陳肖,王立坤,劉衛(wèi)東,左志文

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,江蘇徐州221004;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬臨沂醫(yī)院,a.感控中心病區(qū);b.藥學(xué)部;c.感控管理部,山東臨沂276000)

1991年國際共識(shí)小組將膿毒癥定義為對(duì)感染的全身炎癥反應(yīng),指出膿毒癥可能是對(duì)多種感染原因的反應(yīng)[1]。2016年美國重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(SCCM)聯(lián)合歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(ESICM)共同修訂新版膿毒癥定義:因感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[2-4]。膿毒癥以感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征為主要臨床特點(diǎn)[1],具有高病發(fā)率和致死率,疾病進(jìn)展迅速,2017年膿毒癥相關(guān)死亡數(shù)占全球死亡總數(shù)的19.7%[5]。使用抗菌藥物控制感染源、機(jī)械輔助治療恢復(fù)器官功能是治療的主要環(huán)節(jié)[6]。多黏菌素B 破壞細(xì)胞外膜引起細(xì)菌死亡,CHINET 數(shù)據(jù)保持不動(dòng)桿菌屬低耐藥率[7-8]。鮑曼不動(dòng)桿菌近年在院內(nèi)暴發(fā)流行,易造成院內(nèi)危重病人等免疫力低下人群的感染,社區(qū)獲得性感染和醫(yī)療保健相關(guān)感染都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的膿毒癥,肺炎是最常見的原因,其次是腹腔內(nèi)和泌尿道感染[9-10]。

TAK-242是特異性TLR4抑制劑,下調(diào)TLR4下游信號(hào)分子的表達(dá),抑制NO,TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[11-13]。有研究證明TAK-242可以作為潛在的膿毒血癥治療藥物,并在人體中安全有效[14]。多黏菌素B是一種環(huán)形陽離子多肽,Tsuzukit等報(bào)道多黏菌素B的治療作用可能與降低TNF-α、IL-6 有關(guān),一方面是由于多黏菌素B 對(duì)LPS的中和作用;另一方面也可能與其對(duì)LPS活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路NF-κB的下調(diào)有關(guān)[15-20]。

近年來該菌在院內(nèi)廣泛流行,多黏菌素B 是治療廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的一線用藥,除了直接抗菌作用,還化學(xué)計(jì)量地與細(xì)菌脂多糖的脂質(zhì)A部分結(jié)合,也可通過囊泡接觸途徑,使得細(xì)胞內(nèi)外膜之間的成分交叉,導(dǎo)致細(xì)菌膨脹、溶解[21-23]。Toll樣受體(TLRs)是微生物組分的重要模式識(shí)別受體[24],參與機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫,TLRs信號(hào)途徑能通過依賴和非依賴性My D88兩條傳導(dǎo)途徑激活NF-κB調(diào)控炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄,刺激大量?jī)?nèi)源性因子釋放引起細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng),膿毒癥中存在TLRs信號(hào)途徑的異?；罨痆25],說明TLRs通路在膿毒癥中參與炎癥進(jìn)程,誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子分泌[26-29]。

本研究用鮑曼不動(dòng)桿菌腹腔注射建立膿毒癥大鼠模型,以TLR4/NF-κB/IL-6 等炎癥通路為切入點(diǎn),通過多黏菌素B、TAK-242干擾LPS-TLR4結(jié)合探究多黏菌素B 和TLR4抑制劑對(duì)膿毒癥的影響及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

鮑曼不動(dòng)桿菌(ATCC19606 標(biāo)準(zhǔn)菌株),北京浦然進(jìn)出口有限公司。8 周齡SPF 級(jí)雄性Wister大鼠,體重250～280 g,許可證號(hào):SCXK(京)2019—0010,斯貝福生物技術(shù)有限公司;多黏菌素B(國藥準(zhǔn)字H31022631,每瓶50 mg),上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司;TAK-242,美國Med Chem Express公司。

Rat PCT ELISA 試劑盒、Rat CRP ELISA 試劑盒、Rat TNF-αELISA 試劑盒,武漢華美生物公司;Rat IL-6 ELISA 試劑盒,上海生工生物工程股份有限公司;RNA 提取試劑盒,上海依科賽公司;逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 試劑盒,沃卡威(北京)生物技術(shù)有限公 司;兔 抗 NF-κB P65、兔 抗 p-NF-κB P65(ser536),美 國Cell Signaling Technology 公 司;HRP標(biāo)記山羊抗鼠/兔二抗、內(nèi)參beta-actin,武漢三鷹公司;引物由上海生工生物設(shè)計(jì)合成。

細(xì)菌培養(yǎng)箱,SHZ-82 型,常州智博瑞儀器;血液分析儀,ADVIA 2120i型,德國西門子公司;酶標(biāo)儀,Thermo Multiskan FC 型,美國賽默飛世爾公司;熒光定量PCR 儀,羅氏480II型,羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;PCR 儀,依科賽IT041-0002 型,依科賽生物科技太倉有限公司;圖像拍攝儀器,SAGE CREATION mini chemi型,岑祥股份有限公司;顯微鏡和成像系統(tǒng),日本尼康公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液濃度確定和膿毒血癥模型的建立

測(cè)波長600 nm的OD 值,取4組菌液濃度分別為,5×108,1×109,1×1010,2×1010CFU·m L－1,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,每組10只,予以不同濃度的細(xì)菌溶液10 mL·kg－1腹腔注射,對(duì)照組以相同方法注射無菌生理鹽水,大鼠飼養(yǎng)環(huán)境12 h光暗交替,自由飲食飲水,觀察大鼠一周生存率及精神狀態(tài)等,選絕對(duì)致死劑量為最終濃度后,以菌懸液10 mL·kg－1腹腔注射造模。

1.2.2 分組與給藥

選定最終濃度后取50只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為以下5組,每組10只,分別為空白對(duì)照組(C組),腹腔注射無菌生理鹽水;模型對(duì)照組(M 組),腹腔注射鮑曼不動(dòng)桿菌;模型＋多黏菌素B組(PB組),注射菌液30 min后尾靜脈注射3 mg·kg－1多黏菌素B;模型＋TAK-242 組(TAK 組),注射菌液30 min后尾靜脈注射3 mg·kg－1TAK-242;模型＋多黏菌素B＋TAK-242 組(PB＋TAK 組),注射菌液30 min后尾靜脈注射多黏菌素B和TAK-242,兩藥間隔10 min。

1.2.3 一般觀察

5組大鼠按分組注射液體后0、2、4、6、8、10、12 h檢測(cè)肛溫,觀察大鼠呼吸頻率、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)和有無腹瀉等,開腹后觀察腹腔臟器等一般情況。

1.2.4 血液指標(biāo)

1)注射菌液12 h后取各組大鼠,水合氯醛過量麻醉。麻醉后暴露腹腔,用一次性采血針進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。EDTA 抗凝管采血1 mL左右進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

2)取大鼠新鮮抗凝全血,用兩倍體積的PBS稀釋全血充分混勻。吸取100μL 血液均勻涂在血平皿中,將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)皿取出進(jìn)行拍照和克隆計(jì)數(shù)。

3)留取足量血清,拿出試劑盒恢復(fù)室溫后將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣本液,37 ℃孵育1.5～2 h后棄液甩干,加入100 μL生物素標(biāo)記抗體工作液,37 ℃孵育1 h后棄液洗板,再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μL,孵育后洗板,加入90μL 底物溶液,避光顯色15～30 min,最后加入50μL 終止液,于450 nm處讀取OD 值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各孔樣品CRP、PCT、IL-6、TNF-α的濃度。

1.2.5 組織病理(HE染色)

動(dòng)物分組同上,每組隨機(jī)選3 只,取新鮮組織肺、肝、腎、脾、腸固定于4%多聚甲醛24 h以上,梯度乙醇脫水:75%乙醇4 h—85%乙醇2 h—90%乙醇2 h—95%乙醇1 h—無水乙醇I 30 min—無水乙醇Ⅱ30 min—醇苯5～10 min—二甲苯I 5～10 min—二甲苯Ⅱ5～10 min—蠟I 1 h—蠟Ⅱ1 h—蠟Ⅲ1 h。石蠟包埋后切片,片厚4μm,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,顯微鏡鏡檢。

1.2.6 用RT-PCR 檢測(cè)PBMC中TLR4受體m RNA的表達(dá)情況

動(dòng)物分組同上,每組大鼠取1 mL 新鮮抗凝全血,用等體積的PBS稀釋全血上下顛倒混勻,在離心管中加入3 mL Ficoll分離液,將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,3 000 r·min－1離心,離心25 min。離心后吸取白膜層細(xì)胞到15 mL潔凈的離心管中,10 mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞。250 g,離心10 min。重復(fù)2次棄上清,用5 mL的PBS重懸細(xì)胞,1 500 r·min－1離心10 min后,棄上清,將分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)－80℃保存。

PBMC解凍后Trizol法提RNA,按照試劑盒說明書加入反應(yīng)體系進(jìn)行操作,以β-actin為內(nèi)參,用2－△CT表示5組大鼠PBMC 中TLR-4的m RNA相對(duì)表達(dá)量,擴(kuò)增條件:95 ℃,預(yù)變性10 min,開始40個(gè)循環(huán):95 ℃20 s、58 ℃30 s、72 ℃20 s;然后95℃1 min、58℃30 s、95℃30 s終止反應(yīng)。每組樣本重復(fù)3 次,取平均值。β-actin基因引物F:5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,R:5′-AGGAAGAGGATGCGGCAGTGG-3′;TLR4 F:5′-TTGCTGCCAACATCATCCAGGAAG-3′,R:5′-CAGAGCGGCTACTCAGAAACTGC-3′。

1.2.7 用Western Blot檢測(cè)PBMC中NF-κB蛋白及s536位點(diǎn)磷酸化蛋白的表達(dá)情況

分離PBMC 同上,取50μg 組織進(jìn)行液氮研磨,加入適量裂解液和PMSF,在冰上進(jìn)行超聲破碎,4 ℃離心取上清,用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,TBST 洗滌3次,每次1 min。封閉后一抗孵育4 ℃過夜,TBST 洗滌5次,每次10 min。二抗25℃孵育1 h。TBST 洗滌5次,每次10 min。用ECL發(fā)光顯示劑曝光顯影,圖像拍攝儀器掃描分析,計(jì)算NF-κBp65和p-NF-κBp65的相對(duì)表達(dá)量,用目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS25.0 軟件分析結(jié)果,以Graph Pad Prism 8作圖,計(jì)量資料符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 濃度菌液選擇

實(shí)驗(yàn)研究2004年出現(xiàn)第一例予以小鼠腹腔注射鮑曼不動(dòng)桿菌建立膿毒血癥[30],通常研究大鼠或小鼠肺部氣管噴入107～109CFU·m L－1細(xì)菌菌液建立肺源性膿毒癥模型[31],腹腔注射大腸桿菌[32]、或臨床分離出的Ab、或靜脈內(nèi)注射[33-34],但不同細(xì)菌不同造模方法對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的絕對(duì)致死劑量不一致,不同菌株的毒力致病性也不盡相同。鮑曼不動(dòng)桿菌本身屬于條件致病菌,若機(jī)體免疫功能正常而且細(xì)菌繁殖沒有達(dá)到一定的數(shù)量級(jí),機(jī)體能識(shí)別并清除該菌,不會(huì)造成嚴(yán)重感染。

為了選擇合適的造模濃度,本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定4組鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液濃度,均予以10 mg·kg－1腹腔注射,前兩組大鼠一周內(nèi)生存數(shù)沒有變化;2×1010CFU·m L－1組大鼠注射該劑量鮑曼不動(dòng)桿菌后在24 h內(nèi)一組完全死亡,說明大劑量細(xì)菌腹腔注射造成急性感染,侵襲腹腔臟器且進(jìn)展快速;1×1010CFU·m L－1的濃度菌液使大鼠在24 h內(nèi)死亡60%,48 h內(nèi)死亡100%,提示不同個(gè)體對(duì)鮑曼菌株抵抗力有差異,后兩組病情進(jìn)展?fàn)顩r更符合膿毒癥進(jìn)展迅速、致死率高的特點(diǎn),為了利于大鼠感染后取材,最終選1×1010CFU·m L－1為造模濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 大鼠一般特征分析

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共分為5組,模型組大鼠注射鮑曼不動(dòng)桿菌6 h后出現(xiàn)呼吸急促、扎堆、精神狀態(tài)差不愿活動(dòng),個(gè)別大鼠出現(xiàn)腹瀉。大鼠肛溫檢測(cè)發(fā)現(xiàn),大鼠在注菌后2 h大部分出現(xiàn)肛溫升高,4 h和6 h肛溫持續(xù)下降,6 h后趨于穩(wěn)定。空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組6 h后肛溫差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,例如空白對(duì)照組(C組)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(M 組)比較,6、8、10、12 h,有差異(F＝10.4～13.63,P＜0.01),同一組內(nèi)4、6、8、10、12 h體溫和0 h體溫比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肛溫的比較(n＝10,±s)Fig.1 Comparison of anal temperature at different time points in each group(n＝10,±s)

2.3 各組大鼠血液指標(biāo)的比較

5組組間比較有顯著性差異(F＝267.76,P＜0.01),實(shí)驗(yàn)組和C組比較,實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌計(jì)數(shù)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),PB組、TAK組、PB＋TAK 組和M 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,PB組和TAK 組、TAK 組和PB＋TAK 組比較組間差異均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見圖2。

圖2 各組大鼠全血細(xì)菌計(jì)數(shù)的結(jié)果比較(n＝10,)Fig.2 Comparison of bacteria counts in the whole blood of rats in each group(n＝10,)

實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組比較,白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞比率(NEU%)、淋巴細(xì)胞比率(LYM%)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝29.86、29.59、24.86、141.83,P＜0.01)。PB 組、TAK 組、PB＋TAK 組與M 組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NEU%和LYM%指標(biāo)實(shí)驗(yàn)用藥3組間比較TAK組和PB＋TAK組有差異,PLT 3組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖3。

圖3 造模加藥對(duì)各組大鼠血細(xì)胞的影響(n＝10,±s)Fig.3 Effects of modeling and drug addition on blood cells in each group(n＝10,±s)

造模加藥對(duì)大鼠炎癥因子的影響(n＝10,±s)見圖4。C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)指標(biāo)5 組間比較有顯著性差異(F＝52.78、12.55、72.20、36.54,P＜0.01),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01),用藥3 組和模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01),CRP、IL-6指標(biāo)PB組和PB＋TAK 組、TAK組和PB＋TAK 組比較有差異,TNF-α指標(biāo)PB 組和PB＋TAK 組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),4個(gè)炎癥因子PB組和TAK 組間均沒有差異(P＞0.05)。

圖4 造模加藥對(duì)大鼠炎癥因子的影響(n＝10,±s)Fig.4 Effect of modeling and drug addition on inflammatory factors in rats(n＝10,±s)

以上結(jié)果顯示白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等和ELISA 檢測(cè)炎癥因子均有差異,模型組全血細(xì)菌計(jì)數(shù)達(dá)到(300.50±27.60)CFU·(100 mL)－1,空白對(duì)照組陰性,說明腹腔注射鮑曼不動(dòng)桿菌后大鼠存在菌血癥,通過腹腔造成血流感染繼而建立全身感染模型是可行的,為研究鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.4 各組大鼠組織病理學(xué)的比較

造模加藥對(duì)老鼠組織的影響見圖5。經(jīng)HE 染色可見C組肺肝腎脾腸組織結(jié)構(gòu)正常;M 組肺氣管周圍可見炎細(xì)胞浸潤,部分肺泡壁增厚,肝細(xì)胞水腫變性,腎小管變性萎縮壞死,脾臟紅髓增生;PB組可見干細(xì)胞壞死,部分腎小管變性萎縮壞死,脾臟紅髓增生;TAK組與PB＋TAK組大量腎小管細(xì)胞、脾臟細(xì)胞壞死。

圖5 造模加藥對(duì)大鼠組織的影響Fig.5 Effect of model making and drug addition on rat tissue

2.5 各組大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4/NF-κB 表達(dá)水平的比較

單因素方差分析結(jié)果顯示,5組大鼠PBMC 中TLR4 mRNA的表達(dá)水平均具有顯著性差異(F＝27.58,P＜0.01),TLR4抑制劑TAK 組的mRNA 表達(dá)水平最低;C組和其他四組間比較有差異,M 組和用藥3組間均有差異,PB組和TAK 組、TAK 組PB＋TAK 組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖6。

圖6 造模加藥對(duì)PBMC中TLR4 mRNA的影響(n＝10,±s)Fig.6 Effect of modeling and dosing on TLR4 m RNA in PBMC(n＝10,±s)

單因素方差分析結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示,5組大鼠PBMC 中NF-κBp65和s536位點(diǎn)磷酸化NFκBp65表達(dá)水平均具有顯著性差異(F＝34.32、61.59,P＜0.01),兩兩比較除PB 組和TAK 組的NF-κBp65表達(dá)沒有差異(P＞0.05),TAK 組和PB＋TAK 組的p-NF-κBp65表達(dá)沒有明顯差異(P＞0.05),其余兩兩比較NF-κBp65及s536位點(diǎn)p-NFκBp65表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖7。

圖7 各組大鼠NF-κBp65和p-NF-κBp65蛋白的相對(duì)表達(dá)量(n＝10,±s)Fig.7 Relative expression of NF-κBp65 and p-NF-κBp65 protein in rats of each group(n＝10,±s)

3 結(jié)語

通過TAK-242特異性抑制TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),探討多黏菌素B 單用和聯(lián)用對(duì)TLR4/NF-κB炎癥通路的干預(yù)機(jī)制,結(jié)果顯示單用多黏菌素B 可以通過下調(diào)TLR4 m RNA 和下游蛋白NF-κB、降低炎癥因子IL-6、TNF-α、CRP、PCT 等炎癥因子表達(dá),聯(lián)用效果優(yōu)于單用。以上結(jié)果提示TLR4/NFκB炎癥通路參與鮑曼不動(dòng)桿菌膿毒癥發(fā)病過程,多黏菌素B有效清除細(xì)菌,治療膿毒癥潛在機(jī)制是可能通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路減輕鮑曼不動(dòng)桿菌感染大鼠的炎癥,并能在膿毒癥早期減輕炎癥反應(yīng)過度激活狀態(tài),避免影響機(jī)體正常免疫功能,后續(xù)可收集臨床樣本進(jìn)一步探討臨床意義和實(shí)用價(jià)值。