代謝葡萄糖等碳水化合物。然而，DH9003 對D-木糖、山梨醇、苦杏仁苷、淀粉、D-塔格糖、葡萄糖酸鹽的代謝能力不顯著，DH9011對L-阿拉伯糖、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖苷、蜜二糖、D-塔格糖、葡萄糖酸鹽的代謝能力不顯著，DH9012 對D-木糖、α-甲基-D-甘露糖苷、苦杏仁苷、蜜二糖、海藻糖、淀粉代謝不顯著。糖代謝試驗結(jié)果表明3 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌糖代謝能力不同，同源性較低。

表2 3 株乳酸菌糖代謝能力比較Table 2 Comparisons on glucose metabolism of bacteriocin produced by three lactic acid bacteria

益生菌在腸道發(fā)揮益生作用，需經(jīng)受住胃、小腸液對它的破壞才能在腸道中存活和增殖。同時，十二指腸中的膽汁酸鹽對外源細(xì)菌有抑制作用，菌體只有具備較高的膽鹽耐受性才能保持足夠的活菌數(shù)，從而發(fā)揮益生作用[19]。由表3 可知，3株乳酸菌在膽鹽環(huán)境下都能保持大量活菌，因此認(rèn)為3 株乳酸菌均能適應(yīng)腸道膽鹽環(huán)境。另外，乳酸菌在動物胃腸道中存活和增殖的另一個瓶頸是胃液的低酸、胃蛋白酶以及腸液的胰蛋白酶對菌體的破壞作用[20]。試驗結(jié)果表明3 株乳酸菌均能保持存活，說明3 株乳酸菌可以耐受腸道和不同pH 值條件（2.5，3.0 和3.5）下的胃液環(huán)境。

表3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的益生菌特性研究Table 3 Probiotic properties of bacteriocin produced by lactic acid bacteria

自聚集與共聚集是益生菌的重要性質(zhì)，它反應(yīng)了在腸道上皮細(xì)胞上形成生物膜的能力，且益生菌和腸道病原菌的結(jié)合有助于抗菌物質(zhì)對病原菌的殺滅[21]。試驗結(jié)果表明3 株乳酸菌有較好的自聚集性，范圍集中在30%～55%。在單增李斯特菌和大腸桿菌的共聚集性試驗中，糞腸球菌DH9003和DH9012 相對較高，分別為52.6%，63.2%和68.5%，57.6%，而乳酸菌DH9011 與單增李斯特菌的共聚集性為15.6%，與大腸桿菌不聚集，說明糞腸球菌DH9003 和DH9012 可能有較好的黏附潛力。

乳糖不耐癥是由于十二指腸內(nèi)膜缺乏β-半乳糖苷酶所致，3 株產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌都具有β-半乳糖苷酶活性，這有助于緩解乳糖不耐癥的現(xiàn)象。同時這3 株乳酸菌都無溶血性（γ 溶血），對人體安全。最后，在對抗生素耐受性的測定中發(fā)現(xiàn)，3株乳酸菌都對氨芐青霉素（50 mg/mL）和硫酸鏈霉素（100 mg/mL）敏感，對氯霉素（2.5 mg/mL）、萘啶酸（10 mg/100 mL）和呋喃妥因（10 mg/100 mL）不敏感。

FAO/WHO 標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定的益生菌必須滿足3 個基本特點：耐受胃腸黏膜的選擇環(huán)境、黏附宿主的腸壁細(xì)胞、分泌物或者分解產(chǎn)物為抗菌物質(zhì)[22]。本試驗中從羊奶中分離的3 株乳酸菌產(chǎn)生可以抑制常見的食源性致病菌的細(xì)菌素，對胃腸道環(huán)境耐受，具有良好的黏附能力。同時，這3 株乳酸菌安全（無溶血性）、可控（無耐藥性），具備益生菌的潛在特質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究通過對羊奶中提取的46 株乳酸菌進(jìn)行抑菌試驗分析，獲得3 株可以同時抑制單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌的乳酸菌。經(jīng)過16S rDNA 分子鑒定，這3 株乳酸菌分別鑒定為糞腸球菌（DH9003 和DH9012）和乳酸乳球菌（DH9011）。rep-PCR 和糖代謝能力分析結(jié)果表明，3 株乳酸菌在基因型和表現(xiàn)型上存在一定差異。此外，這3 株乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素在低質(zhì)量濃度（MIC50、4MIC50）條件下可以阻止單增李斯特菌生長，且DH9003 和DH9012 產(chǎn)生的細(xì)菌素在高質(zhì)量濃度條件下（16MIC50）對單增李斯特菌有完全抑制作用。重要的是，這3 株細(xì)菌素乳酸菌具有安全（無溶血性）、可控【對氨芐青霉素（50 mg/mL）和硫酸鏈霉素（100 mg/mL）敏感】的特點。同時，3株乳酸菌能適應(yīng)膽鹽、模擬腸道和不同胃液條件（pH 分別為2.5，3.0，3.5）的環(huán)境，具有較好的自聚集性，自聚范圍集中在30%～55%，DH9003 和DH9012 與單增李斯特菌和大腸埃希氏菌有較好的共聚集性，范圍集中在50%～70%，而DH9011與單增李斯特菌共聚集性差（15.6%），與大腸埃希氏菌不聚集。最后，3 株乳酸菌還具有較高的β-半乳糖苷酶活力。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 株乳酸菌具有較強(qiáng)抑菌能力，且具備良好的模擬胃腸液耐受性和黏附腸道的能力，符合益生菌的潛在特征，為進(jìn)一步開發(fā)益生菌資源和后期益生菌的體內(nèi)試驗提供了理論基礎(chǔ)。