張海粟,王家林

(青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東青島266042)

納豆,在日本有著悠久的歷史,是一種由納豆菌發(fā)酵而成的發(fā)酵食品。發(fā)酵后的納豆具有特殊的氨味,且富含異黃酮、維生素、納豆激酶等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。納豆中所含的納豆激酶是一種絲氨酸蛋白酶,可以高效地溶解血栓,相比于臨床溶栓藥物,納豆激酶具有食用安全、生產(chǎn)低成本、普遍適應(yīng)性強(qiáng)、沒(méi)有毒副作用、口服方便等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。納豆激酶作為一種新型的溶栓藥物受到越來(lái)越多的人關(guān)注,具有廣闊的研究前景[4-5]。

箭筈豌豆的礦物質(zhì)組成和粗蛋白含量與鷹嘴豆和小扁豆類似,且富含多酚類物質(zhì)、碳水化合物、β-胡蘿卜素和蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)元素[6]。研究發(fā)現(xiàn),箭筈豌豆提取物內(nèi)的抗氧化活性高于大豆提取物,且比大豆具有更高的抗氧化和清除自由基等能力[7]。此外,箭筈豌豆提取物與大豆相比具有更高的抗菌活性[8]。本研究以箭筈豌豆為原料,對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),改善納豆的風(fēng)味。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料

箭筈豌豆,青島科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供;瓊脂粉,牛肉膏,蛋白胨,酵母浸粉均為生化試劑;其他藥品均為分析純。納豆芽孢桿菌:青島科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

液體培養(yǎng)基:0.5 g酵母浸粉,1 g蛋白胨,1 g氯化鈉,100 mL蒸餾水,混勻,高壓蒸汽滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株接種到液體培養(yǎng)基中活化。取一定量活化后的納豆菌液,每隔2 h于分光光度計(jì)上測(cè)660 nm 處的數(shù)值。以測(cè)得的吸光度數(shù)值為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線[9]。

1.2.2 箭筈豌豆納豆制備工藝流程

稱取10 g表面圓潤(rùn),無(wú)蟲(chóng)咬的箭筈豌豆,用水淘洗至水清為止,加入蒸餾水沒(méi)過(guò)箭筈豌豆浸泡過(guò)夜。將浸泡過(guò)的箭筈豌豆多余水分倒掉,同時(shí)留適量水分,放入滅菌鍋121 ℃內(nèi)蒸煮20 min。煮熟的豆子先冷卻至30℃左右,接種提前活化的納豆芽孢桿菌,充分?jǐn)嚢?使豌豆豆面都沾滿菌液。將豆子放入恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h后,置于冰箱4 ℃后熟1 d,可得到成品納豆[10]。

1.2.3 納豆激酶活性的測(cè)定

通過(guò)硫酸銨鹽析法對(duì)納豆進(jìn)行處理,所得樣品即為后續(xù)試驗(yàn)所用的納豆激酶粗酶液。

本實(shí)驗(yàn)采用Folin-酚法測(cè)定納豆激酶[11-12]。

1)制作酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按照表1配置溶液,空白組為0號(hào)管?；靹蚝?37 ℃恒溫水浴15 min。將各管的吸光度在680 nm下測(cè)出,以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。每組平行測(cè)定3次。

表1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的實(shí)驗(yàn)溶液配置表Table 1 Table of experimental solution configuration to make the tyrosine standard curve

2)納豆激酶酶活測(cè)定

將1 g酪蛋白溶于100.0 mL蒸餾水中混勻,提前放入37 ℃的熱水中進(jìn)行預(yù)熱。在試管中加入待測(cè)酶液1.0 mL,在37 ℃溫水中進(jìn)行水浴5 min。向空白管內(nèi)加入3.0 mL的10%三氯乙酸溶液并搖勻,實(shí)驗(yàn)管加入1.0 mL的酪蛋白溶液,同時(shí)置于37℃中水浴15 min。將3.0 mL 10%三氯乙酸溶液加入實(shí)驗(yàn)管,1.0 mL酪蛋白溶液加入空白管中,快速震蕩使酶的作用停止。靜置15 min后離心5 min。取上清液1.0 mL,加入5.0 mL 0.5 mol·L－1Na2CO3溶液和1.0 mL Folin-酚試劑,在37℃水浴中保溫15 min。測(cè)吸光度以空白管調(diào)零,在680 nm處測(cè)得OD 值。計(jì)算納豆激酶酶活。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

使用控制變量法分別對(duì)浸泡時(shí)間、蒸煮時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間5個(gè)影響納豆發(fā)酵的因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素取5個(gè)水平,以得出每個(gè)因素變化對(duì)納豆發(fā)酵和感官影響的程度大小以及方向。控制其它影響因素相同,分別只改變浸泡時(shí)間(8,12,16,20,24 h)、蒸煮時(shí)間(15,20,25,30,35 min)、接種量(1%,2%,3%,4%,5%)、發(fā)酵溫度(31,34,37,40,43 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(12,18,24,30,36 h),按照1.2.2進(jìn)行箭筈豌豆納豆發(fā)酵,計(jì)算所得納豆激酶酶活。酶活分?jǐn)?shù)為納豆激酶酶活與最高納豆激酶酶活的比值乘50。

1.2.5 感官評(píng)定

選取10名同學(xué)組成評(píng)價(jià)小組,對(duì)箭筈豌豆納豆成品進(jìn)行打分,以口感、顏色、拉絲效果和氣味為指標(biāo),滿分為50分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。箭筈豌豆納豆綜合評(píng)分為酶活分?jǐn)?shù)與感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)相加之和。

表2 納豆感官評(píng)價(jià)Table 2 Natto sensory evaluation

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出3 種影響較大的因素:接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)作為條件,選擇其中影響綜合分?jǐn)?shù)最大的3個(gè)水平,接種量分別為2%、3%、4%,發(fā)酵溫度分別為34、37、40℃,發(fā)酵時(shí)間18、24、30 h進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn),分17次實(shí)驗(yàn)。利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),按照Box-Behnken原理進(jìn)行,制作響應(yīng)面圖,具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 3 Design table of response surface experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪制相關(guān)圖,利用Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)優(yōu)化處理,每組實(shí)驗(yàn)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

將測(cè)得的660 nm 處的吸光度值與時(shí)間繪制生長(zhǎng)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。

納豆芽孢桿菌的生長(zhǎng)分為4個(gè)時(shí)期,分別為:遲緩期,對(duì)數(shù)期,平穩(wěn)期和衰亡期。觀察圖1可知,0～10 h時(shí),該菌株處于遲緩期,生長(zhǎng)比較緩慢;10～24 h時(shí),菌株能夠利用營(yíng)養(yǎng)繁殖迅速,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在此時(shí)期OD 值增長(zhǎng)較快;24～28 h時(shí),為菌株平穩(wěn)期;28 h之后,菌株進(jìn)入衰亡期。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇20 h種齡的菌株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。

圖1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)測(cè)得數(shù)據(jù),以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo),680 nm 處的吸光度為縱坐標(biāo),繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖2。

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Tryosine standard curve

在一定條件下蛋白酶可將酪蛋白水解成一種化合物,即含酚基的氨基酸。而Folin-酚試劑在堿性條件下可與含酚基的氨基酸發(fā)生反應(yīng)生成一種藍(lán)色的化合物,可在分光光度計(jì)下測(cè)得吸光度值,根據(jù)吸光度值大小可進(jìn)一步判斷出酶活大小[13]。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出當(dāng)吸光度值為1時(shí)溶液中酪氨酸的含量,即定為吸光度常數(shù)K值。由圖2可知,K值為119.64。蛋白酶活力X按照公式(1)計(jì)算:

其中,A為樣品吸光度,A0為空白吸光度,t為反應(yīng)時(shí)間,W為酶液體積,K為吸光度常數(shù),V為反應(yīng)總體積,N為稀釋倍數(shù)。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 浸泡時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖3為不同浸泡時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。從圖3可知,隨著浸泡時(shí)間增加,酶活隨之增加,當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到20 h時(shí),酶活力達(dá)到最大,20～24 h時(shí),酶活力呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)分別為26.4、31.2、36.5、40.3、35.5分,在20 h達(dá)到最高。固體發(fā)酵時(shí)水分是主要影響因素之一,發(fā)酵前浸泡有助于改變初始含水量。隨著浸泡時(shí)間增加,豆子體積變大,有利于納豆芽孢桿菌進(jìn)入繁殖發(fā)酵,發(fā)酵效果越好,酶活力增加;當(dāng)浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致豆子含水量過(guò)多,不利于納豆芽孢桿菌利用氧生長(zhǎng),進(jìn)而影響到納豆激酶的產(chǎn)量[14]。計(jì)算得綜合分?jǐn)?shù)在20 h最高,因此選擇20 h作為最佳浸泡時(shí)間。

圖3 不同浸泡時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different soaking time on product quality

2.3.2 蒸煮時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖4為不同蒸煮時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。從圖4可知,隨著蒸煮時(shí)間增加,納豆激酶的活力增加,在30 min時(shí)酶活力達(dá)到最大;感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)分別為31.5、40.0、41.9、39.1、34.2 分。蒸煮時(shí)間的長(zhǎng)短影響納豆的口感,對(duì)結(jié)果有一定影響。隨著蒸煮時(shí)間增加,豆子逐漸變軟,有利于納豆菌的生長(zhǎng)繁殖及對(duì)營(yíng)養(yǎng)充分利用;蒸煮時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能對(duì)豆子內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成破壞,不利于納豆菌利用發(fā)酵,使得納豆激酶含量降低[15]。計(jì)算可知,綜合分?jǐn)?shù)在25 min最高。因此,選擇25 min作為最佳蒸煮時(shí)間。

圖4 不同蒸煮時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different cooking time on product quality

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖5為不同發(fā)酵溫度對(duì)納豆產(chǎn)品品質(zhì)的影響。從圖5可知,隨著發(fā)酵溫度的增加,納豆激酶活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。納豆激酶活力在37 ℃時(shí)達(dá)到最大,感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)分別為23.1、32.9、40.1、38.2、33.8分。在適宜的溫度時(shí),納豆菌生長(zhǎng)繁殖快,能夠充分利用營(yíng)養(yǎng);而溫度過(guò)高時(shí),影響了納豆菌的生長(zhǎng)及代謝。同時(shí),溫度對(duì)于酶活具有一定影響。一般來(lái)說(shuō),溫度越高,酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可能被破壞,越容易導(dǎo)致酶活降低[16]。計(jì)算可知,綜合分?jǐn)?shù)在37 ℃達(dá)到最高。因此,37 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

圖5 不同發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different fermentation temperatures on product quality

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖6為不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆產(chǎn)品品質(zhì)的影響。從圖6可知,發(fā)酵時(shí)間在12～30 h時(shí),酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸增加;發(fā)酵時(shí)間超過(guò)30 h,酶活力下降。因此,酶活力在30 h時(shí)達(dá)到最大,感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)分別為24.7、35.3、43.5、31.1、24.2 分。發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)菌株的繁殖及成品納豆的性質(zhì)都會(huì)有一定影響。發(fā)酵初期,納豆菌代謝加快產(chǎn)物積累,納豆激酶酶活較高;隨著發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),豆子內(nèi)剩余的營(yíng)養(yǎng)減少,納豆菌代謝下降,而代謝廢物逐漸積累,加上環(huán)境的影響,酶活力逐漸降低[17]。計(jì)算可知,綜合分?jǐn)?shù)在24 h達(dá)到最高。因此,24 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different fermentation time on product quality

2.3.5 接種量對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖7為不同接種量對(duì)納豆產(chǎn)品品質(zhì)的影響。從圖7可知,在1%～2%接種量時(shí),隨著接種量的增加,酶活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì);當(dāng)接種量超過(guò)2%時(shí),酶活力開(kāi)始下降,感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)分別為23.5、27.6、40.1、35.8、24.4分。接種量的多少意味著發(fā)酵初始菌株量的多少,對(duì)成品納豆性質(zhì)非常重要。在一定范圍內(nèi)增大接種量,使得初始活菌數(shù)高,產(chǎn)酶量上升;而接種量過(guò)大,納豆菌之間競(jìng)爭(zhēng)大,豆子內(nèi)營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快,細(xì)胞初級(jí)代謝旺盛,而細(xì)胞次級(jí)代謝受到抑制,導(dǎo)致納豆激酶的產(chǎn)量下降[18]。計(jì)算可知,綜合分?jǐn)?shù)在3%時(shí)達(dá)到最高。因此,3%接種量作為最佳接種量。

圖7 不同接種量對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響Fig.7 Effect of different inoculum amount on product quality

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3的實(shí)驗(yàn)表,選用接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度作為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,以綜合分?jǐn)?shù)做指標(biāo),設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design scheme and results of response surface experiment

根據(jù)表4數(shù)據(jù),可得到回歸方程:Y＝90.66＋0.41×A－0.28×B＋0.19×C＋0.40×A×B＋0.38×A×C－0.10×B×C－4.94×A2－2.52×B2－0.24×C2。

利用Design Expert軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5可知,模型的P值小于0.000 1是顯著的,失擬項(xiàng)為0.199 8＞0.05是不顯著,對(duì)模型是有利的。模型具有參考性。模型的R2＝0.990 1,說(shuō)明模型擬合程度較好,實(shí)驗(yàn)方法可行。從回歸方程和方差分析表可知,A、A2、B2對(duì)響應(yīng)值Y影響顯著,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)里3種條件的主次關(guān)系:接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間;兩種因素之間交互作用的影響關(guān)系:接種量和發(fā)酵溫度＞接種量和發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間。

圖8 至圖10 為各因素的響應(yīng)面圖和等高圖。由圖8、9、10可知,發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵時(shí)間和接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度之間存在一定的交互作用,該模型具有較好的擬合度,能夠反應(yīng)響應(yīng)值與條件之間的關(guān)系。接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)綜合分?jǐn)?shù)具有相關(guān)性,表現(xiàn)為曲面較陡。其中,接種量對(duì)綜合分?jǐn)?shù)的影響最大。結(jié)合等高圖曲線的疏密程度,接種量和發(fā)酵溫度的交互作用更顯著。

圖8 Y＝f(A,B)的響應(yīng)面圖和等高圖Fig.8 Response surface diagram and contour map of Y＝f(A,B)

圖9 Y＝f(A,C)的響應(yīng)面圖和等高圖Fig.9 Response surface diagram and contour map of Y＝f(A,C)

圖10 Y＝f(B,C)的響應(yīng)面圖和等高圖Fig.10 Response surface diagram and contour map of Y＝f(B,C)

根據(jù)建立的模型經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)和分析,發(fā)酵箭筈豌豆納豆的最佳條件:3.1%接種量,36.8 ℃發(fā)酵溫度,26.7 h發(fā)酵時(shí)間。在優(yōu)化條件下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,每次實(shí)驗(yàn)做3次平行。發(fā)酵完成的箭筈豌豆納豆的酶活為314.06 U·m L－1和感官評(píng)分為40.9分,與預(yù)測(cè)值接近,且顆粒飽滿,表面附有黏膜,攪拌后拉絲細(xì)長(zhǎng),口感略微有硬度,氨臭味較輕,適合食用。該模型是可行的。

3 結(jié)論

采用箭筈豌豆作為原材料發(fā)酵制作納豆,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定了影響發(fā)酵納豆的5個(gè)工藝條件:浸泡時(shí)間、蒸煮時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳工藝:接種量為3.1%,發(fā)酵溫度為36.8℃,發(fā)酵時(shí)間為26.7 h。在此條件下發(fā)酵完成的箭筈豌豆納豆的酶活為314.06 U·m L－1。成品箭筈豌豆納豆與傳統(tǒng)納豆相比,口感略硬,且氨味較輕有獨(dú)特香味。