劉凱龍，康小紅，張 哲，郭 帥，王記成*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司 呼和浩特011500 3 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心 北京100015）

干酪乳桿副菌（Lactobacillus paracasei，L.paracasei）是一種革蘭氏陽(yáng)性同型發(fā)酵乳酸菌，是乳桿菌屬的重要成員，廣泛存在于人體腸道、傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和泡菜等環(huán)境中[1]。有研究表明，優(yōu)良的干酪乳桿副菌具有較好的抗胃腸道消化能力等益生特性且對(duì)宿主安全[2]。其代謝物如有機(jī)酸和細(xì)菌素等可抑制病原菌生長(zhǎng)[3-6]。通過(guò)胞外酶作用分解蛋白產(chǎn)生的小肽分子具有降血壓、抗腫瘤和抗氧化等功能[7]，在健康和功能性食品中得到廣泛應(yīng)用[8]。

益生菌制劑在腸道疾病治療中的作用得到大量臨床研究證實(shí)，然而，其安全性問(wèn)題也日漸凸顯[9-12]。益生菌對(duì)腸道細(xì)胞具有較好黏附作用，可導(dǎo)致細(xì)菌易位概率增加；免疫刺激和調(diào)節(jié)作用可能引起免疫系統(tǒng)改變[13]；抗生素藥物濫用已成衛(wèi)生安全隱患，益生菌與病原菌之間耐藥基因交換能導(dǎo)致菌株攜帶抗藥性基因[14]。2002年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）的報(bào)告指出，一般認(rèn)為乳酸菌是安全的，然而，在理論上可能存在一些毒副作用，因此需要對(duì)抗生素敏感性和毒性進(jìn)行安全性評(píng)估。

目前，有許多可供參考的益生菌株體外篩選方法[15-18]。本研究以分離自西藏拉薩地區(qū)當(dāng)雄縣龍仁鄉(xiāng)酸牦牛奶的副干酪乳桿菌PC-01 為對(duì)象，結(jié)合人工胃腸液耐受性、膽鹽耐受性以及安全性進(jìn)行綜合評(píng)估，為其實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源 副干酪乳桿PC-01，（保藏號(hào)CGMCC No.17537）中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。對(duì)照菌株：副干酪乳桿菌LC-01，科漢森（中國(guó)）有限公司。

1.1.2 儀器與試劑 MRS 培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；牛膽鹽，北京奧博生物技術(shù)公司；抗生素檢測(cè)試劑條，法國(guó)生物梅里埃。

電熱恒溫水浴鍋，天津知署科技有限公司；立式低速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 副干酪乳桿菌PC-01 潛在益生特性研究

1.2.1.1 菌株活化 將冷凍保存的副干酪乳桿菌PC-01 于37℃培養(yǎng)活化傳代2～3 次，4℃保存，待用。

1.2.1.2 人工模擬胃腸液的配制

1）人工模擬胃液 NaCl 0.2 g/100 mL、胃蛋白酶（Pepsin）0.35 g/100 mL，用1 mol/L HCl 調(diào)整pH 值為2.50，過(guò)濾除菌備用。

2）人工模擬腸液 胰腺液配制方式：重碳酸鈉1.1 g/100 mL，NaCl 0.2 g/100 mL，胰蛋白酶0.1 g/100 mL，調(diào)整pH 值為8.0，過(guò)濾除菌備用。膽汁液配制方式如下所示：牛膽鹽1.8 g/100 mL，調(diào)整pH 值為8.0，過(guò)濾除菌備用[19]。將上述胰腺液和膽汁液以體積比2∶1 混合即為人工腸液。

1.2.1.3 模擬胃腸液耐受性測(cè)定 參考Bao 等[20]的方法，將培養(yǎng)活化至2 代的菌株離心（2 000×g、10 min），棄上清液，加5 mL 滅菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.2）混勻制成菌懸液。取1 mL 菌懸液于9 mL 人工模擬胃液（pH 2.5）中，混勻后于37 ℃下培養(yǎng)，分別在0 h 和3 h 取樣，測(cè)定活菌數(shù)。3 h 后無(wú)菌條件下取1 mL 到模擬腸液中37 ℃培養(yǎng)計(jì)為腸液0 h，在腸液中培養(yǎng)8 h（總11 h）后取樣測(cè)定活菌數(shù)，并按下式計(jì)算存活率：

式中，N0——0 h 的活菌數(shù)，CFU/mL；N1——模擬胃液處理3 h（腸液0 h）的活菌數(shù)，CFU/mL；N2——模擬腸液處理8 h（總11 h）后的活菌數(shù)，

CFU/mL。

1.2.1.4 膽鹽耐受能力的測(cè)定 將活化好的菌種按1%的接種量接種于含膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中添加0.2 g/100 mL 巰基乙酸鈉，0.3 g/100 mL 牛膽鹽）和不含膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h 取樣并測(cè)定其在波長(zhǎng)620 nm下的OD 值，直到其OD620nm值增加0.3 個(gè)單位以上停止培養(yǎng)[21]，計(jì)算菌株在含膽鹽和不膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中OD620nm值增加0.3 個(gè)單位的時(shí)間差，即為延遲時(shí)間（Later time，LT）[22]。

1.2.2 副干酪乳桿菌PC-01 安全性評(píng)價(jià)

1.2.2.1 溶血試驗(yàn) 將活化后的副干酪乳桿菌PC-01 接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，將菌懸液點(diǎn)種于血平板上（3 個(gè)重復(fù)），于37 ℃培養(yǎng)72 h，以金黃色葡萄球菌和英諾克李斯特菌分別為陽(yáng)性、陰性對(duì)照菌株，觀(guān)察是否有溶血現(xiàn)象。如不出現(xiàn)溶血圈，說(shuō)明該菌株能夠作為潛在益生菌，反之剔除。具體參照GB 4789.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) β 型溶血性鏈球菌檢驗(yàn)》檢測(cè)方法。

1.2.2.2 藥物敏感性檢測(cè) 依據(jù)CLSI M45-2016《苛養(yǎng)菌少見(jiàn)菌藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)》 對(duì)氨芐西林（AMP）、克林霉素（CM）、利奈唑氨（LZ）、美羅培南（MP）、亞胺培南（IP）、紅霉素（EM）、達(dá)托霉素（DPC），萬(wàn)古霉素（VA）8 種抗菌藥物的最小抑制濃度進(jìn)行測(cè)定[23]，以MRS 培養(yǎng)液為稀釋液，采用試管兩倍稀釋法對(duì)藥物做不同濃度稀釋?zhuān)?7 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀(guān)察菌株生長(zhǎng)情況，其耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)參考《苛養(yǎng)菌少見(jiàn)菌藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)》判斷。

1.2.2.3 生物胺的測(cè)定 菌種產(chǎn)生的生物胺是由于細(xì)菌底物特異性酶使氨基酸脫羧形成的。取副干酪乳桿菌PC-01 發(fā)酵液5 mL 離心（6 000×g、5 min），取濕菌體加入體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸沸水浴提取1 h，取上清液衍生，生物胺的定量分析采用高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定，具體的參照GB 5009.208-2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》（第一法），其樣品檢出限為：腐胺、組胺、酪胺1.25 mg/kg，尸胺0.75 mg/kg。

1.2.2.4 致病性評(píng)價(jià) 依據(jù) 《食品用菌種致病性評(píng)價(jià)程序（征求意見(jiàn)稿）》對(duì)副干酪乳桿菌PC-01進(jìn)行致病菌評(píng)價(jià)。具體如下：受試小鼠80 只雌雄各半，隨機(jī)分成4 組（每組10 只），包括培養(yǎng)基原液對(duì)照、培養(yǎng)物原液、培養(yǎng)基濃縮液對(duì)照以及培養(yǎng)物濃縮液，每只小鼠體內(nèi)注射20.0 mL/kg BW 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物，觀(guān)察副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物分別對(duì)雌雄小鼠體質(zhì)量以及毒副作用的影響，具體評(píng)價(jià)參照保健食品用菌種致病性評(píng)價(jià)程序附錄A。

1.3 數(shù)據(jù)處理

人工胃腸液、膽鹽各試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22.0 軟件，顯著性水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 副干酪乳桿菌PC-01 對(duì)人工胃腸液的耐受性

副干酪乳桿菌PC-01 經(jīng)人工胃液消化3 h后，隨即轉(zhuǎn)入pH 值為8.0 的人工腸液，消化8 h后活菌數(shù)變化如表1所示。在pH 2.5 的人工胃液中培養(yǎng)3 h 后，其存活率為87.27%，高于對(duì)照組副干酪乳桿菌LC-01（82.39%）。轉(zhuǎn)入pH 8.0 人工腸液消化8 h 后存活率為88.60%，顯著高于對(duì)照菌株LC-01（73.22%），表明副干酪乳桿菌PC-01 有較好人工胃腸液耐受能力。

表1 供試菌株在pH2.5/8.0 人工胃腸液消化后活菌數(shù)及存活率情況（n=3，±s）Table 1 Viable count and survival rate of tested strains after digestion with artificial gastrointestinal fluid at pH 2.5 / 8.0（n=3，±s）

表1 供試菌株在pH2.5/8.0 人工胃腸液消化后活菌數(shù)及存活率情況（n=3，±s）Table 1 Viable count and survival rate of tested strains after digestion with artificial gastrointestinal fluid at pH 2.5 / 8.0（n=3，±s）

注：不同字母表示同一列顯著性差異（P＜0.05），下同。

菌株人工胃液（pH 2.5）人工腸液（pH 8.0）0 h×108/CFU·mL-1 3 h（腸液0 h）×108/CFU·mL-1存活率/%8 h×108/CFU·mL-1存活率/%LC-01（對(duì)照菌株）9.20±0.07a7.58±0.03a82.395.55±0.04a73.22 PC-018.01±0.14b6.99±0.08d87.276.19±0.04c88.60

2.2 副干酪乳桿菌PC-01 對(duì)膽鹽的耐受性

由表2 可知，當(dāng)副干酪乳桿菌PC-01 在不含膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，OD620nm值增加0.3 個(gè)單位所需時(shí)間為2.17 h；在含有膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，OD620nm值增加0.3 個(gè)單位所需時(shí)間為2.51 h，延遲時(shí)間為0.34 h。與對(duì)照組LC-01（0.61±0.01）h 相比，副干酪乳桿菌PC-01（0.34±0.07）h 具有更高的耐受性（P＜0.05），說(shuō)明副干酪乳桿菌PC-01 具有在腸道內(nèi)存活繼而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的潛力。

表2 供試菌株對(duì)膽鹽耐受性結(jié)果（n=3，±s）Table 2 Results of bile salt tolerance on tested strains（n=3，±s）

表2 供試菌株對(duì)膽鹽耐受性結(jié)果（n=3，±s）Table 2 Results of bile salt tolerance on tested strains（n=3，±s）

菌株A620nm 增0.3 個(gè)單位所需時(shí)間/h MRS-巰基乙酸鈉MRS-巰基乙酸鈉+牛膽鹽LT LC-01（對(duì)照菌株）3.48±0.03a4.09±0.06a0.61±0.01a PC-012.17±0.07d2.51±0.08d0.34±0.07b

2.3 副干酪乳桿菌PC-01 安全性評(píng)價(jià)

2.3.1 溶血試驗(yàn)結(jié)果 本試驗(yàn)經(jīng)穿刺接種血平板后，副干酪乳桿菌PC-01 在穿刺內(nèi)核穿刺處的周?chē)闯霈F(xiàn)透明圈，如圖1所示。副干酪乳桿菌PC-01 與陰性對(duì)照菌CICC10417 英諾克李斯特菌溶血效果相似，與陽(yáng)性對(duì)照菌CICC10473 金黃色葡萄球菌有顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，副干酪乳桿菌PC-01 沒(méi)有引起溶血現(xiàn)象且呈陰性。

圖1 副干酪乳桿菌PC-01 溶血情況Fig.1 Hemolysis of Lactobacillus paracasei PC-01

2.3.2 藥物敏感性及生物胺檢測(cè)結(jié)果 由表3 可知，副干酪乳桿菌PC-01 對(duì)氨芐西林、利奈唑氨、美羅培南、亞胺培南、紅霉素達(dá)托霉素6 種抗生素敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素和克林霉素有耐受性。此外本試驗(yàn)研究了副干酪乳桿菌PC-01 對(duì)生成生物胺所涉及氨基酸的脫羧能力進(jìn)行測(cè)定。在食品中，低含量的生物胺可認(rèn)為是安全的，然而攝入過(guò)量時(shí)可能會(huì)引起獨(dú)特的藥理、生理和毒性效應(yīng)[23]。本研究經(jīng)HPLC 分析，未檢測(cè)到腐胺、組胺、酪胺以及尸胺。表明副干酪乳桿菌PC-01 是安全性菌株，可應(yīng)用于食品行業(yè)。

表3 副干酪乳桿菌PC-01 的MIC 值及藥敏性結(jié)果Table 3 MIC values and drug sensitivity results of Lactobacillus paracasei PC-01

2.3.3 致病性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.3.1 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物的活菌數(shù)副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物活菌計(jì)數(shù)結(jié)果如表4所示。培養(yǎng)物中含有副干酪乳桿菌PC-01 的數(shù)量為5.2×107CFU/mL。

表4 副干酪乳桿菌PC-01 計(jì)數(shù)結(jié)果（CFU/mL，n=3，±s）Table 4 Count results of Lactobacillus paracasei PC-01（CFU/mL，n=3，±s）

表4 副干酪乳桿菌PC-01 計(jì)數(shù)結(jié)果（CFU/mL，n=3，±s）Table 4 Count results of Lactobacillus paracasei PC-01（CFU/mL，n=3，±s）

注：表中1，2，3 代表三次平行測(cè)定；本試驗(yàn)的接種量為0.1 mL。

稀釋度123平均數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果×107 10-554475652.3±4.75.2±0.16 10-65555.0±0.0

2.3.3.2 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物通過(guò)腹腔注射途徑干擾實(shí)驗(yàn)小鼠，結(jié)果如表5 和6所示。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠初始體質(zhì)量及終體質(zhì)量在培養(yǎng)物組和其它組間組比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05），未觀(guān)察到實(shí)驗(yàn)小鼠明顯的活動(dòng)或行為變化、疾病或死亡，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物對(duì)小鼠的體質(zhì)量無(wú)影響，該菌株對(duì)動(dòng)物的健康狀況、生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有明顯的口服毒性影響，與小鼠無(wú)臨床癥狀一致。

表5 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物對(duì)雄性小鼠體質(zhì)量的影響Table 5 Effects of Lactobacillus paracasei PC-01 culture on body weight of male mice

表6 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物對(duì)雌性小鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果Table 6 Effects of Lactobacillus paracasei PC-01 culture on body weight of female mice

2.3.3.3 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物對(duì)小鼠急性毒性作用 以20.0 mL/kg BW 的劑量給小鼠連續(xù)灌胃副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物原液和5 倍濃縮液3 d，觀(guān)察7 d，具體結(jié)果如表7所示。小鼠在灌胃培養(yǎng)物原液、5 倍濃縮液后，受試小鼠體征、行為未有發(fā)生疾病、中毒或死亡急等現(xiàn)象，證明該菌株是安全的。

表7 副干酪乳桿菌PC-01 培養(yǎng)物對(duì)小鼠急性毒性作用Table 7 Acute toxicity of Lactobacillus paracasei PC-01 culture in mice

3 結(jié)論

分離自西藏拉薩地區(qū)當(dāng)雄縣龍仁鄉(xiāng)酸牦牛奶的副干酪乳桿菌PC-01 可在pH 2.5 條件下生長(zhǎng)，具有一定的耐酸性，經(jīng)pH 8.0 的人工腸液液消化8 h 后，其存活率仍可達(dá)88.6%，能較好耐受人工胃腸液并且具有較高的膽鹽耐受性，表明副干酪乳桿菌PC-01 是一株具有潛在益生特性的乳酸菌。此外，副干酪乳桿菌PC-01 對(duì)萬(wàn)古霉素和克林霉素耐藥，溶血試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)顯示該菌株具有安全性。綜上，副干酪乳桿菌PC-01 具有良好的益生特性和使用安全性。